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百合的再生体系建立与FPPS基因的克隆

百合的再生体系建立与FPPS基因的克隆百合的再生体系建立与FPPS基因的克隆百合是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本鳞茎。百合主要用作观赏,可作鲜切花、盆花或直接在园林中栽培应用；其鳞茎具有食用与药用价值。中国是百合属植物的自然分布中心之一,野生百合在我国的分布范围很广,尤其西南和华中地区分布较多。木研究对我国长江中游地区野生百合资源进行了调查分析,并对其中两种野生百合—宜昌百合和卷丹建立了完整再生体系,为宜昌百合和卷丹的快繁和种质保存及基因工程研究奠定基础。为研究麝香百合花香机理,我们从麝香百合花瓣中分离出花香成分倍半萜烯类...

百合的再生体系建立与FPPS基因的克隆百合是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本鳞茎。百合主要用作观赏,可作鲜切花、盆花或直接在园林中栽培应用；其鳞茎具有食用与药用价值。中国是百合属植物的自然分布中心之一,野生百合在我国的分布范围很广,尤其西南和华中地区分布较多。木研究对我国长江中游地区野生百合资源进行了调查分析,并对其中两种野生百合—宜昌百合和卷丹建立了完整再生体系,为宜昌百合和卷丹的快繁和种质保存及基因工程研究奠定基础。为研究麝香百合花香机理,我们从麝香百合花瓣中分离出花香成分倍半萜烯类化合物前体法呢基焦磷酸酯合成酶基因(LIFPPS),并对该基因的表达模式和调控机制进行了研究。本文主要研究结果如下：1、长江中游地区野生百合资源调查经调查,长江中游地区有野生百合资源14个种和3个变种分布,即野百合(LiliumbrowniiF.E.BrownexMiellez)、百合(L.browniiF.E.BrownexMiellezvar.viridulumBaker)、宜昌百合(L.leucanthum(Baker)Baker)、渥丹(L.concolorSalisb.var.concolor)、有斑百合(L.concolor、滇百合(L.bakerianumColl.etHemsl)、大理百合(L.talienseFranch.)、药百合(L.speciosum、湖北百合(L.henryiBaker)、南川百合(L.rosthorniiDiels)、宝兴百合(L.duchartreiFranch.)、山丹(L.pumilumDC.)、川百合(L.davidiiDuchartre)、条叶百合(L.callosumSieb.etZucc.)、乳头百合(L.papilliferumFranch.)、绿花百合(L.fargesiiFranch.)和卷丹(L.tigrinumKerGawler)。对野生百合在长江中游地区分布现状、性状多样性及开发利用价值进行了分析,为百合新品种培育奠定基础；同时对长江中游地区野生百合资源的保护和合理开发利用提出建议。2、宜昌百合再生体系的建立(1)小鳞茎的直接再生：离体培养的小鳞片在诱导小鳞茎培养基上培养15-20d后就出现小鳞茎的分化,在MS+BA0.5+NAA0.培养基上,小鳞茎再生数最大达到3.07,鳞片的再生率最高为96.7%。在再生小鳞茎数上,鳞片与叶柄、叶片外植体差异极显著(p<0.01),平均每个鳞片再生的小鳞茎数最大,叶柄和叶片之间差异不显著。(2)愈伤组织诱导和再分化：离体培养的鳞片愈伤诱导率最高,其次是叶柄和叶片。对于鳞片来说,浓度为0.5mg/L的BA适合愈伤组织诱导,在培养基MS+BA0.5+2,4-D3.0上获得最大愈伤诱导率，为98.3%;叶柄和叶片在培养基MS+BA1.0+2,4-D1.0获得最大愈伤诱导率，分别为80.0%和79.6%；愈伤组织在培养基MS+BA0.5+NAA0.上分化小鳞茎数最多，平均每克鲜重愈伤组织可以分化出23个小鳞茎。(3)生根培养：小鳞茎在添加活性炭的生根培基上,小鳞茎的生根数较少,且根较长；在未加活性炭的生根培养基上,小鳞茎生根数多而短；1/2MS+NAA0.05:匕较适合小鳞茎生根。3、卷丹的离体再生(1)直接再生小鳞茎：鳞片更易再生小鳞茎,其次是叶柄,叶片在再生小鳞茎培养基上易褐化死亡,再生率很低。培养基MS+BA1.0+NAA0.3适合叶柄再生小鳞茎,叶柄的成活率为72.9%,平均每个叶柄诱导小鳞茎数为1。培养基MS+BA0.3+MAA0.5较适合鳞片再生小鳞茎，在该培养基上鳞片的成活率为97.8%,平均每个小鳞片诱导小鳞茎数为3.1。(2)小鳞茎增殖：培养基MS+BA1.0+NAA0.适合卷丹小鳞茎的增殖继代培养，最大增殖系数为2.5。(3)愈伤诱导：激素BAZT和KT与2,4-D的培养基组合不适合诱导卷丹愈伤组织。(4)生根培养：生长健壮的组培苗接入生根培养基MS+NAA0.1mg/L+0.05%AC,2周后长出白色粗壮的根,根长至1-2cm长时即可移栽。4、LIFPPS基因的克隆⑴应用RT-PCR和RACE-PC技术分离出麝香百合花中法呢基焦磷酸酯合成酶基因,命名为LIFPPS其全长为1267bp,具有一个1056bp的完整开放阅读框,编码具有351个氨基酸的法呢基焦磷酸酯合成酶蛋白,GenBank登录号为JF273657。序列分析表明丄IFPPS基因属于异戊烯基转移酶家族，与已知的其它物种FPPS基因同样具有高度保守的两个富含天冬氨酸的功能域，分别为FARM(DDXX(XX)D和SARM(DDXXD)结果表明，我们已经分离到麝香百合法呢基焦磷酸酯合成酶基因。⑵用实时定量PCR检测LIFPPS基因在不同时期的麝香百合花中的表达量，结果表明在麝香百合花的整个开放过程中丄IFPPS基因的表达量表现为蕾期表达量较高,花初开表达量降低,但随着花的开放又逐渐增大,然后在花授粉后又表现为逐渐下降的趋势。LIFPPS基因在麝香百合各花器官以及叶片中的表达量的结果表明,该基因在各花器官中的表达量没有显著的差异,与叶片中的表达量基本一致。(3)构建了LIFPPS的植物表达载体。利用酶切和连接技术把LIFPPS连接到pBI121(酶切去除GUS 报告基因)上。将载体质粒转化至农杆菌EHA105菌株中,获得了可用于转化的带有LlFPPS的工程菌

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