【doc】人肝脏再生增强因子cDNA的克隆,表达及纯化

【doc】人肝脏再生增强因子cDNA的克隆, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达及纯化 人肝脏再生增强因子cDNA的克隆,表达及 纯化 I.2一岛J ?534?囊于鼍一.cs 【文章编号】0258879X(2000)06—053403 人肝脏再生增强因子cDNA 世敏茎生毛积芳 的克隆,表达及纯化 ? 论着? 【摘要】目的:克隆人肝脏再生增强因子(hALR)eDNA,掏建重组表达载体并对其诱导表达,纯化.方岳:提取胎儿肝组织 总RNA,利用RT—PCR技术扩增出hALRcDNA.克隆于载体pGEM-T.酶切鉴定后亚克隆至表达载体pGEX一4T一3.序证 实序列正确并转化大厨杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表选融合蛋白GST—hALR.表选产物通过各胱甘肚Sepharose4B亲和层 析纯化后进行Thrombin酶切,I帚和砖论:掏建成融合蛋白GSThALR的重组表达质粒,hALR在大肠杆菌高效表达.重 组蛋白主要以可溶形式存在于胞质中,融合蛋白的分离纯化简单易行 【美量词】匪曼生莲旦室姿哇E?Lc圳A专l隆 【中圈分类号】R392.1【文献标识码】A, Cloning,expressionandpurificationofthehumanaugmenterofliverregenera— tion(hALR)cDNA CHENShi—Min,CAIZai—Long,MAOJi—Fang(DepartmentofBiochemistry&MolecularBiology,DepartmentofBasic Medicine,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433?China) [ABSTRACT]Objective:Toclonehumanaugmenterofliverregeneration(hALR)eDNA,c onstructtherecombinantex— pressionvector,expressandpurifyitsproduct.Methods:ThehALReDNAwasobtainedbyus ingRT—PCRmethodwithto ta1RNAextractedfromthefetaIhepatictissue.ThenitwasclonedintothepGEM— Tvector,andsubclonedintoexpression vectorpGEX一4T一 3.Afterprovedtobecorrectbysequencing,recombinantexpressionplasmidpGEX一4T一 3(hALR)wastrans— formedintoE.coliBL21(DE3).ThefusionproteinGSThALRwasproducedbyIPTGinduction,isolatedbyaffinitychro matographyglutathioneSepharose4BandcleavedbyThrombin.ResultsandConclusion:Recombinantexpressionplasmid pGEX一4T一 3(hALR)isconstructed.ThehALRishighlyexpressedinE.coli.Thefusionproteinintheplas maisresoluble. Theprocedureofpurificationandcleavageoffusionproteiniseasyandsimple. 【KEYWORDSJliverregeneration;geneexpression;purification [AcadJsecMi1MedUniv.2000,21(6):534-5363 人肝脏再生增强因子(hALR)是新近克隆到的 一 种热稳定性小分子促肝细胞增殖因子,其eDNA 全长约1.4kb,位于人第16条染色体上0].基因序 列同源性分析发现hALR为酵母scERV1基因结 构和功能上的同系物.J,scERV1基因是在线粒体 生物起源和细胞周期调控中担负重要作用的双功能 基因ALR基因几乎在所有细胞和组织中都有低丰 度表达,但在精子发生和损伤肝脏的再生过程中则 出现高丰度表达0J1994年,Hagiya等首先从吉 肝脏刺激物的胞液中分离纯化并克隆到了大鼠 ALRcDNA,并通过犬的Eck痿模型即门腔静脉吻 合分流术证实了ALR的促肝细胞增殖作用.在此 基础上,我们对hALReDNA进行了克隆,表达及 纯化,试图得到具有生物活性的hALR,为临床治疗 严重肝病提供有效的药物. 1材料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1质粒,宿主酋,胎肝质粒pGEM—T,pGEX一 4T一3,大肠杆菌DH5a,BL21(DE3)购自Promega 公司;流产胎肝由长海医院妇产科提供 1.2试剂厦试剂盒1?hpDNALadder,TRI Z0L试剂,逆转录试剂盒购自GibcoBRL公司; pGEM—TVectorSystem购自Promega公司;GST GeneFusionSystem购自PharmaciaBiotech公司. 1.3引物序7'1P1:5G垒!ATGCGG ACGCAGCAGAAGCGGGACAC3:P2:5 【基童项目】国家自拣科学基金贷助项目(39600139) '作者单位】第二军医大学基础医学鄙生暂化学与分于生暂 学教研室.上j晕200433 '作者蕾介】脒世敏(1971,),女(汉族),硬士生 , 第6期.晦世敏.等.凡旰畦再生增强因子cDNA的克隆,表选丑纯化?535? GGAATTCTAGTCACAGGAGCCATCCTT CCAGCCGTCG3.引物Pl'P2分9包括BamH I,EcoRI识别位点(划线部分). I.4总RNA的提取取正常胎肝100mg,用 TRIZOL试剂抽提总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电 泳检查RNA的完整性,紫外分光光度法分析RNA 的纯度及RNA含量. 1.5逆转录反应,PCR扩增2g总RNA和0.5 /lgOligo(dT)12,18溶于12l焦碳酸二乙酯处理 的水中,70?温育10min后置于冰浴,加人10× PCR缓冲液2l,25mmol/LMgC122l,10 mmol/LdNTP混合物1l,0.1mol/LDTT2l, 短暂离心后42?温育5min.加人1lSuperScript RT(200U),42?温育50min,70?15min灭活酶 活性,最后加人1FI(2U)RNaseH,37?20rain,以 降解未逆转录的RNA.取上述制备的逆转录反应液 2l,用本文设计的引物进行PCR扩增:94?45s, 56?1rain,72?1rain,共35个循环最后一次循 环72?延伸10rain. 1.6PCR产物的克隆瘦重组转化子的鉴定PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳,割胶,纯化,按pGEMT VectorSystem试剂盒说明进行连接,连接液转化 感受态大肠杆菌DH5a,采用蓝白斑筛选,限制性内 切酶分析鉴定重组转化子. 1.7重组表达质粒的构建与筛选鉴定过的重组 转化子用EcoRI,BamHI双酶切,纯化后连接于 用同样两种酶消化过的pGEX一4T一3表达载体中 重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在含有氨苄青 霉素的LB培养基平板上筛选出阳性克隆.DNA测 序由上海皓嘉公司完成. 1.8融合蛋白的表达,纯化,电泳鉴定含有重组 质粒的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的2一YT培养液 中37?振荡培养至D(600)一0.6,0.9,加人IPTG 至终浓度0.2mol/L诱导表达3h离心收集菌体后 PBS悬浮超声破菌.1000r/min离心15min,收集 上清.进行纯化和蛋白酶消化操作按GSTGene FusionSystem说明进行.纯化的蛋白鉴定采用常 规SDS—PAGE法鉴定. 2结果 2.1RNA的完整性,纯度及定量从胎肝提取的 总RNA经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,可见明显的 28s,18s和5s条带,而且28s的亮度大约是18s 的2倍,说明提取的总RNA基本没有降解,有较好 的完整性.对RNA样品进行紫外分光光度分析得 出D(260)/D(280)一0.157/0.075—2.1,说明 RNA有较高的纯度,经紫外分光光度定量得出样品 中RNA的含量为3g/l. 2.2PCR产物的大小鉴定PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳,可见片段大小约380bp(图1),符合 hALRcDNA可读框架的大小. bP 200一 圈1PCR产物琼脂?凝睦电泳 Fig1kgarosegeleItnr呻horesjs0fPCRprodluels A:100bpDNAladderIB;PCRproducts 2.3重组表达质粒的构建度目的序列的测定构 建融合蛋白GST—hALR的重组表达质粒如图2.表 达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),潸序 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 序列正 确,见图3. 2.4融合蛋白表达,纯化厦酶切电泳鉴定SDS— PAGE分析显示(图4)重组菌在约4.1×10处出现 一 蛋白条带融合蛋白前体答胱甘肽S一转移酶约 10,hALR约1.5×10.薄层扫描蛋白电泳结 2.6× 果表明,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的36.3 3讨论 ALR作为保肝因子最初是在部分肝切除后的 再生肝脏以及初断乳的大鼠增生肝脏中分离,纯化 和克隆得到的Hagiya等研究发现,基因重组产 生的ALR与天然ALR具有相同的保肝教应.最初 研究ALR的保肝教应是在已知ALR的物种非特 异性的前提下,通过犬的Eck瘘模型进行的,即通 过门腔静脉吻合分流术人为减少肝脏血液供应,并 使左,右叶肝脏在相同的环境中独立行使功能.实验 时一叶肝脏从外源泵人ALR,另一叶肝脏则作为内 对照结果发现,对照肝叶的肝细胞出现典型的Eck 瘘损坏,而泵人ALR的肝叶其肝细胞具有正常的 超微结构,而且能显着增强Eck瘘模型损伤后的细 胞更新;加人抗ALR单克隆抗体能抵消此效应.目 前,国内广泛应用从新生小牛肝,乳猪肝提取的促肝 细胞增殖因子治疗重型病毒性肝炎,并取得较好疗 ?536?第二军医大学2000年6月.第21卷 l VT4li gascl 圈2裹选质粒pGEX一4T-3(hALR)的构建圈 Fig2Schematicdiagramoftheconstruction oftheexpressionplasmidpGEX一4T一3(hALR) 【^T??^?肼c^G^^?5GG^c^旺^TT^c0?衄^Tt鞠 61GA^c6G觚10.cc^c^ccG6cTocTcL1c船.c..叶^髓o?^oc憎 121.^cocc"c^Gc^G^哪r.6c^6TTcATA蚰CTT^Tr1T^^GTm 18Icom^^GT黼彀.岍MAGGr御.A^积忧啪^c艘 241cGc.c:cG{c^T研代啪瑚罐m^田船^w^6^^.? 鲫l订批0cG^cTT"ccTc^^"田稍^1^3Gc4OGcG?器06静 ?lT?cTM口 图3人肝脏再生增强因子eDNA全序刊 Fig3Sequenceofhumanaugmenterof liverregenerationcDNA 2?l一 ……m 图4裹选蛋白的SDS—PAGE电涞 Fig4SDs.PAGEanalysisofexpressedprotein 1:Moleeutarf岫smarkerl2;PurifiedfusionproteinofbALR; 3:PurifiedhALReleavagedbyThrombin;4:Crude[ysateof BL21fDE3)transformedbypGEX一4T一3}5?Crude]ysateofBL21 (DE3)transformedbypGEX4T3(hALR) 以上不足.因此,重组hALR的研究开发对于治疗肝 炎,肝损伤,肝衰竭等肝脏疾病无疑将有着广阔的应 用前景.我们采用GSTGeneFusionSystem表达 hALR,其突出优点在于表达产率高,可溶形式存在 的蛋白纯化步骤简单.融台蛋白中GST可与谷胱甘 肽特异性结合,利用亲和层析法,表达产物经单位点 酶切后再经凝胶过滤层析就可以得到纯化.另外, Adams等报道在胎鼠胰腺移植治疗糖屎病的研究 中,ALR不仅能增加其移植的成功率,而且可减少用 于成功的胎鼠胰腺移植所需的组织量.同时观察发 现,在ALR存在的情况下,胎鼠胰腺移植受体的血 糖水平转为正常后,不仅不出现过度补偿现象.而且 能使其葡萄糖水平维持在正常大鼠的葡萄糖水平范 围内.目前对ALR的理化性质及生物性能已有了一 定的认识,但ALR的作用机制等仍有待于进一步研 究.相信随着对ALR了解的逐步深人,必将能使 ALR在临床疾病的治疗中发挥更大作用. 【参考文献】 E1]GiordaRHag[yaM,Sek[Tt.Analysisofthestruc"】1 andexpressionoftheaugmenter0liverregeneration(ALR) gene[J]MolMed一1996.2(1):97—108. [2LisowskyT.Removalafanintronwithunique9branchsite ?taminoterminalproteinsequencedirectingthe scERVIgeneproducttomltochondria_J]Yeast,1996,12 (i5):i50i一1510 E33SteinG,LisowskyT.Functionalcomparisonoftheyeast scERVIandscERV2genesEJ]Yeast,1998,14(3):171—180 [4]HoflaausG,SteinG-PotimenoL.eta1.Highlydivergent aminoterminiofthehomologoushumanALRandyeast E}1geneproductsdefinespeciesspecificdifferencesincel— lularIocalizafionEJ]EurJCellBiol,1999.78(51:349—356 [5]HagiyaM,Fr?】1aA.PolimenoL.etalClon[t~gand quenceanalysisoftherataugmenterofLiverregeneration (ALR)gene;expressionofbloLogiea[1yactiver~ombinant ALRanddemonstrationoftissuedistribution[J]ProcNat] AcadSe1USA.1994.91(17):81428146. [6]HagiyaM,FrancaviltaA,PolimenoLtalCloningandse_ quencea~[ysisoftherataugmenterofliarrege~ration (ALR)gene{expressionofbiologicallyactivei'e~ombinant ALRanddemonstrationoftissuedistribution_J]ProcNatl AcadScLUSA.1995.92(12):3076 :7]AdamsGA.MaestriM,SquiersEC,a/Augmenteroffir— eTregenerationenhancesthesuccessrateoffetalpancreas transplantationinrodentsE1]Transp[antatlon.1998.95(1): 32—36 效,但这些制剂受其来源,种源差异及其纯度的限制,[~tl1日期】200C~01—09【?目日期】20~04—10 应用推广受到较大的限定,而重组hALR则弥补了【本文?-】摊春芳 ll一一 ?