培养基的基本成分与作用

培养基的基本成分与作用 KKME---专业医学搜索引擎 培养基的基本成分与作用 有多种培养基用于支持哺乳类的配子和胚胎的体外发育，培养基的成分基本上为:水、无机盐、能量物质、氨基酸、维生素、核酸前体、蛋白质、生长因子(激素)、缓冲系统以及气体环境等，下面介绍培养基的主要成分。 (一)水 水是培养基的主要成分，约占全部组成的99%，水的来源和纯度是保证培养基质量的重要因素。已有实验证实，胚胎发育能力与培养基质量呈相关关系。例如Whittingham发现，小鼠的2细胞胚胎用3次蒸馏的水配制的培养基，发育至囊胚期的比例高于1次或2次蒸馏水配制的培养基。 可以购买超纯水或在实验室制备超纯水。蒸馏水制备过程中也存在一些干扰物质，比如用玻璃蒸馏装置，可能析出有害的离子。一般蒸馏水还可能含有致热原。为了保证培养基的质量，多采用Millipore-Q水纯化系统，在水质很差的地方，则宜先用蒸馏法生产初步纯化的水源，再经Millipoer-Q系统处理提供合格的超纯水。 实际工作中所有与配制培养基相关的器皿，如烧瓶、烧杯、量筒、药匙、吸管等除符合胚胎培养要求的一次性用品外，都应该先用超纯水反复清洗，再经过120?干烤灭菌后方可使用。 自制的超纯水需要常规检测的主要污染物包括:微生物含量、致热原、内毒素、pH值、电阻、可溶性硅酸盐及有机污染物。 KKME---专业医学搜索引擎 (二)盐/离子成分 胚胎培养基是以平衡盐溶液为基础的，典型的培养基包括:钠、钙、氯化物、钾、磷酸盐、镁、硫酸盐。临床IVF实验室所采用的各种培养基中离子种类和浓度差异很大。 在体外培养时发现，胚胎能够在很宽的离子浓度范围内表现正常的发育潜能，Wales观察小鼠2细胞胚胎在不同离子浓度培养基中发育至囊胚的能力，试图确定囊胚体外培养的离子浓度范围。结果显示，钾离子浓度为0.4,4.8mmol、镁离子浓度为0,9.6mmol、钙离子浓度为0.1,10.2mmol、磷酸盐浓度为0,7.2mmol时，早期胚胎均能发育形成囊胚，很难确定某种离子的最佳浓度范围。 培养基中各种离子的基本作用之一是维持一定的渗透压。动物研究发现，胚胎可以耐受渗透压在较大范围内变动，小鼠的囊胚能在较宽的渗透压范围(200,350mOsmol/L)内正常发育。但制备特定的培养液需要保持恒定的渗透压，常规的胚胎培养基的渗透压为275,295mOsmol/L之间，人类胚胎体外培养条件下最适渗透压仍未明确，常规IVF培养基选择的范围为284,286mOsmol/L。 (三)能量物质 人类着床前胚胎利用各种能量物质的能力，引起较多的关注。美国BarryBavister实验室和英国HenryLeese实验室研究表明，母体基因控制的早期胚胎主要以丙酮酸盐—乳酸盐为能量来源，随着胚胎发育的进展胚胎基因组激活后，则以葡萄糖为主要能量来源。受精液中葡萄糖至少为2.78mmol/L以保持精子的活力。 KKME---专业医学搜索引擎 小鼠实验结果与人类胚胎营养摄取的形式十分相似。卵子和合子摄入极少量的葡萄糖，当胚胎细胞形成紧密联结时，丙酮酸利用减少，葡萄糖成为优先利用的能量物质。合子开始分裂的最初3个细胞周期，胚胎由于糖酵解的阻断，没有能力利用葡萄糖作为能源，如果仅用葡萄糖作为能源物质，小鼠胚胎会发育阻滞。添加丙酮酸、乳酸或草酸后2细胞胚胎可以继续发育。 大多数胚胎培养基含有丙酮酸、乳酸、葡萄糖等营养物质或以血清成分的方式补充。必须注意这些物质的稳定性。葡萄糖在水溶液中是稳定的，但也给细菌提供了能量来源。丙酮酸在稀释的溶液中稳定性小，因此在最后完成培养液的配制或使用前加入最好。乳酸可降解为酪酸，注意选择适当的储存方法并确立终止使用的日期。 (四)氨基酸 氨基酸在溶液中能自发脱氨基，所以含氨基酸的培养基只能在有限的时间内培养以防止铵达到毒性浓度，因此培养基一般37?培养2,3天，含有氨基酸的培养基必须保存在2,8?。 卵子和胚胎本身维持着一个内源性的氨基酸池 (poolofaminoacids)，在不同发育阶段，具有特异性的氨基酸转运体系。经测定，已知输卵管液中存在相当高水平的自由氨基酸，因此推测，氨基酸在胚胎着床前、后时期发挥特定的生理作用。实验表明，在不含有氨基酸的培养基中，小鼠和人的胚胎完全能够发育至囊胚期，但培养基中加入氨基酸后，胚胎发育有所改善。人和小鼠输卵管液含有较高水平的谷氨酰胺。 KKME---专业医学搜索引擎 Bavister等研究了各种氨基酸对田鼠胚胎发育的影响，实验结果提示:天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸和牛磺酸均具有促进体外培养胚胎发育的作用;而半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸等则表现抑制作用。另外有研究表明，蛋氨酸等含硫氨基酸可以减少胚胎的凋亡并促进胚胎卵裂。 目前胚胎发育对特定氨基酸的需求仍不十分清楚。 (五)蛋白质 胚胎培养基中蛋白质有多种来源，包括脐带血清、母体血清、人血白蛋白制品及一些合成的血清替代品，浓度一般为5%,15%。脐带血清和母体血清中含有许多特性未明的成分，对胚胎发育的作用不确定，而且血清蛋白质往往吸附大分子物质，例如激素、维生素、脂肪酸以及金属离子、致热原等，同时这些物质在不同个体之间或同一病人的不同月经周期有较大差别。此外，母体血清中可能存在的抗精子抗体对体外受精和胚胎发育有负面影响，因此，目前已很少使用脐带血清和母体血清。常用人血白蛋白制品及血清替代品。血清蛋白虽然已是初步纯化的成分，但仍然混有脂肪酸和其他小分子等。不同来源的血清蛋白产品质量存在显著区别，因此使用血清蛋白时应首先筛查是否符合胚胎培养要求，待确定无副作用后再用于临床IVF。 培养基中蛋白质不仅是一种固定的氮源，而且也是作为一种消除毒性金属离子的螯合剂。Fissore等证实无蛋白质的培养基，如果加入10μmol的EDTA作为螯合剂，小鼠合子能够发育至囊胚期;而如果培养基中既不含有蛋白质又缺乏EDTA时，胚胎发育能力显著降低。 KKME---专业医学搜索引擎 (六)激素和生长因子 虽然小鼠囊胚有代谢外源性甾体激素的能力，在文献中几乎没有激素对早期胚胎直接作用的证据。有报道认为，催乳素(PRL)浓度为300ng/ml时，小鼠2细胞胚胎形成囊胚的比例有所提高。母体激素可能通过生殖系统的细胞进行协调，对发育中胚胎产生作用。研究发现，在未成熟卵培养中加入母体激素，如卵泡液、促卵泡激素、黄体生成素、人绒毛膜促性腺激素、雌激素等，可以提高卵母细胞的成熟率、受精率和发育潜能。 生长因子与着床前胚胎发育的关系是热门的研究课题。已从小鼠的胚胎细胞中发现类胰岛素生长因子-?(IGF-?)和胰岛素受体。胰岛素对胚胎具有促进有丝分裂的作用，以及促进RNA和蛋白质的合成。其作用部位主要限于滋养外胚层。Paria和Dey发现，EGF和转化生长因子-a(TGF-a)对小鼠2细胞阶段的胚胎有促进有丝分裂作用。LuoH报道在培养基中加入5ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)可以明显改善牛胚胎的发育和卵裂。MoreiraF报道在胚胎培养基中加入生长激素(GH)和胰岛素样生长因子-I(IGF-I)可以促进牛胚胎的发育，而且GH可能通过IGF-I而起作用。巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)能促进哺乳动物胚胎发育至囊胚阶段。因此，推测着床前胚胎可能含有特异的生长因子的受体。小鼠模型和临床实验中证实，在培养液中加入生长因子，胚胎发育速度明显加快，且囊胚细胞数增加，细胞凋亡减少。目前培养液中尚未常规加入生长因子。 (七)缓冲系统 KKME---专业医学搜索引擎 大多数胚胎培养基采用HCO-3/CO2缓冲系统维持生理pH7.2,7.4。培养基中含有NaHCO-3，必须在5%的CO2气体环境中以补偿外逸的CO2，防止培养基碱化。对哺乳动物细胞而言，HCO-3/CO2系统优点是属于生理性缓冲剂，主要缺点是当培养基置于空气中时，pH快速上升，如果操作时间延长，可能损害胚胎，影响胚胎的发育。针对上述特点，临床IVF工作时往往采用石蜡油覆盖培养液的方法以减缓气体的交换，或者预计操作时间较长的步骤，采用HEPES缓冲的培养液系统，这种培养系统可以不依赖于CO2环境而维持pH值的稳定。一般用HEPES取代20mmolNaHCO-3，仍保留5mmolNaHCO-3，原因是考虑到胚胎发育时需要利用碳酸氢盐成分。虽然关于HEPES毒性仍有争论，但实验表明，小鼠胚胎在HEPES缓冲的培养基中能够正常发育至囊胚期，临床上也已广泛应用。 (八)气体 在人类胚胎培养中，主要有两种气体培养环境:常用一种是5%CO2，其余为空气;另一种5%CO2、5%O2和90%N2的混合气体，称为三气培养。研究发现，三气培养有助于提高胚胎的质量。对小鼠、羊和牛等动物研究证实，将空气中O2的浓度(20%)降至5%,7%有利于胚胎发育。降低O2浓度可能减少超氧自由基的形成，已知后者与小鼠胚胎发育停滞有关。如果将胚胎暂时暴露于高氧环境，如20%O2中1小时，再放回到低氧环境条件中培养，胚胎受到不可逆的影响。人类胚胎培养一般采用5%O2浓度的低张力环境。CO2不仅用于维持碳酸氢盐缓冲的培养基pH，而且也是着床前胚胎合成蛋白质和核 KKME---专业医学搜索引擎 酸所必需的元素，CO2浓度宜使用5%或6%。另外，要保持CO2培养箱内的湿度，通常在箱的底部放置一层蒸馏水，蒸发的湿度可以达到80%。 (九)其他 近年来碳水化合物和黏多糖研究逐渐引起学者的重视，如透明质酸盐可以使蛋白更好地糖基化，这对改善胚胎的培养条件很重要。SimonA报道人类胚胎培养基中加入0.5mg/ml透明质酸代替人血清白蛋白进行胚胎移植，可以显著提高胚胎的植入率和妊娠率。 近年来胚胎微培养芯片(microembryoculturechip，MECC)成为胚胎培养系统的研究热点。微液流系统(microfluidicsystem)利用互相连接的微通道传送胚胎，通过控制微通道大小和压力，胚胎在通道的底部滚动，调节压力可以使胚胎到达需要的地方。该培养系统与传统的培养方法比较有以下优点:?MECC系统中胚胎和液体体积比更接近体内输卵管微环境;?MECC系统减少了对胚胎的损伤。在传统的培养中，胚胎需要更换几种培养液，每更换一种培养液，培养液pH、渗透压、温度和化学成分的变化都可能对胚胎造成伤害。而利用MECC培养系统，培养液和化学组成的变化是逐步的，模拟胚胎体内的生长环境减少胚胎损伤。?EMCC系统减少人为操作错误对胚胎伤害。 胚胎培养基和培养环境对胚胎的体外发育是非常重要的，尽管每个IVF实验室使用的培养基不完全相同，但其支持胚胎发育的作用基 KKME---专业医学搜索引擎 本相似，建立严格的质量控制体系对保证胚胎培养结果的稳定性和提高临床妊娠率非常重要。 大头医生