多器官功能障碍模型中胰腺脂质过氧化与血TNF-α表达变化研究（可编辑）

多器官功能障碍模型中胰腺脂质过氧化与血TNF-α表达变化研究（可编辑） 多器官功能障碍模型中胰腺脂质过氧化与血TNF-α表 达变化研究 青岛大学 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 多器官功能障碍模型中胰腺脂质过氧化与血TNF-α表达变化的 研究 姓名:李磊 申请学位级别:硕士 专业:消化内科 指导教师:赵清喜 20090604 多器官功能障碍模型中胰腺脂质过氧化与血TNF―a表达 变化的研究 摘 要 MODS 首先 organdysfunctionsyndrome 目的:多器官功能障碍综合症 multiple failure 提出，近30年来尽管对于 由Tilney以“序贯系统衰竭” sequentialsystems 急危重症临床治疗手段不断提高，但MODS的死亡率仍较高。MODS仍然是临床急 危重症患者死亡的主要原因之一，并且占用了大量医疗资源。相关研究认为“二次 打击”假说能较为准确、合理地阐述发病机制。当机体受到诸多因素引起的双重打 击后大量的细胞因子级联释放，引起炎症反应失控，使机体内环境难以再维 持平衡， 最终导致MODS的发生。现在对于急性胰腺炎的研究虽然已经取得一部分成果，但 是发病原因和器官损伤的机制仍不明确，是目前研究的难点和重点。除胰酶激活自 细胞因子大量释放及胰腺微循环障碍引起胰腺损伤逐渐成为身消化学说外， 研究的 热点。本实验在建立猪MODS模型的基础上，动态观察MODS模型动物生命体征、 细胞因子的变化;监测胰腺病理和脂质过氧化水平的改变并比较两者的相关性。 方法:l、建立猪MODS模型。20头猪麻醉后用动脉放血法使平均动脉压降至 ( 55 2-25h 24h ，维持 ，然后回输60,所失血液和两倍平衡液复苏; 程中监测生命体征包括心率、血压、呼吸频率;检测血液指标包括ALT、AST、Cr、 BUN、动脉血气、血常规。 2、监测胰腺病理变化和脂质过氧化水平及血肿瘤坏死因子一Q TNF(0【 的变化。 TNF(Ct，取胰腺组织测定组织中丙二醛 MDA 同时制备病理切片进行胰腺病理评 分。 结果:1、20例实验动物中16例发生MODS，其中11例实验动物出现了2个 器官功能障碍，发生3个器官功能障碍的有3例，有2例出现了4个器官功能障碍。 病理学改变主要表现为各器官明显的非特异性炎症细胞浸润。 2、在实验的第二部分中随着MODS发生发展TNF(0【明显升高，并于机体内保 持有一较高浓度，而胰腺组织在此过程也出现了明显的炎症损伤，病理表现为胰腺 细胞及间质细胞坏死，血管充血及炎性细胞浸润。TNF(u同胰腺MDA含量及TNF(? 同胰腺病理评分均有明显相关性。 结论:本实验成功应用“二次打击"理论复制MODS模型，在观察MODS发 生发展过程的同时，进,步观察明确了胰腺在MODS过程炎症损伤情况，同时初步 了解了胰腺损伤同整个机体细胞炎性因子的相关性变化，为临床治疗提供一定的理 论依据。 硕士研究生 李磊 消化内科 指导老师 赵清喜 副教授 关键词:多器官功能障碍综合症;胰腺炎;肿瘤坏死因子;脂质过氧 化 The betweenTNF-Qinblood’andthelevelof analysis lipid peroxidation in in pancreasmultipleorgandysfunctionsyndrome( ABS’I’RAC’I’ wasdefined as Purpose:Multipleorgandysfunctionsyndrome firstlybyTilney failure”about30 theclinicaltreatmentsfor ”sequentialsystem yearsago(AIthough havebeen is aresultMODSisstill As high( patients constantlyimproving(themortality anacuteandsevereclinicaldiseaseandoneofthemainreasons tothedeath contributing ofcritical studieshave couldbe patients(Currentsuggesttedthat”double-hit”hypothesis toits reasonable a suffersfromtwo of pathogenesis(、枷enbody hits(plenty and mediumsare wouldcause pre(inflammatoryanti(inflammatoryproduced(These inflammation cannotsustainthehomeostasisand reactions;then(the overwhelming body wouldresultinthe ofMODSandevendeath(Currentstudiesofacute presence havebeen the andmechanismof improving，butetiology pancreatitis organdamage of remainobscure(Therefor(thisfieldbecomesthefocustheclinicians(B esidesthe of activationand caused theorytrypsinogen self-digestion，pancreaticdamage by substantialof andmicrocirculationdisturbancehas become releasingcytokines gradually ahot this the modelofMODSwasestablished(Thevital of signs topic(Inexperimentpig animalswereobserved(Atthesametime andthe cytokines， pancreaticpathologychange ?? 1evelof weremoni【toredand lipidperoxidation compared( first ofthe ofMODSwas Methods:In model part experiment(apig successfully establishedto the were first 20 anesthetic( accordingthe“double(hit”theory(InstepPigs thenthemeanarterial 2 wasdecreasedto55+5 andmaintainedforhour( pressure mmHg the the 60,ofbloodlossand doublevolumeof were Secondly equilibriumliquid transfusedintotheseanimalsfor after24 of resuscitation(Thirdlyhour,1(Omg,kg coliendotoxin endotoxin Escherichia05585，sigmacompany wasgiveilcontinuously intravenous the heart rateandarterial Duringstudy,therate(respiratory by infusion( blood were thesame ofbloodwerecollected time，the pressuresupervised(At specimens forserum routineexaminationandblood AU:AST，Cr,BUN，blood everyday gas the ofthe wasinfused4animalswere second endotoxin analysis(In part experiment，after selectedat0 hoursand96 randomly hour，24hours，48hours，72 hours， respectively( TNF(ainbloodandMDAof tissueweremeasured(meanwhilewemadethe pancreatic scores slices(Attheend(thecorrelationwas pathologl’calofpancreatic analysised( Results:In 6 MODS thetotal thisresearch，1 animals， which pigsdevelopedamong 11 animalswithtwo three including organsfailure，4 organs experiental pigshaving failureand2 fromfourormore failure(Inthesecond pigssuffering organs part， the concentrationofTNF(c【hada increase(andmaintaineda levelinthe significant high bodies(The tissueinthis alsohadobvious reactions( pancreatic study inflammatory TNF(旺was relatedtobothof MDAand dramatically pancreatic pancreaticpathological scores( thisresearch(asuccessfulmodelofMODSwasestablished Conclusion:In to theobservationofthe of accordingthe”double-hit’(theory(Besidesdevelopment inthecourseof was MODS(theformationof MODSunderstoodfurther(The pancreatitis of and relevancebetweenthe was changecytokinespancreaticdamagerecongnized preliminarily( Postgraduate:Lei Directed Zhao byproLQing-xi KEY necrosis dysfunction WORD:multipleorgan factor-or;lipidperoxidation 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文中依法 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于 他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。 本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。 论文作者签名:歹葛殇 日期:碲6月争日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。学校 享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表 或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛大学。 本学位论文属于: 保密口，在 年解密后适用于本声明。 , 不保密彤 请在以上方框内打“?一 日期: 刃7年6月9日 论文作者躲庞 导师签名::狲 本声明的版权归青岛大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自 使用 青岛大学硕十学位论文 多器官功能障碍模型中胰腺脂质过氧化水平及病理改变同血TNF-Q 表达变化的相关性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 吉 己I J I 口 多器官功能障碍综合症 multipleorgandysfunctionsyndromeMODS 首先由Tilney failure 的概念提出【11，在以后几十年问，随着 以“序贯系统衰竭” sequentialsystems 经验积累和对其发生发展的病理生理学研究的不断深入【21，使得人们对疾病的早期发 展、早期诊断、早期治疗更加重视，最终提出了多器官功能障碍综合征 MODSl和全 SIRS 的概斜31。 身炎症反应综合征 随着近30年来医学理论的不断更新进步、临床抢救手段提高、医疗器 械进一步完 备以药物的不断推陈出新，单一脏器功能衰竭如急性亚急性肝功衰竭、呼吸衰竭、急 性肾功能衰竭等的治疗已经取得了较显著的提高。但多脏器功能的不断损害和两个或 多个器官功能不全即MODS在临床上仍是许多危重疾病终木阶段无法预测的并发症 血性休克和严重外伤，尽管重症监护和替代治疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 不断发展，机体支持维护手段更 加完善，新的抗生素和相关药物不断涌现，但2个器官功能不全的死亡率至今居高不 下，四个脏器衰竭及四个以上脏器官衰竭患者救治成功案例鲜有报道。主要原因在于 发病机制尚未完全认识清楚，从而导致预防以及各阶现阶段我们对MODS的 段救治方 案没有明确 指南 验证指南下载验证指南下载验证指南下载星度指南下载审查指南PDF 。当今研究认为“二次打击”学说能较为准确、合理地解释其发病机制。 当机体受到诸多因素引起的双重打击后大量的细胞因子级联释放，引起炎症反应失控， 使机体内环境难以再维持平衡，最终导致MODS的发生【61。 目前急性胰腺炎发病机制并未完全阐明，除外传统的胰酶激活、胰腺自身消化理 论外，内毒素血症、炎性因子和氧化应激脂质过氧化在急性胰腺炎的病理发生发展中 necrosis 71。其中肿瘤坏死因子(a tumor 的作用以及相互影响逐渐成为研究的热点I factor-or 起着重要作用【8】，【9】’【101。TNF吨在体内发挥作用主要依靠cAMP介导一种磷酸 化反应并且可作为炎症细胞趋化因子引起白细胞尤其是中性粒细胞的聚集最终诱导 “呼吸爆发”产生炎症反应。TNF(Q浓度在急性胰腺炎过程中升高，并且其血中浓度 可以预测疾病的发展和预后【l?。 在哺乳动物体内炎症的病理发展过程中氧自由基以及脂质过氧化反应可以产生明 引 言 显的细胞毒性反应。多种物质如内毒素、脂多糖 LPS 和炎性因子均可刺激内皮细胞、 血管平滑肌细胞等细胞或组织产生氧自由基，诱发脂质过氧化造成组织损伤【坦】。实验 从而反映组织受损情况。相关研究表明急性胰腺炎时胰腺组织的MDA含量明显升副13】， 【川，而MODS发展过程可引起胰腺组织损伤f15】。但损伤程度同整个机体病情发展变化 的关系并未有明确研究。 以往在关于MODS的实验中已有对炎性因子产生、相互作用以及进一步效应放大 形成级联反应的发展过程与生命体征变化深入研究，同时对肝脏、肺脏、心脏以及胃 肠等器官已有明确的结果表明组织病理和器官功能的损伤。本实验在成功建立的 基础上进一步探讨胰腺组织脂质过氧化水平、病理损伤同机体MODS模型的 内炎症因 子之间的关系。 2 青岛大学硕七学位论文 第一部分 多器官功能障碍综合症模型的建立 多器官功能障碍综合症 MoDS 指机体遭受各种严重打击后在24小时后连续或 同时出现的2个或多个器官功能不全，是临床最具威胁的并发症。MODS研 究的一个 难点在于MODS动物模型的建立，因为其可以为发病机制和临床防治的研究提供必须 的实验平台和充分的实验数据。MODS发病机制和临床表现复杂、干扰治疗的因素多、 目前许多现病理变化多样使得模型制备时需考虑各种因素而造成建立困难。有的 MODS动物模型，单一打击可出现“全或无"现象造成动物存活时间短、实验数据收 集不全以及诊断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 不合理等制约因素而难以被临床工作者接受【l61。本研究目的在于 根据Deitch的学说努力建立一个接近临床MODS发展过程的标准化的动物模型。 材料和仪器 1、动物及分组 模型。5个时点随机抽取4头动物检测血液及胰腺指标，同时观察实验动物 生命体征。 2主要仪器和试剂 2(1(主要试剂 大肠杆菌内毒素05585 sigma公司 江苏恒瑞制药 盐酸氯胺酮注射液0(19,2ml 天津金耀氨基酸有限公司 硫酸阿托品注射液0(25mg,2ml 上海禾丰制药有限公司 盐酸利多卡因注射液0(19,5ml 上海禾丰制药有限公司 地西泮注射液10mg,2ml 上海禾丰制药有限公司 呋塞米注射液20mg,2ml 上海禾丰制药有限公司 盐酸多巴胺注射液20mg,2ml 上海禾丰制药有限公司 盐酸。肾上腺素注射液1mg,lml 乳酸钠林格氏液500ml,瓶 山东齐都制药有限公司 0(9,氯化钠注射液100ml,袋 山东齐都制药有限公司 5,葡萄糖氯化钠注射液250、500ml,袋山东齐都制药有限公司 多器官功能障碍综合症模型的建立 2(2(主要仪器 深静脉留置导管 百盛 河北百洋离心机厂 B160A型台式离心机 KDC(1 60型低温低速离心机 安徽离心机厂 PM(7000心电监护仪 深圳迈瑞 MDF382型一80"C冰箱 日本三洋电子有限公司 石蜡包埋机 德国ZEISS HNl340E切片机 德国ZEISS PHY-1l 1病理组织漂烘仪 常州中威 全自动生化分析仪 德国Abbom公司 Clinitek(Status尿液分析仪 Bayer公司 AVL一900型血气分析仪 瑞士AVL公司 MI106C多功能监护仪 美国HP公司 Swan―Ganz漂浮导管 美国ARROW公司 动脉压力传感器 美国HP公司 Wz50c静脉注射用微泵 美国BECKMAN公司 EVITAW型呼吸机 德[]Drager公司 方法 2、模型建立 MODS模型建立过程中依次为首次打击、二次打击2个阶段。分别形成 失血性休 克再灌注期和内毒素血症期。 2(1、术前准备:实验前动物适应实验室环境24h，实验前常规禁食12h，禁水2h 并备皮。动物实验室温度保持在264C左右。实验用材料、试剂等均无菌、无热源。插 管选择与器械准备: 1 常规颈部和腹部外科手术器械各一套; 2 深静脉留置导管， 及漂浮导管鞘2根; 4 气管套管，需为可长期留置导管; 5 三通开关: 6 导尿 管。 2(2、手术步骤: 2(2(1打击前准备:动物称重后经耳缘静脉注射麻醉用药剂量为氯胺酮 10mg,kg,h， 4 青岛人学硕十学位论文 动物固定于手术台上，手术部位常规消毒，解剖分离出气管行气管插管，分别分离出 颈总动脉、颈内静脉和股动、静脉，分别插管，颈总动脉接心电监护仪、股静脉处插 入漂浮导管。 2(2(2、失血性休克再灌注期:术后观察动物待各项指标平稳后，开放股动脉插管 动脉压2(2(5h，然后将60,放出血液及两倍失血量的平衡液自股静脉导管1h内回输复 苏，回输完毕MAP均能恢复至伤前水平80,以上。 2(2(3、内毒素血症:实验开始的24h后给予大肠杆菌内毒素1(0mg,kg由静脉持 续24小时滴入。 2(2(4、密切观察实验动物基本生命体征及适当支持治疗以预防死亡减少复苏失败 率。各脏器功能支持:循环、呼吸、代谢等常规支持。常规行心电监护，当出现在无 血容量不足情况下，心率 2倍对照值;平均动脉压弋 60mmHg等心功能不全时，开始 易呼吸机辅助呼吸。常规静脉滴注乳酸林格液和葡萄糖液，每天150ml&g,d，注意补 钾1(59,日。 3、观察指标: 生命指标:应用心电监护连续监测血压、心率、呼吸频率。同时每2h记录一次中 心静脉压、中心体温、肺毛细血管楔内压。 抽动脉血进行血气分析。 4、诊断标准 以HuSen等【1刀的相关研究为参照建立诊断标准。 1 消化系统表现:腹胀、肠麻 痹和急性胃黏膜病变;血ALT、或总胆红素 TB ?2倍对照值等肝脏指标; 2 血液 系统:血小板低于对照值80,，凝血酶原时间 PT 及凝血酶时间 TT 比对照延长 大于3s; 3 心肺功能不全:在无低血容量情况下，心率?2倍对照值或心率 60次,min 和 或 MAP持续S70,对照值;出现ARDS、呼吸窘迫，呼吸频率翌倍对照值，动 Cr、BUN较对照值高2倍。机体受打击后24h后出现2个或2个以上器官或系统功能 不全，并出现全身炎症反应综合症 SIRS 【l副可称为MODS。 5、统计学处理 主要器官功能指标的数据以均数?标准差表示，组内比较采用t检验。p 0(01 为差异非常显著，p 0(05为差异显著，p 0(05无显著差异。 5 多器官功能障碍综合症模型的建立 结果当日7K 1、主要器官功能变化:实验动物静脉注入内毒素后各时点观察结果表明各器官功 时开始出现氧饱和度明显下降同时开始出现肝肾功能能损伤明显，自24小 变化。 见表1(1。 表1(1各时点主要脏器功能变化 Pa02较PaC02敏感，24h 时亦明显升高 胙O(05 ;肝肾功能指标也有明显改变，肝功损伤较肾脏出现较早。 实验结果表明动物MODS模型制备成功，实验动物均表现出多脏器功能不全的临 床症状，以心肺功能损伤出现的较早，肝肾功能损伤表现也比较明显，各指标改变均 于相应时点出现高峰。其中20例实验动物均有较明显的肺功能损伤，11例实验动物出 现了2个器官功能障碍，发生3个器官功能障碍的有3例，有2例出现了4个器官功 能障碍。实验动物所反映的病理生理过程同临床上MODS病人的病理生理发生发展过 但实验中72h后个体生命体征表现可能同试验中为防止模型动物程相类似， 死亡而应 用的生命支持治疗有关。总之本实验可较成功的模拟MODS病理生理过程，可为下一 步研究提供可靠的模型保障。 2、各器官组织学表现:动物处死后，除取胰腺组织为下一步研究做准备以外，同 时其他脏器也进行的大体病理及镜下病理的观察。大体病理所见为主要器官明显淤血 伴点、片状出血及坏死，镜下病理所见主要为以明显的非特异性炎症细胞浸 润、间质 充血水肿为主的炎症改变。 6 青岛大学硕士学位论文 ?、 ，;;;，;;:一 圈I-I双辟--张，停点状出^厦丧状坏死 瞄lo 譬 豳14肝奎厦呈眸“，无嘲显坏死灶，儡有点状出血点( 多器官功能障碍综台症模型的建立 田14肝窦充血扩张(肝簟臆周围及门管区少量畿蛔雠涓(x0? I争 圈I-5肾脏轻座肿雎。无明显坏死灶，黼点状出n点 圈l 肾小警内虽白蕾型、水肿藏(肾小璋结柑基本完整伴有少量嶷细臆浸润(x2? 青岛入学硕十学位论文 第二部分血TNF一0【同胰腺MDA及病理评分相关性分析 MODS过程中各器官功能变化及机体基本生命体征监测已有较多研究报道，同时 本课题实验中也有相关观察、记录。人们已经发现肿瘤坏死因子 TNF(0c 是细胞与脏 器功能障碍以及相关的多器官功能衰竭的病理生理变化过程中的主要因子。多种炎性 因子的共同作用是MODS形成和发展的重要通路。有必要动态观察血浆TNF一伐等炎性 因子变化同各器官组织损伤、功能改变的相互关系，以进一步加深对MODS病理生理 过程的认识，为临床治疗提供参考。MODS中对胰腺功能及组织变化的研究较少，而 胰腺是机体重要脏器，在MODS发生时大量非特异性炎症因子涌入循环系统且相互作 用引起失控的炎症反应，炎症因子可对胰腺组织及脏器功能造成损害，同时脂质过氧 化在胰腺损伤中起重要作用。本实验利用二次打击方法，以成功复制出动物 MODS模 型为平台，研究胰腺组织病理改变、脂质过氧化水平同动物模型体内炎症因子变化的 相关性，为研究MODS的胰腺损伤机制及临床防治提供了实验依据。 材料和方法 1、主要仪器和制剂 1575型免疫洗板机 BiO―I乙,D Bio―R9d550酶标仪 Bio―RAD IX70倒置光学显微镜 Olympus B160型台式离心机 河北白洋离心机厂 BCD(233型普通冰箱 伊莱克斯电器有限公司 MDF382型一80?冰箱 日本三洋电子有限公司 上海分析仪器厂 751一GW型紫外分光光度计 美国ScientificIndustries公 司 K-550-GE漩涡混匀器 TNF(Ct PTA00 美国R&D Systems SHZ(82型水浴恒温振荡器 江苏太仓县医疗器械 厂 MDA测定试剂盒 南京建成生物工程研究所 2、动物模型及分组 9 血TNF-a同胰腺MDA及病理评分相关性分析 模型分组及制作见第一部分。 3(、实验方法 3(1组织匀浆制备 制备10,的胰腺组织匀浆，匀浆因子选择预冷生理盐水，匀浆因子的 体积应为组 织块重量的lO倍。 步骤如下: 1 取以冰冻的胰腺组织组织块在室温融化，滤纸拭干水分，电子天 平称取重约 150mg的组织块。 2 将组织块放入5ml烧杯中，用加样器取2,3总量的匀浆因子于烧杯中，将组 织用眼科剪尽快剪碎。 3 将剪碎的组织倒入试管中，用将剩余的1,3匀浆因子冲洗残留在烧杯中的碎 ( 组织块后一起倒入盛放组织的试管中。 4 将玻璃试管置于冰浴中，使用组织匀浆器15000rpm，每次匀浆时间10秒， ’间隙20秒，重复操作6次，研磨制成10,胰腺组织匀浆。 immunosorbent 3(2采用酶联免疫吸附法 Enzyme―linkedassay，ELISA 测定血清 细胞因子浓度。 测定原理:本实验测定血浆TNF一0【水平采用ELISA法。其原理为将抗猪TNF(0【 单抗包被于标板上，对照标准品和实验样品中的TNF(a均可与单抗结合。由山葵过氧 化物酶 HRP 标记的抗猪TNF(Q抗体与TNF(仅形成抗原一抗体免疫复合 物连接在板 上。当加入山葵过氧化物酶底物 OPD 时出现黄色，加入液硫酸终止反应，颜色变 深，产物最大吸收峰值在450nm处，由此测定吸光度值 opticaldensity，OD ，TNF(a 浓度与oD值成J下比，可通过绘制标准曲线求出标本中TNF(Q的浓度。 TNF(0【的测定操作步骤参考说明书 TNF(Q标准品; 2 取出反应板，每孔中加入50ul的RDI-63稀释液; 3 在相应的孔中各加入50ul标准品、空白对照及待测样品后将 反应板置于 500?50rpm振荡器上，室温下孵育2h; 4 甩干孔内液体，每孔加入400ul洗涤缓冲液，洗板4次; 5 每孔加100ulHRP标记的抗猪TNF(戗单克隆抗体，置于振荡 器上，室温 lO 青岛大学硕士学位论文 孵育2小时; 6 重复。 4 洗板操作; 7 每孔加120ul底物工作液，平置于工作台上，室温孵育30m; 8 每孔加120ul终止液，混匀; 9 加终止液后30分钟内在酶标仪上读取450rim的吸收值。 3(3胰腺组织MDA测定 比妥酸缩合并形成一种红色产物。本产物最大吸收峰值在532nm处。MDA可以代表 细胞受自由基攻击的程度，从而反映组织受损情况。检测样品为组织匀浆上清液。 MDA的测定操作步骤: 1 由4?冰箱中取出试剂盒室温下放置半小时: 2 按照说明书配置试剂二、试剂三; 无水乙醇、0(2ml试剂一，测定管中加入0(2ml样品、0(2ml试剂一，摇动试管架混匀。 4 在上述各试管中均加入试剂二3ml，试剂三lml，漩涡混匀器混匀。 3 试管口使用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95?水浴40m，取出后流水 冷却，3500rpm，离心10分钟，取上清。 4 上清液加入比色皿中，532nm处，lcm光径，蒸馏水调零，测 各管吸光 度值。 上清中MDA含量 测定管吸光度一测定空白管吸光度 nm01 X标准品浓度 标准管吸光度一标准空白管吸光度 3(4胰腺病理组织学观察 取胰腺组织常规石蜡包埋、切片并行HE染色，由病理科医师进行镜下观察。参 照Grewal法【19】对胰腺组织损伤进行定量评估。 ( 评分标准如下: 水肿:0分 无水肿，1分 轻度叶间隙增宽，2分 重度叶间隙增宽，3分 腺泡间 面积1 计，每5个炎细胞计0(5分，超过30个计4分;出血:0分 无出血，1分 有出血。 血TNF(n同胰腺MOA及病理评分相关性分析 4、统计学处理 主要器官功能指标的数据以均数?标准差表示，组内比较采用t检验，两组 数据间行相关性分析求，(值并作f检验。p O(01为差异非常显著，p 0(05为差 异显著，p 0(05无显著差异。 结果 l各组数据于不同时点所测得的数值。 1(1、TNF(Q 表2―1表示根据标准曲线测得的不同时点TNF(a的变化情况。 表2-1各时点TNF―c【的变化 1(2 MDA 表2―2表示应用比色法测得的不同时点TNF―a的变化情况。 表2-2各时点MDA的变化 1(3胰腺病理评分 表2―3表示不同时点胰腺组织病理切片镜下观察测得的病理评分的变化情况。病 理表现主要有胰腺细胞及间质细胞坏死，血管充血及炎性细胞浸润。 表2(3各时点病理评分的变化 于48h达到高峰;作为反映胰腺损伤的指标，胰腺组织MDA含量和病理评分同样也于 24h出现显著改变并继续升高。三组数据组内相互比较可见在MODS过程中TNF(a明 12 青岛大学硕十学位论文 显升高，并于机体内保持有一较高浓度，而胰腺组织在MODS的发生发展过程也出现 了明显的炎症损伤。这与第一部分中观察的基本生命体征的变化相一致。 2相关性分析 2(1TNF(0c同MDA r 0(91‖O(01 2(2 TNF(Q同病理评分 r 0(87,p 0(05 体内TNF(a的大量释放同胰腺的炎症损伤两者之间正相关。结果表明MODS中 由于体内炎性因子的大量释放，胰腺存在明显的炎症病理过程。 结果表明，在MODS中胰腺随着病情的不断发展、炎性致病因素作用的级联放 大，在疾病的早期己明显出现了脂质过氧化损伤，同其它器官的功能损伤变化相一致。 胰腺主要发生的非特异性炎症变化主要表现为细胞分析病理切片中的变化， 坏死、炎 性细胞浸润以及问质充血。结合第一部分中镜下病理切片分析，胰腺组织中细胞存在 明显坏死，血管充血更明显，胰腺损伤似较其他器官的损伤严重。 13 血1NF吨同展腺岫^及病理评分相关性分析 F‖ 黪y 鬟 目 I矗瞥内丈量?蘸件置白璧形成，周圉阃曩冉囊性蛔盥澧满(X4CO 田2(2旗腺纲鹰坏死表现为棱醉袈，少量囊性镭鱼浸澜(×200 田2-3胰腺绷臆片执坏死t同质内血f克血、矗聃坏死伴毙眭蛔胜润(x0吣 x柚0 圈24囊奠细胞片机坏死(基奉未魂寨纠正常组织( 圈”腿?量片状辆件囊性?盈漫舅，^f充?(×2? ? 田2 胰鼻组鱼片机坏茏伟大量浆簟囊浸润(?瞥亮血(x椰O 青岛大学硕士学位论文 讨论 1、多器官功能障碍综合症模型制备 近几年研究结果表明:MODS的发生除与创伤、感染等外界打击因素关系密切外 还与内环境中免疫系统紊乱相关。在疾病的病理发展中，早期以SIRS为特征，表现为 炎症因子大量释放出现明显的炎症反应，随病情发展出现机体免疫力低下【20】。Deitch 在研究中发现在因中度创伤引起SIRS后，一部分病人存在一种临界致敏状态，如果在 后续发展中出现再次打击因素如二次感染、缺血再灌注等，就会导致内环境紊乱和免 疫失衡。大量非特异性炎症因子 TNF、白介素一1、白介素(6、白介素一8 级联释放且 相互作用使炎症反应加重并且最终导致MODS的发型2?，这就是MODS的“二次打击” 学说。“二次打击”学说重点在于强调致病因素对机体的连续性打击。临床上的失血、 烧伤以及感染都能引起机体的致敏反应，但在一般情况下造成MODS甚至死 亡的几率 较低。因此打击因素对机体造成的影响不??定非常强，只要其序贯性发生并反复作用 不断放大其影响就可以诱发SIRS和MODS的发生。当某一种致病因素已引起了机体 免疫紊乱并激活各种免疫细胞释放其多种炎性因子而形成的早期的炎症反应起到预激 效应时，如果其他因素出现且进一步放大炎症反应，则构成第二次打击，从而核转录 因子系统的反复激活导致大量非特异炎症因子的释放形成一种类似正反馈的“级联反 应 cascade ”[221。这种失控的炎症反应最终结果导致组织细胞损伤和器官功能不全。 首次打击造成的直接器官损伤多是单个器官功能不全无法完全阐述或代表MODS，但 此时体内炎症反应已非常明显可包括炎症细胞活化、组织和功能损害、微循环障碍、 毒素潴留以及氧化应激反应，从而为诱发MODS形成预刺激，这是二次打击后脏器功 能不全的基础。基于上述理论建立的二次打击MODS动物模型在国内已有较成功的制 备【231。这也是试验能够成功实施的必要基础，本实验目的在于探讨在MODS过程中随 胰腺组织病理着体内大量炎症因子的释放和器官功能的相继受损的情况下，改变以及 细胞损伤的发展过程和严重程度，同时为临床MODS的救治特别是胰腺保护方面提供 一定理论帮助。 由于MODS的发生机理复杂，模型复制困难，一个符合临床过程的比较理想的 MODS动物实验模型的建立并非易事。在近20年的相关研究中逐渐形成了一系列的评 价标准主要有: 1 同临床病因大致相同的打击方式; 2 24小时以后同时 或序贯性 17 讨论 出现有2个或2个以上器官或系统的功能不全; 3 同临床病因大致相同的病理过程; 4 动物生存时间长及重复性好【24】。但是同时需注意较重的连续打击可能造成很快产 生脓毒血症 Sepsis 、休克，动物存活时问短，这样可能引起MODS模型制备不成功 或动物在较短的时间内死亡不利于实验数据的观察【251。因此在要求MODS发生率的同 时还应尽量保证模型动物有较长的存活时间以利于观察。 单纯应用低血容量休克可以引起MODS[26】，但动物模型时成功率较低，易出现“全 或无”表现，即轻度休克对器官功能影响很小，而重度休克如过程不可逆时，动物在 休克后24h内死亡12不。 细菌感染或内毒素血症是临床MODS的最常见的诱发因素，但是单纯应用造成细 菌性腹膜炎产生MODS模型的方法虽然易复制但不仅成功率并不高，并且同临床的病 理生理发展过程差距较大【28】。 血性休克加内毒素复合因素成功地诱发了实验动物产生多器官功能障碍，制备了比较 符合临床实际的标准化的MODS动物模型。试验中MODS发生率为95,左右，但60, 左右动物在60h,120h内过早死亡，可能同实验中打击水平较高有关。 本研究MODS动物模型的制备同样采用失血性休克加内毒素静脉注射双重打击方 法，但缩短了失血后回输时间同时调整内毒素用量，也成功完成了MODS动物模型的 制备并延长了动物存活时间。试验中选择大肠杆菌内毒素主要模拟危重病人肠道屏障 作用减弱时细菌移位形成内毒素血症的过程，内毒素血症在疾病的发生发展中起着关 要由革兰氏阴性杆菌产生，生物活性包括刺激组织细胞不断产生、释放一系列非特异 性炎症因子造成组织、细胞的损伤;影响凝血系统，造成微循环障碍;激活补体、诱 导干扰素产生:影响血流动力学;引起发热、过敏反应等病理状态。本实验模型的制 备过程比较符合临床中MODS的病理发生、发展过程。 在MODS制备中，动物的选择是一个关键环节。作为承载实验的平台，动物的选 择往往可以决定实验的成败。在实验室中一般可将动物分为: 1 灵长类动物，其优 点是处在进化树的顶端，生理特点非常接近人类，可最大可能得模拟临床疾病的发生 发展过程，但价值昂贵，难易饲养的缺点也十分明显; 2 非灵长类大型哺乳动物: 如猪、狗等，同人类在生理结构、机体代谢以及疾病发展方面也比较接近，易于饲养; 3 小型哺乳动物:如大鼠，虽经济上优势大但缺点也较明显如易死亡、不能承受较 青岛大学硕士学位论文 大打击、心肺等功能难监测。综合几十年来前人研究的基础，我们选用非灵长类大型 哺乳动物为实验对象。猪的性格温顺、易于饲养、体积较大，能够耐受手术打击;可 反复取血检查，易于监测;在解剖、生理、病理上同人类接近，是较理想的实验动物。 本实验成功地建立了猪MODS模型。实验过程中，模型动物呼吸、循环、肝、肾、胃 肠道等各系统的指标均有发生明显异常。该实验模型有明显的器官损伤指 标，以及相 应的生命体征改变如血压、心率等，符合MODS的诊断标准，因此，本模型的制备是 成功的。实验中，动物出现了明显的心、肺、肝肾等器官功能衰竭同临床上MODS过 程极其相似。最常见的临床特征主要包括高动力循环状态、SIRS、持续高代谢和器官 功能失代偿。 在实验过程中两次连续打击即失血再灌注和内毒素注射实际上是努力模拟临床上 血流动力学紊乱的过程。即一个系统的低排高阻期、恢复期、高排低阻期及最终失代 偿期。实验中有明显的器官功能不全、炎症反应，最终出现MODS。本实验实用性强， 诱发因素、诊断标准、功能变化、病理改变均与临床相似。本模型具有如下特点: 1 可靠性:猪作为大型动物易饲养，受干扰因素意外的少; 2 相近性:解剖和生理与 人相似，病理生理过程基本一致，镜下病理表现在不同组织中的表现大致相同; 3 准确性:在应用“二次打击’’方法多因素复合作用成功复制出MODS模型的同时适当 调整两次打击的强度和作用时间、积极加强后期的器官支持维护，从而预防了因动物 过快死亡而影响到实验数据的采集，便于观察，因此，本动物模型是符合实际的MODS 发生发展过程，可以通过本模型进行MODS过程中的进一步研究; 4 可重复性:操 作较为简便，给予相同打击可以诱发出相同的变化，容易复制。 2、TNF-a同组织损伤 机体中已经发现的炎症因子约有30多种，其功能复杂并且各不相同，但均参与并 介导各种炎症反应【31】。作用不同的原因主要是自身化学结构差别以及靶细胞不同。但 细胞因子大多可相互作用而发生级联效应。一旦某一因子被激活能促进相关因子的产 生同时激活炎症细胞生成大量新的mRNA及下游蛋白质。SIRS,MODS就是在此病理 生理基础上产生的。相关研究表明在不同器官损伤中均有TNF―a参与【321。 19 讨论 炎性细胞因子在MODS病程的发生发展中起到了重要促进作用【331。分泌炎性细胞 因子的细胞主要有单核(巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞等。人们对炎性因子之间的网 NF(KB是一种核蛋白，其可与免疫球蛋白K链启动子序列KB相结合，主要活性形式是 P65,P50异二聚体。主要存在于B细胞和浆细胞中， 实验中胰腺病理切片 中可观察到 较多浆细胞浸润 。在正常情况下，NF(KB同IKB相结合而无活性，在多种因素刺激下 通过一系列反应使IKB氮端丝氨酸残基发生磷酸化。IKB在26S蛋白酶的作用下降解， (KB成为活性形式并易位至细胞核内引起促炎相关物质相关基因大量表NF 达136】缺血 再灌注、内毒素血症、TNF(Q、IL一1以及放射线等都可作为刺激信号引起IKB降解。实 验中通过动物的缺血再灌注以及模拟内毒素血症在引起各器官损伤的同时，也激活了 炎症细胞主要是单核巨噬细胞释放大量TNF(a。TNF(c‘入血后结合实验中的两个因素 化因子 PAF 等因子的产生和活化，同时引起内皮细胞通透性增加，损伤微循环。如 此相互影响相互作用产生连锁扩展和级联放大的“瀑布效应”，造成免疫功能紊乱，使 各器官功能损害，导致MODS发生。TNF-仅在MODS病理过程中起着较重要作用。 TNF(a分子量为17KD，是一种可溶性多肽。于体内正常低浓度存在，最早被发现 其抗肿瘤特性而以此命名。随着新的研究进展，发现其还参与炎症病理过程的发展， 青岛火学硕士学位论文 原以及某些在体内能影响单核巨噬系统增生的非特异物质等因素作用后，TNF(Ot大量 产生，并且最快到达高峰。机体注入超大剂量的TNF一0【，其经某些特定的细胞膜受体 作用具有减轻炎症反应和促进受损组织修复。而TNF(?浓度的持续异常增高多可提示 炎症反应的存在。TNF(a的生物学作用【38】: 1 TNF(旺能引起中性粒细胞表面表达白细 达细胞间粘附分子(I IC?LM(1 以及内皮白细胞粘附分子(1 Endothelialleucocytes 附壁游走进入组织间隙。中性粒细胞聚集后产生大量氧自由基和蛋白酶，导致血管通 透性变化和组织炎症反应; 2 增强抗原递呈细胞及免疫细胞大量分裂增殖并活化; 3 TNF(n通过抑制纤溶反应、下调血栓调节素的表达、刺激内皮细胞释放IL(1、促进血 栓形成以及诱导次黄嘌呤大量生成和间接诱导多种血管活性物质如内皮素、血栓素、 前列腺素释放等机制导致微循环淤血，促进微血栓的发展。组织细胞的缺血、缺氧进 一步加重了组织细胞的损伤，从而直接或间接导致和促进了MODS的发生和发展; 4 TNF一0t浓度过高时，体内组织分解增加，炎性反应加重; 5 其他作用包括诱导肝细胞 生成急性期蛋白，引起DIC及休克。 NF(KB以及TNF(a在启动和促进急性胰腺炎发生发展过程中起着重要作用，并造 成了免疫紊乱【391，在急性胰腺炎实验模型及患者血清中均可检测到TNF(a、IL一1、lL巧 水平明显较对照组高，并且这些因子的水平随着胰腺炎的严重程度或并发症的出现而 明显呈正相关I删，【411。传统观点认为，各种原因引起的胰酶激活和自身消化可导致急性 胰腺炎。现阶段治疗中禁食、胃肠减压以及生长抑素、抑肽酶是常规应用，但部分病 人尤其是重症胰腺炎病人虽然抑制胰腺的分泌，病死率和并发症的发生率没有显著降 低，因此说明在急性胰腺炎的病理发生发展过程中，胰酶激活和自身消化只是部分原 因或疾病演变的一个过程，不能完全解释发病机制。胰腺的微循环障碍、脂质过氧化 以及炎症因子的释放对胰腺炎有着极其重要的作用【42】，【431。胰腺发生 微循环障碍包括一 系列的过程，大致有血管痉挛、血管通透性增加、局部缺血,再灌注、白细胞附壁及游 走、毛细血管直接通路开放及淋巴回流增加等变化[441。急性胰腺炎早期已有显著的胰 障碍，并随病情发展持续加剧【451。炎症因子、脂质过氧化、血腺微循环 液流变学改变 均可促使机体的微循环状态发生变化?1，在炎症因子中TNF。a不仅直接引起微循环障 2l 讨论 碍同时诱导大量氧自由基形成引起细胞破坏及间接的微循环障碍。TNF(a是急性胰腺 炎发生的初始因子也是最强的促炎因子，与急性胰腺炎的预后密切相关。因此研究在 机体炎性因子升高的情况下胰腺组织的损伤变化可以为目前尚不完全清楚 的急性胰腺 炎尤其是急性重症胰腺炎的发病机制提供参考，并可以完善临床中急性胰腺炎以及由 轻型向重症胰腺炎发展的治疗方案。本研究中选择TNF(a作为代表机体严重程度的指 中有重要作用。 本实验中模型动物在24h、48h两个时点血液循环中的TNF(a均较前有明显升高， 表现出“瀑布样”级联反应的状态。同第一部分中监测的模型动物生命体征变化结果 相一致。TNF―a在体内的较长时间的高浓度是引起模型动物出现MODS的重要因素。 3脂质过氧化同急性胰腺炎 组织细胞膜性结构简单来讲就是脂质双分子层，其维护着机体组织结构及内环境 的稳定。脂质过氧化是由氧自由基接到的对膜性结构的损伤过程。J下常情 况下机体内 氧分子绝大部分在线粒体中转化成H20，仅有极少氧分子可以有线粒体中漏入到胞液 中，经过一系列反应还原成02(、H202、OH一等氧自由基，超氧化物歧化酶 SOD 、 况下，氧自由基被内源性清除后不产生明显作用。但在各种因素引起病理改变时，氧 自由基大量产生超过了组织抗氧化能力造成的细胞膜脂质过氧化、溶酶体和线粒体损 伤甚至直接攻击DNA的状况被称为氧化应激。氧自由基生成中一个关键酶是黄嘌呤氧 化酶，黄嘌呤受其作用时即可产生氧自由基【4‘71。SchulzHU等证实在急性胰腺炎发生早 期脂质过氧化反应起着重要作用【481。在生理状态下，但内环境稳定时，胰腺组织产生 的氧自由基可被体内的清除，两者处于动态平衡。病理状态下，炎性因子大量释放， 胰腺出现微循环障碍时，组织中的免疫细胞特别是中性粒细胞受趋化后聚集并产生大 量的氧自由基，机体免疫力下降、体内的清除系统功能减弱，细胞膜脂质双分子层中 不饱和脂肪酸因具有活泼氢离子的双键而受到氧自由基的攻击，并激发脂质过氧化， 损伤。丙二醛 MDA 是细胞膜受到自由基攻击发生脂质过氧化物反导致胰腺 应后形 成的降解产物。MDA含量的多少可以代表细胞膜脂质过氧化和细胞膜损伤的严重程度 【491。MDA在目前有关评价氧自由基损伤的实验中被广泛采用。胰腺炎时，胰腺组织中 毛细血管通透性迅速增大。氧自由基可引起内皮细胞损伤从而产生毛细血管通透性增 加的一系列反应可加重胰腺的炎症反应。某些实验中，在诱导胰腺炎前加用自由基清 青岛大学硕士学位论文 除剂如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶可减轻组织损伤程度例，在体内实验中经腹腔注 射精氨酸复制成功的小鼠胰腺炎模型中有比较明显的MDA升高I”】。氧自由基几乎可 分子发生反应，但同多不饱和脂肪酸更容易发生脂质过氧以同所有的生物大 化反应【521。 多不饱和脂肪酸大部分位于细胞膜，当发生脂质过氧化反应后细胞膜变性，细胞最终 也会死亡【531。此外氧自由基可以刺激产生趋化因子导致白细胞向炎症组织聚集造成微 循环损伤瞰】，并且聚集的白细胞可以释放弹力蛋白酶等造成组织损伤，进一步激活核 转录因子系统加重炎症反应。 脂质过氧化反应及其产物不仅在急性胰腺炎早期起主要作用并且进一步加重病 就已有明显升高并在以后各时点均有升耐55】。Schoenberg等应用胆总管逆行注射牛黄 胆酸钠诱导急性胰腺炎模型同样发现明显升高以及还原型谷胱甘肽 reduced GSH 明显下降【矧。 glutathione Wisne，Guice各自在相关实验中对应用精氨酸腹腔注射诱导的急性胰腺炎模型应 用不同抗氧化剂预处理后进行对照均发现胰腺组织病理评分同未行预处理组有明显差 素A水平明显偏低【5吼。相关研究发现血中维生素C作为抗氧化剂在急性胰腺炎病人病 情发展中有明显改变【59】，【删。因此关于抗氧化剂对胰腺的保护作用以及急性胰腺炎病人 体内缺乏抗氧化物质进一步证实了脂质过氧化在急性胰腺炎中的重要作用。 显升高 班O(01 。两者同血中TNF一?变化水平有显著相关性。此结果进 一步说明在 MODS发展过程中胰腺随着机体内炎性反应的发展同样有明显炎症反应，脂质过氧化 在急性胰腺炎发生早期已经发挥作用并且进一步加重病情。我们对急性胰腺炎的致病 腺保护因素、病理过程将有更进一步的认识，同时为临床中MODS病人的胰以及抗氧 化剂对急性胰腺炎中的应用提供一定得理论依据。 实验中，模型动物在整个观测时间段中有明显的心、肺等器官功能不全的表现。 血中TNF(a浓度出现显著增高同代表各器官功能的指标变化相一致。同时，代表胰腺 炎症的观察指标 MDA及胰腺组织病理评分 同TNF(a浓度呈正相关。由此说明在 中胰腺存在明显的炎症损伤，这同体内内环境紊乱、炎性因子MODS的演变 大量释放 有明确的关系。因此，在临床救治重症病人特别是出现MODS的病人时，除对呼吸、 心脏和脑功能进行特别维护以及维持水电解质平衡和肝肾功能稳定以外，胰腺组织同 23 讨论 样需要予以保护，特别是抗氧化类药物的应用应该会对整个疾病有,定益处。 ‘ 4几个问题 整个实验过程中，在注重实验模型制作的准确性的同时，我们尽最大可能的维持 动物的生命体征避免过早死亡。虽然使模型同临床MODS病人表现在一定程度上有所 差别，但采集了更全面的数据为实验分析打下较好基础，同时为进一步研究如加用分 Adsorbent 子吸附再循环系统 Molecular RecirculatingMARS 以干预MODS System 模型发展过程的研究中为模型的建立、分组做准备。 关于第二部分胰腺炎所选定的指标中并未应用临床上常规的淀粉酶是因为淀粉酶 在胃肠道炎症中也会升高，而实验中首先应用“二次打击"方法制备成功了MODS模 型，在模型中已有明确的肠道炎症损伤的研究并且在此次试验中也明显的观察胃肠道 充血、肿胀，而为预防实验数据的偏差故选择更直观的病理学评分。另外一个较特异 的指标―脂肪酶因检测方法问题未选择。 24 青岛大学硕士学位论文 结 论 1、利用“二次打击"理论可成功制备MODS模型; 2、MODS模型中随着病理过程发展存在明显的胰腺炎症; 3、胰腺炎症同机体内MODS发展、炎性因子浓度变化密切相关。 参考文献 参考文献 failureafter ofmmA:an 1(TilneyNL，BaileyGL(MorganAP(Sequentialsystem rupture unsolved in care(Ann problempostoperativeSurg(1973，178:117―122( 2(Bane or failure:a the of AE(Multipleprogressive systems syndrome sequential 1970s(Arch975(11 1( surg(1 0 7 :779―78 of 3(American Chest ofCriticalCareMedcineConsensus College Physicians,Soc