右美托咪定抑制HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤研究

右美托咪定抑制HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤研究右美托咪定抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤研究金莲锦　胡春阳　李罡　刘岩　李琳　温立勇【Summary】目的：观察右美托咪定（Dex）对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌功能、炎症反应及HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法：取75只成年SPF级10周龄雄性SD大鼠。运用可复性结扎LAD法建立心肌缺血再灌注损伤（MIRI）模型。随机均分为假手术组（Sham组）、Dex预处理+MIRI组（Dex组）、Dex+育亨宾+MIRI组（Dex/Yoh组）、育亨宾预处理+MI...

右美托咪定抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤研究金莲锦　胡春阳　李罡　刘岩　李琳　温立勇【Summary】目的：观察右美托咪定（Dex）对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌功能、炎症反应及HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法：取75只成年SPF级10周龄雄性SD大鼠。运用可复性结扎LAD法建立心肌缺血再灌注损伤（MIRI）模型。随机均分为假手术组（Sham组）、Dex预处理+MIRI组（Dex组）、Dex+育亨宾+MIRI组（Dex/Yoh组）、育亨宾预处理+MIRI组（Yoh组）与MIRI组（I/R组），每组15只。比较各组心肌梗死面积（IS/AAR）。运用ELISA检测并比较各组心肌组织与血清TNF-α、IL-6水平。采用Westernblot检测并比较心肌组织HMGB1、TLR-4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况。结果：Dex组、Dex/Yoh组、Yoh组及I/R组心肌组织与血清TNF-α、IL-6水平均高于Sham组，其中Dex组记录平均动脉压（MAP）、心率（HR）数值。将胸腔打开，位置为胸骨旁0.5cm，方向为沿着胸骨左缘3～4肋间，分离心包膜，寻找左冠状动脉前降支（LAD），用4-0慕丝线结扎LAD中上1/3，缺血成功的标准为心电图检查ST段弓背向上抬高，维持30min后将结扎丝线解开，再持续灌注2h。最后可见抬高的ST段回落。提示MIRI模型建立成功。1.2.2分组方法及处理75只大鼠随机平均分为假手术组（Sham组）、右美托咪定预处理+缺血再灌注组（Dex组）、右美托咪定+育亨宾+缺血再灌注组（Dex/Yoh组）、育亨宾预处理+缺血再灌注组（Yoh组）与心肌缺血再灌注组（I/R组），每组15只。Sham组只穿线不结扎。Dex组右颈静脉持续泵注Dex1μg/kg，10min+0.7μg/（kg·h），15min后制备模型。Dex/Yoh组经右颈静脉持续泵注育亨宾1mg/kg（kg·h）15min+0.5mg/kg（kg·h）20min。完成5min后给予Dex1μg/kg10min+0.7μg/（kg·h）15min后制备模型。Yoh组经颈静脉持续泵注育亨宾1mg/kg5min+0.5mg/（kg·h）20min后制备模型。I/R组直接制备MIRI模型。1.2.3心肌梗死面积检测（1）于再灌注结束时，将左冠状动脉前降支的结扎线重新结扎，待确定结扎确切后，经右颈静脉快速注射2mL2%伊文氏蓝，使正常心肌组织（蓝色）和缺血危险区心肌组织（未着色）显色充分。（2）肉眼观察缺血危险区显示清楚后迅速摘取心脏，用冰冻0.9%氯化钠溶液在冰上冲洗后剪除心房及多余的结缔组织，在-80℃冰箱中冰冻15min，沿左室长轴切成5片约2mm厚的薄片。（3）将切好的心肌组织薄片置于装满1%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液的6孔板中，使心肌组织充分浸于溶液中。于37℃温箱中孵育15～30min取出，用4%多聚甲醛溶液固定。（4）用照相机拍照，在图片中正常的心肌组织为蓝色，缺血危险区的心肌组织呈红色，梗死的心肌组织呈苍白色。通过相应软件计算心肌梗死面积，心肌梗死面积=缺血梗死区域苍白色的心肌组织/缺血危险区红色的心肌组织（IS/AAR）。1.2.4ELISA检测大鼠心肌组织、血清TNF-α、IL-6浓度（1）将5μL240、120、60、30、15、7.5ng/mL的标准品依次加入标准品孔中，将50μL待檢测大鼠心肌组织和血清样本提取液加入样品孔中，空白孔加双蒸水;（2）将50μLHRP试剂分别加入标准品孔、样品孔中;（3）以轻柔的动作摇晃，将封板膜盖上，在37℃恒温箱中进行1h孵育;（4）将封板膜小心揭掉，将孔内液体弃去。甩干后将300μL洗涤液加入每孔中，30s静置后弃去，重复5次后将孔内液体拍干;（5）将50μL显色剂A、B加入每孔中，振荡混匀，在37℃恒温箱中10min避光孵育;（6）将50μL终止液加入每孔中;（7）空白孔凋零，在450nm波长处对各孔OD值进行测量;（8）依据标准品OD值、浓度将标准曲线绘制出来，进而将样品浓度计算出来。1.2.5Westernblot检测HMGB1、TLR-4、MyD88、NF-κB蛋白表达组织块称重;利用液氮、研钵粉碎组织块;加入RIPA缓冲液（每克组织3mL RIPA），PMSF（每克组织30μL，10mg/mLPMSF），利用Polytron进一步匀浆（15000r/min，1min）维持4℃;加入PMSF（每克组织30μL10mg/mLPMSF），冰上孵育30min;移入离心管，4℃，15000r/min，15min离心;上清液为细胞裂解液，分装-20℃保存;取相同质量的细胞裂解液（体积×蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液;沸水浴3min。把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5mL移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。在凝胶和滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。将滤纸、凝胶、薄膜、滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。按照厂家所示接通电源开始电泳转移。转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。用100mL水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。膜置印迹缓冲液中于37℃保温1h。室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。5%脱脂奶加在装薄膜的袋中，于室温封闭1h。用总体积300mLPBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75mL。将稀释好的一抗加在袋内，于4℃孵育过夜。洗涤后加入HRP标记的二抗，于室温下摇动2h。洗涤后将等体积A液和B液加在膜蛋白面上并摇晃使其混合，1min后去尽残液，将膜蛋白面朝上放入荧光化学发光成像系统中进行显影和拍照，用凝胶成像处理系统进行分析。1.3统计学处理采用SPSS21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组心肌组织与血清炎性指标比较Dex组、Dex/Yoh组、Yoh组及I/R组心肌组织与血清TNF-α、IL-6水平均高于Sham组，其中Dex组

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