【doc】蛋白质水解度的测定

【doc】蛋白质水解度的测定 蛋白质水解度的测定 l76中国油脂2OOO年第25卷第6期 文章编号:l003—_7969(2o?)06__ol76—02 蛋白质水解度的测定 一 T/J?——一f 摘要:介绍了一种新的测定蛋白质水tq-度的A-法,该A-法利用待测蛋白样品的完 全水解液做为 茚三酮比色的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 样品测定蛋白质的水tq-度,并和常用的几种测定水tq-度的A- 法进行了比较.该 种方法消除了由一种氨基酸做为时照样品所带来的测定误差.是一种简单易行的 测定水tq-度的A- 关键词:继;擞;监苛咱,三氧酸赫 中圈分类~:TQ645.99文献标识码:A 水解度是指蛋白质分子中由于生物的或化学的 水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例. 测定蛋白质水解度的方法很多常用的方法有三氯 乙酸沉淀法,三硝基苯磺酸法…1,茚三酮比色法,甲 醛滴定法【,pHslat[法等.甲醛滴定法快速简 单,但采用此法测定结果低于氨基酸理论含量_2j;茚 三酮比色法由于采用的是单一氨基酸做标准,而不 同的氨基酸对茚三酮的呈色度不同,因此采用茚三 酮比色法结果也有偏差_2;三硝基苯磺酸法测定的 结果相对较准确,但由于所用的试剂不易获得且分 析方法非常繁杂,通常情况下采用此种方法的还不 太多;现在有许多研究采用pH—star法,这种方法也 有误差,在工业生产中可用于监控水解终点,但在研 究中则需要用其他的方法进行校正. 本文介绍一种新的测定水解度的方法,本方法 采用茚三酮比色法,利用待水解原料的完全水解液 作为标准,消除了由于不同氨基酸与茚三酮结合产 物的呈色度不同对测定结果造成的误差,本方法是 依据Ojl1一YuncIl衄4J的方法和现行的方法进行改 进,使测定结果更接近真实值. 1原料和试剂 1.1主要仪器 751分光光度计,上海. 1.2试剂 1.2.1茚三酮显色液:2g茚三酮加入100ml蒸馏 收稿日期:?0—仿一lO 水,溶解,放棕色瓶中保存,应每次使用前配制. 1.22pH8缓冲溶液:0.2mlN2?94.7ml与 0.2molNaH2PO~5.3ml合并,混匀. 1.23其他试剂见有关参考文献. 13原料 1.31菜籽蛋白由低温脱脂菜籽粕制备,蛋白质 含量71.1%. 1.3.2蛋白酶Flavorzyrae,由Novo公司提供,活力 500MG/g. 2分析方法 21完全水解蛋白液的制备 取菜籽蛋白100rag,放人特制的反应瓶,加入 100ml6mol盐酸,拧紧瓶盖,放人l3o?烘箱中水解 24h,冷却,过滤,滤液真空浓缩至O5ml左右,加蒸 馏水90Illl,用1molNaOH中和至中性(pI-M),定容至 100ml. 22工作曲线的绘制 取完全水解液01ml一10ml于25Illl比色管 中,蒸馏水稀释至40ml,加pH8缓冲溶液1.0ml, 茚三酮溶液1.0ml,混匀,沸水浴加热15min,冷却, 蒸馏水稀释至25ml.570nm测光密度(水作参比). 另取100rag蛋白,加水100ml,振荡均匀后过滤,取 相应体积的滤液,按上述方法测光密度值.相同体 积样品的光密度之差与蛋白质量做工作曲线,取线 性部分做标准曲线. 2.3水解液水解度的测定 取水解后灭酶的水解液1ml,稀释至100ml,过 滤,取滤液1?Il,4ml(使测定值在工作曲线的线性 2OOO年第25卷第6期中国油脂177 部分),加水至4,加pH8缓冲溶液1.0ml,茚三酮 溶液1.0ml,沸水浴加热15min,冷却,蒸馏水稀释 至25ml,570I11"11测光密度(水作参比).另取相同浓 度未水解蛋白溶液1ml一4m1.按上述方法测光密 度,以二者光密度之差从工作曲线上查蛋白质含量, 按下式计算水解度: 腑(%)=××100 式中:A:查表得蛋白质的毫克数; :称样重(g); V,:水解液的总体积(m1); :显色时所用稀释液的体积(). 附裹不同的舅定方法舅定的水解液水解度结累 方法123 三氯乙酸沉淀法39.245.449.5 甲醛滴定法15.820.724.8 茚三酮比色法(亮氨酸做标准)15.521.824.9 茚三酮比色法(完全水解液做标准)17.524328.6 眭 样品号 一 三氯乙敦沉淀法 一甲硅滴定法 附囝不同方法测定的水解度 3结果和讨论 3.1结果 为了验证此种方法的可行性.本研究用Fla. v0对菜籽蛋白进行水解,用同一种水解液采用 10%三氯乙酸沉淀法,甲醛滴定法J,茚三酮比色 法和本文所介绍的方法分别进行测定,结果见附 图和附表. 3.2讨论 由结果可以看出,采用三氯乙酸沉淀法测定的 结果最高,这是由于三氯乙酸可溶物中除了氨基酸 外还有小分子的肽;采用甲醛滴定法和茚三酮比色 法(亮氨酸做标准)测定的结果基本相同;采用本文 所介绍的方法测定的结果高于甲醛滴定法和茚三酮 比色法;这是由于此种方法采用待水解的蛋白质的 完全水解液作为标准溶液,消除了由于蛋白质水解 液中不同的氨基酸对反应试剂的响应不同所带来的 误差.因此.采用此种方法测定的结果最接近实际 值.此种方法所用的仪器药品都比较简单,在一般 的实验室中都可以进行测定.本研究为蛋白质水解 度的准确测定提供了一种新的方法. 参考文献 [1]Alder—Nk,~nJ.D时既叫呲0ftheDee0froI0f FoodPl0t血nlyB日",Bby'rdr,iU,'dmn.mnes~odeAcid [J』.J.AcFoodCbem.,1979,27:1256--1262 [2]宁正样主编.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工 堆)业出版社,1998:1l9一l24 [3]AIde卜NimenJhmcH蚺.fFoodPl0t由lMj. 凸ApSciencePI1bIi静London.~986:i2一l4 [4]Qin?ylmChert.F,ffecl0fAmi&conteW~wheal皿enhy? &olysatesmthethemlalflavorm.pII.D?,Rut- 舭mty.USA.1995:54--56 DeterminationofHydrolysisDegreeofProtein CUO)【ing-feng (Zh~ngzhouGrainCollege,Zh~hou,450052) A 嘣:Awaytodeterminethehydrolyticdegxeeofproteinhydrolysates(DH)wasinvestigatedin thispa- per.Intheninhydrintest.s4tl~eeompletelyhydrolatedbyhydrochloricacidWastakenasaref erencesolution.Comparing withtheiL-~altsofseveralothermethodsusuallyusued,thismethodeliminatedthePxrorofus ingaminoacidastherefer- ellCe.whiehwascmT】口啪inthetmdationalway. Key_ords:pm~m;hydwlrsi~degree;determination