【doc】胶体金标记抗体技术

【doc】胶体金标记抗体技术 胶体金标记抗体技术 《免痉学杂志》19曲年第5 胶体金标记抗体技术 任先平 湖北省卫生防疫站武汉 自1971年Faulk菩flJ首次报道胶体金 作为标记钧应用于免疫组织化学研究以来, 胶体金标记技术在生物学和医学研究的各个 领域内都迅速得到推广应用,成为把形态结 构和功能代谢的研究紧密结合在一起的最重 要的方法之一国外已有许多报道,近来也受 到国内的重视.本文简要介绍该技术的原 理,方法及其应用一 一 肢体盒标记抗体技术柏再曩和特意 胶体金印金的水溶液,由氯化金涪液在 还原剂作用下,使其金离子还原成金原子,从 而聚台形成特定大小的金颗粒,困其中正负 离子组成腔粒的双电层结构,而使溶胶处于 稳定状态,故称胶体金a). 腔体金颗粒通过 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的负电荷,能迅速 面稳定地吸附带正电荷的高分子物质(如抗 体分子,植镑凝集素和蛋白A等)而不破坏 其生物活性.因此,利用胶体金的物理和生 物学特性?首先标记上某些在光学显薇镜或 电子显微镜下可见的标记物,然后将其作为 探针去定位组织细胞内相应的抗原. 此技术与每内外已广泛采用的免疫荧光 法和免疫酶法相比较,具有下列优越性;染 色步募简便,不需用有致癌性的显色底物, 可同时应用光学显微镜和电子显微镑,电镜 下分辩率高,不影响原有超微结构的观察, 可进行多重免疫标记'敏感性均高于免疫荧 光法和免疫酶法,是迄夸最敏感的免疫细胞 化学方法. =,胺体盎的脚?方法 国矫已有许多报道,大致可分为两类: 分散法与凝聚法(也称还原法).目前多采 用后法制备金溶胶,现介绍如下方法; 1.白磷遗原,法gsigmondy1905年 报道了此方法.具体过程是l取0.01HAu C1.水溶液100ml,用0.2MK:CO3调节pH 至7.2,加热煮沸,在刚开始沸腾时,迅 速加入0.5mi自磷的饱和乙醚溶液,振摇混 匀,至溶液呈现橙红色对即可此法制得的胶 体金颗粒小,较均匀一致,直径为3n岵右. 但自磷易燃易爆,配制时应十分小心(.). 2.抗坏血酸还原法Stathis1958年 报道用此法制备的胶体金颗粒直径为8--13 tim将预冷至4?的1HAuC1'水溶液l m1,0.2MK:?j1.5rnl,双蒸水25mi混匀后, 搅拌下加入1mlO.7%抗坏血酸水溶液,溶 液印呈紫红色,然后再加入双蒸水~100mI, 加热至溶液呈红色为止【5). 3.构椽酸三钠还原法Frens1973年报 道I取0.01%HAuCI.水溶液100mi加热至沸 腾,迅速加入4mll拘橼酸三钠水溶液, 约5m{n后出现橙红色.肢体盒颗粒直径约 15nm.如将枸橼酸三钠的量分别减至1.5, 1.0或0.75ml,剐肢体金颗粒直径分别增至 约3050或60rim.按此法适当变换枸橼酸 兰钠加入量就可选择控静l金溶胶颗粒的大 小? 4.乙醇一超声波还原法Baigent等 1980年提出此法t将1%HAnCI.水溶液0.1 ml加入50ml~蒸水中,以O.2MKlCOj调节 pH至7.2,再加0.5m1乙醇,以20KC,125 W超声波探头侵入溶液振荡,制备的胶体金 颗粒直径为6,10nm(. 5.嘲氩化钠还琢法Trchopp等1982年 报道l在预冷至4?的40mlgg蒸水中,加入 0.6ml1%HAuCl'水溶液及0.2MKlCO 0.2ml,剧烈搅拌下,迅速加入新鲜配置的硼 氢化钠水溶液(0.5g/mI),重复3,5欢 加入,直至溶液颜色从兰紫色变为橙红色后 不再改变为止.继续搅拌5rain,所得胶体宝 颗粒直径为2,5nmc】. 6.鞣酸,枸橼酸纳还原法自Slot 1985年报道以来,该法已作为最常用方法之 一 .其优点是可根据鞣酸加入量来改变生成 胶体金颗粒的直径.具体方法:将1ml1 HAuCIl水溶液加入79m1双蒸水中混匀为A 液,另将4m1枸镩酸钠,一定量的l鞣酸和 l{4鞣酸体积的0.1MK:CO{混合双蒸水至2O ml为B液,两液同时加温至60~C,搅拌下将B 掖迅速加入A液,继续加温搅拌至溶液呈亮 红色.B掖中的鞣酸含量直接影响金颗粒的 直径,当鞣酸含量从0.O1ml增至4m1时, 金颗粒的直径由15:1m减至3.3?KCO的 用量对金颗粒的大小影响不大.值得注意的 是?所配试剂鞣酸溶液一定要避光保存;温 Y;,否则均会影响胶体金颗 度必须控制在60 粒的大小和均一性"). 制备金溶胶过程中,玻璃器皿必须绝对 干净,蒸馏水洗后作硅化处理.所有溶液都 应用双蒸水配制,并用微孔滤膜(0.45m孔 径)过滤,去掉水中的杂质,杂质污染有可 能干扰肢体金的形成.又匿氯{艺金为一高度 亲水性结晶化台物,故配制时宜将整安瓿内 含量一次配成1的水搭液,配制的溶液置 室温备用半年如出现少许絮状物,仍可使 用". 三,吱体金标记蛋白质 如前所述,胶体金与蛋白质的结台是通 过正负间的静电力所吸附,两者之间当达到 范得瓦尔引力范髓内而形成牢固的结台,本 结合是一种物理过程.因此,标记体系的pH, 离子浓度以及两者的比例均影响胶体金对蛋 白质的吸附". 1.标记体系的pH选择一般说来,当 pH值接近和稍硷于蛋白质的等电点时,胶 体金蛋白质的吸附力最强.反之,当胶体金 的pH值低于蛋白质的等电点时,则会聚集丽 失去结合能力.如在制备葡萄球菌A蛋白一 金(PAG)复合物时,A蛋白的等电点是pH 5.1,因此,在标记时,胶体金的pH值宜调至 5.8,6.1之间.但在制备抗体一胶体金复合 物时,则难以满足各种蛋白质分子的等电点 要求.最近有人建议在蛋白质与胶体结合时, 宜用最小的稳定量,从而保证在最佳pH值 和离子强度时,每一蛋白质分子能有尽量多 的点和胶体金颗粒界面接触(j'. 标记是否成功的另一重要因素是胶体金 与被标记蛋白质的用量比饲.其原理与确定 某种蛋白质保护金溶胶稳定性的金数相 同,即胶体金颗粒的直径越小,颓粒所具有 的总表面积就越大,加入的被标蛋白质量也 应越大.为了保证能获得最佳标记率,故最 好每次标记前都进行蛋白质的最小稳定量的 测定,可参照Horisber~er[d的方法进行; 将待标记的蛋白质逐级稀释后,各取等体积 按顺序加入一组装有等量胶体金的试管内, 并迅速混匀,使这些试管中的蛋白质含量逐 管递增,一般为5~Lg--4Obtg.另设一管不加 蛋白作对照.3,5rain后,再于每管加入1 mIlO%NBC1并迅速棍匀,放置5min一2h, 在580rim波长时测定其光密度.将各管的最 大吸光值绘成益线,取益线中晟早与X轴渐 进的一点,即为蛋白质能稳定胶体金的虽小 量值,只有达到这个标记比,才能较好地保 持标记物的稳定性(I". 2.胶体金一蛋白质复台物的分离扼忆 胶体金标记蛋白质后,必须进行纯化和浓 缩,以去除未参与标记的过量的蛋白质,宋 完全稳定的胶体金颗粒以及各种可能形成的 聚合物. 目前,有两种方法可用来纯化免疫胶体 金试剂t (1)超速离心法 离心的转速及耐问受肢体金颗粒大小以 64 及蛋白质的不同种类而异.如以牛血清蛋白 的稳定的胶体金标记革抗兔IgG,先低速离 心(20rim颗粒,用250g,5m用4800g) 20min,弃去聚集的胶体金颗粒的沉淀,然 后取上清液以60000g(5nm)或14000g (20nm)在4?离心1h'弃去上清,将沉 淀以原体积的0.02MPBSpH8.2(内含1 BSA)溶解,如上重复离心三次,最后将沉 淀溶于原体积十分之一的上述PBS中,并含 0.05的叠氮钠,保存于4?备用. 用不同方法制备的胶体金,根据颗粒大 小需采用不同的离心力和离心时间,如以自 磷还原法制备的5.9mn胶体一A蛋白,用 125000目抗坏血酸法制备的11.3rim胶体 金一A蛋白用50000gJ枸橼酸钠还原法制 备的15.5rim胶体金一A蛋白用15000g离心 45mln.为了得到颗粒均匀一致的免疫胶体 金试剂,可根据SlotC'所建议的用10~30% 蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心,分带收集 不同大小颗粒的胶体金标记蛋白制剂.此法 不仅具有制备量大,操作简便和获得率高等 优点,而且纯化的胶体金标记抗体颗粒直径 均一性好"". (2)凝胶过滤法 采用此法纯化胶体金标蛋白质,岿须选 用牛血清白蛋白作为稳定剂.将胶体金一蛋 白质复合物装入透析袋内,置硅胶中浓缩至 原体积的十分之一左右.用蒸馏水冲洗软化 透析袋后,取出浓缩以1500r/rain离C,15min. 上清用丙烯葡聚塘S一40O柱层析,拄床高20 cm,直径0.8cm,加样体积为拄床体积的十 分之一,以O.02MPBS浓(内含0.1%BSA及 0.05叠氮钠,pH8.2者用于胶体金标记 IgG,pH7.0者用于胶体金标记蛋白A)洗 脱,流速为8ml/h,按颜色深浅分管收集 流出液.首先流出的是较大颗粒的聚合物或 一 些杂质呈微黄色,中间流出清彻透明深红 色区带就是纯化的金标蛋白,最后流出的略 呈黄色的属未标记蛋白姐分.此方法用凝胶 层析代替密度梯度超速离心来纯化胶体会标 抗体,不仅降低成本,节省时间,且因胶体 金颗粒无离心后的聚集倾向,提高了制剂的 稳定性和染色质量.本法制备的胶体金标记 抗体,颗粒大小均匀一致,直径可在3.5, 18nm间自由选定,因而可用于电镜的多重 免疫标记,有很好的推广应用价值"". 3.胶体金标记蛋白质的鉴定纯化的 胶体金标蛋白质,主要鉴定其颜色,颗粒均匀 程度,平均直径以及进行免疫标记的特异性 和敏感性实验. 胶体金颗粒的水溶液颜色与其直径的大 小有关.颗粒越小,则其引起的散射光波长 越短.胶体金在波长5l0,550nm之间出现 最大吸光值峰,颗粒愈大,此峰愈向波长大 的一端移动.其颜色从橘黄色变至紫红色, 甚至棕色,颗粒形状和大小如变异太大或出 现聚沉则使吸光峰变宽. 胶体金标蛋白质的颗粒直径可在透射电 镜下测量,其方法是.用有支持膜的镍网 (普通铜网也可)沾取金标蛋白试剂,空气 中自燃干燥后,在电镜下观察胶体金颗粒的 大小及均匀度,计算100个颗粒的平均直 径''cJ.】. 胶体金标记抗体的特异性和敏感性测 定,可用免疫细胞化学滤纸模型鉴定,其效 率高且更为方便". 4.胶体金标蛋白质的保存胶体金标 蛋白质必须有少量电解质作稳定荆,但过量 的电解质可能导致溶腔失去稳定性而很快凝 结,故应去除多余的电解质.在活化后的胶 体金中,加入一定量的聚乙二醇后无菌条件 下,置4?可存放数月或一年以上".如 在胶体金中加入0.01NaNs维持其生物活 性达数年之久,如将其对45%甘油/磷酸盐 缓冲液透析后,冰冻保存时间则可更长ll. 四,应用 胶体金标记技术主要是用来进行免疫组 织化学和细胞化学方面的研究,即是把免疫 学中抗原抗体反应的高度特异性,敏感性与 组织化学中形态的可见性有机地结台起来, 从而可以在光镜及电镜下定性,定位乃至定 量研究含有抗原物质的组织,细胞及亚细胞 结构,把机能代谢研究与形态研究更紧密地 结台起来. 1.在光镜方面的应用 GeeghKen(I"等巳用于定量测定人外周 血液中B淋巴细胞的数量.也有人用胶体金 溶胶中的金能催化还原银离子的原理,结合 摄影显影技术,成功地用银显技术增强了金 标抗体在光镜下的可见性,运用于临床病理 诊断学中.徐玉会等于1986年成功地在光 镜水平显示了小鼠肝组织内的FN和LN(1. 2.在电镜方面的应用 Horisberger(和Nurden~.'用多标记法 分别观察了人的红细胞和血小板表面各种凝 集素的受体位置.Tanaka('用A蛋自一胶 体金复合物标记观察了成人T淋巴细胞白血 病相关抗原和成人T淋巴细胞白血病病毒抗 原在Mt一2细胞表面的分布情况.夏诗茂 等c2"利用此项技术在轮状病毒的形态发生 学研究上,揭示TRY许多新的生物学特性, 对巨细胞病毒结构蛋白的定位研究中,进一 步明确了CMV颗粒和致密体的膜结构具有 同一的抗原性}并对流行性出血热病毒结 构蛋白的定位和抗原特性进行了研究,均 获得了较强想结果.杨萍等("应用免疫胶 体金技术对神经胶质瘤抗原作超级结构定 位,对肿瘤标本进行了免疫电镜的研究. 近来Fuliton在mRNA亚细胞定位研 究中,把桉酸杂交技术与胶体金标记技术结 台起来,应用巳获得一些进展.可以预想t 随着对此次技术和研究不断完善,将会在生 物学,医学及遗传学上更为广泛的应用,从 而取代酶免疫和同位素标记技术. 参考文黛 1FaulkWet址Immunochem1971;&l嘴l 2F诎Wct址,NatureNBi瞳1971;231:101 1R(咖臣ct址HiBstXx~AcademicPT鞋 AmsterdanlNewO~or~l984 4HcMct址J盟qtod哪 !977;2295 SS蛐Fcct址JOlornlndl27=蠲0 6HMct址Histochem~l37 FrenQNatl~升1呱241:? &H姆M~dl197~,强253 qct址耐?曲l哑36【4):472 10.T~hcVp工ctaLProc??/AcSdUSAl9s王 79(23):7474 11.SlolJW,c【址Im扪氆?l9啦!5.383 12.Ml删曲Ex~tia19g,~38:l127 l玉馀玉会,等.腔体金免疫细胞化学技术讲义 武汉学院l9g7 14.G.o时??wnd址J]Sstot:h~Q阳 19722量llg7 15.岛眦JW,d址JOB_dl她l:9Q533 1&WangBaaled址Hi咖阳nl9数啦韶109 ld址CdlBiollmR印l她l;889 18.SlotIW,etaLAcadPressA时darn York,D~xt,1984 nG印曲印?WI),et址Imm衄oIgCOIII~U1978; 20.Nurde~AT,d址Expelientia19~0;365 21,Hofi蝴MctatjM娜1979,,115.97 22TmakaHctaLom甜P,~erch1%电44=瑚j 23馀玉会,等.JT0.1M.duniv1987;7【4): ?2—2昕 24豆寿菠,等.巾国学科学院19既9c1): 勋一53 25n1orIA且cIaL跚19847 矩工保乐.等.免疫学快报l985【5):37 丑杨萍,等.第州军大学1%瞬2): 1? 【收稿几期1嘲年S月20日)