基因治疗靶向方法的研究进展

·综述· 作者单位 : 200092 上海交通大学医学院附属新华医院老年科 (高艳虹 ) ,消化科 (李定国 ) 通信作者 :李定国 , Email: dingguo_li@263. net 基因治疗靶向方法的研究进展 高艳虹 　李定国 　　靶向基因治疗是指将目的基因通过载体系统导入机体 , 并特异性地在靶组织细胞中以可调控的方式表达 ,达到治疗 疾病的作用而不影响其他正常细胞、组织或器官的功能。自 1990年第 1例基因治疗应用以来 ,基因治疗技术已在遗传、 代谢病和肿瘤等领域取得了较快的研究进展。但迄今为止 , 基因治疗的安全性和有效性仍是有待突破的“瓶颈 ”。其 中 ,基因治疗的靶向性是安全有效地进行基因治疗的技术关 键和研究热点。目前应用于基因治疗的靶向方法主要有 :基 因的靶向转移、靶向表达、原位修复和 RNA干扰技术定点整 合等。为此 ,现就有关问题进行综述。 一、基因的靶向转移 即借助载体系统对组织细胞的特异性实现目的基因的 定向转导。目前用于基因转导的载体分为病毒载体和非病 毒载体两大类。 1. 病毒载体 :病毒载体因有较高的基因转染效率 ,在目 前的研究中占有主导地位。在靶向治疗时 ,人们利用病毒蛋 白对某些人体细胞的特殊亲和作用而将目的基因特异性地 导入靶细胞中。如单纯疱疹病毒对神经细胞有天然的亲嗜 性 ,可用作治疗神经系统疾病的基因载体。然而 ,大多数病 毒感染的宿主细胞较广泛 ,为提高病毒感染靶细胞的特异 性 ,可在原来的病毒结构蛋白上接上一段具有特异靶向的抗 体或配体 , 目前应用较多的是单链可变区抗体 ,如 Martin和 Neil[ 1 ]设计的特异性靶向黑色素瘤的逆转录病毒载体在单 链可变区抗体传导下与肿瘤细胞表面的特殊抗原结合 ,明显 提高了载体的靶向性。 近年来 ,有研究者将基因治疗与病毒治疗的各自优势相 结合进行肿瘤的靶向 2病毒治疗。其基本方法是 :将有抗癌 作用的外源基因插入肿瘤特异性增殖病毒 (也称溶瘤病毒 ) 的载体中特异性导向肿瘤。这既要病毒载体本身能特异地 在肿瘤细胞内复制 , 杀死肿瘤细胞 ;又要携带的外源基因的 表达量能随病毒的复制和增殖而大大提高。构建肿瘤特异 增殖型病毒的方法很多。一种方法是将病毒复制在正常细 胞中所必需 ,而在肿瘤细胞中不需要的基因进行剔除。另一 种方法是利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必需的基 因 , 使病毒只能在肿瘤细胞中复制、增殖 [ 2 ]。基于此 ,有学 者采用野生型腺病毒构建的 ZD55及 Ad. TERT系统显示 , ZD55基因及 Ad. TERT基因在正常细胞中的复制能力比在 肿瘤细胞中显著降低 , 而基因的表达量却随感染肿瘤细胞 时间的延长而明显增加 [ 3, 4 ]。 2. 非病毒载体 :非病毒载体包括脂质体、多聚阳离子聚 合物、纳米粒、胶束、细菌或多肽和 (或 )蛋白等。目前主要 用于靶向治疗的载体有脂质体、多聚阳离子聚合物和纳米 粒。根据靶向方法原理的不同可分为被动靶向、主动靶向和 外延靶向。 (1)被动靶向 :载体进入血液后被人体的网状巨 噬系统细胞吞噬 ,将目的基因带到肝、脾等富含巨噬细胞的 器官达到对这些组织靶向治疗的目的。这是由载体的物理 特性所决定的。 (2)主动靶向 :许多细胞表面特异性地表达 或过表达某种抗原或受体。用相应的抗体或配体对非病毒 载体的表面进行化学修饰 ,利用受体 2配体或抗原 2抗体相互 作用的特异性 ,可把目的基因特异性地转导入靶细胞中 ,实 现载体的主动靶向 [ 5 ]。其基本原理是配基 /抗原与聚阳离子 偶联 ,利用阳离子与 DNA阴离子的相互作用 ,形成配基 /聚 阳离子 /DNA复合物 ;复合物通过配基与受体结合所介导的 内化途径进入细胞。最早采用的是肝细胞表面的唾液酸受 体。目前应用的配体有半乳糖、甘露糖、表皮细胞生长因子、 纤维细胞生长因子、转铁蛋白、RGD 肽、叶酸及各种单克隆 抗体等。 (3)外延靶向 :借助超声、磁性、pH值等物理手段 和载体本身的理化性质 ,将携带目的基因的载体特异性地导 入靶组织或细胞中。例如根据肿瘤组织 pH值比正常组织 低的原理设计的 pH值敏感脂质体可用于肿瘤的靶向基因 治疗。又如磁性纳米粒携带外源基因 ,体外局部施加磁场可 增强基因在局部组织器官的表达。应该指出的是 ,近年研究 较多的是超声技术。超声通过其空化效应可提高细胞膜的 通透性 ,促进外源基因进入细胞 ,增强基因在体外和体内细 胞的转染和表达水平 ,局部超声可增加基因转染的靶向性。 Anwer等 [ 6 ]经外周静脉注入阳离子脂质体 2DNA 复合物后 , 应用超声对小鼠肿瘤区进行照射 ,发现其在肿瘤的表达量较 对照组显著增加 ,且这种增强基因表达的影响仅限于超声照 射区。 病毒载体不仅有较高的基因转染效率 ,而且有实现外源 基因稳定表达的优势 ,故是目前基因治疗中应用最广泛的载 体类型。但因其有免疫原性、激活体内原癌基因的可能性而 存在安全隐患。近年来 ,病毒载体导致的基因治疗严重并发 症引起人们的忧虑 ,基因治疗将何去何从 ? 已成为科学家面 临的重大挑战 [ 7 ]。此时 ,非病毒载体开始受到关注。非病毒 载体具有对人体良好的安全性、易生产及包装量大等特点 , 但因其转染效率低、体内表达不稳定而曾长期被忽视。目 前 ,通过载体的修饰 ,并借助超声、磁性等手段增强非病毒载 体的靶向性、提高转染效率已成为研究热点 ,有良好的应用 前景。 ·234· 中华内科杂志 2006年 5月第 45卷第 5期 　Chin J Intern Med, May 2006, Vol 45, No. 5 二、基因的靶向表达 多数的载体并无组织细胞的靶向性 ,而通过调节目的基 因表达的空间或时间可实现靶向基因治疗。 1.调节基因表达的空间 :利用组织特异性的基因启动子 构建表达载体 ,虽然携带的外源性基因可转染多数细胞 ,但 仅靶细胞中存在特异的反式作用因子与组织特异性的基因 启动子结合后 ,才能激活外源基因的转录。然而 ,在非靶细 胞中外源基因表达不被激活。常用的组织特异性的基因启 动子多为肿瘤特异的基因启动子 ,如甲胎蛋白启动子、前列 腺特异抗原启动子、酪氨酸启动子及癌胚抗原启动子等用于 肿瘤的基因治疗。也有正常组织细胞中特异蛋白的基因启 动子 ,如降钙素基因启动子。 2.调节基因表达的时间 :由于某些疾病的基因治疗要求 目的基因在一定时间内和水平上进行表达 , 因而对目的基 因的表达时间和表达水平需要进行精确的调控。目前大都 是采用可口服的小分子药物 ,如四环素、RU 486及蜕皮激素 等控制一个经基因工程修饰的转录因子 , 进而开启目的基 因的表达。这个体系由两部分组成 :由针对目的基因 DNA 的结合区域、DNA激活区域和诱导药物作用区域融合而成 的转录因子 ;人工合成的含多个与 DNA 的结合区域结合位 点的启动子 [ 8 ]。这些小分子药物进入体内后 , 目的基因的 表达可在短时间内达到很高的水平 , 否则不表达或低水平 表达。有人在小鼠及非人类的灵长类的骨骼肌中成功地控 制了促红细胞生成素 ( EPO )基因的表达 ,即构建成功一种 纳巴霉素依赖性的转录活化因子控制靶基因 EPO的表达。 他们将含有转录因子成分的载体和含有 EPO 基因的载体同 时注入动物体内而不给予纳巴霉素时 ,动物的血浆 EPO 浓 度无变化 ,但给予纳巴霉素时 , 血浆的 EPO 浓度可增加 200 倍 ; 连续给药则可维持 EPO 浓度在高水平 ;不同的给药剂 量 ,血浆 EPO 浓度亦不同 ;一旦停药 ,浓度又会回落 [ 9 ]。 缺氧是一系列严重疾病的病理生理表现 ,如实体瘤、外 周动脉血管疾患、类风湿关节炎和糖尿病性视网膜病变等。 在低氧状态下 , 细胞的代谢可发生许多变化 ,很多基因的表 达会升高 , 因为在这些基因中都具有被称为低氧反应元件 (HRE) 的增强子序列。用 HRE构建的诱导载体在缺氧状 态下可以上调目的基因的表达。Boast等把荧光素酶基因置 于 HRE三聚体和 Molony小鼠白血病病毒 MoMLⅤ基因启动 子的调控下 ,在体外于低氧环境中转染乳腺癌细胞 T47D,结 果发现荧光素酶基因的表达水平比氧含量正常状态时的对 照组高 50倍以上。这类转录控制元件的使用较安全 ,一旦 病理状态消失 ,目的基因的表达也就停止 [ 10 ]。 三、基因的原位修复 人类许多遗传性疾病是由于单基因突变所致。在体细 胞中用野生的正常基因替换突变或受损的基因称原位修复。 传统的基因原位修复是通过基因重组进行 ,效率很低。最近 有人探索新的基因原位修复的方法 , 即采用三链形成寡核 苷酸、RNA /DNA嵌合分子 (RDO )和单链寡核苷酸 ( ssODN ) 进行基因原位修复。应该指出 :后两种方法具有巨大潜力。 RDO技术中人工合成一条含 68碱基的寡核苷酸链 ,可折返 形成假双链结构 ,“双链 ”中的一条为 DNA,另一条为含 DNA 与 RNA的杂合链 ,即中央为 5个脱氧核苷酸 ,两侧各有 10 个核苷酸的杂合链 , 2条链的两端有 4个 T相连。只有 2条 链中央的碱基与目标基因序列不配对 ,用以修复突变的基 因。有人报道在 RDO 实验中发现 ,仅用杂合分子中的 ssODN (中央含有错配碱基 ) 也可以修复质粒或基因组中的 特定突变 ,而且合成简单、费用较低及效率较稳定 [ 11, 12 ]。 RDO和 ssODN进行基因原位修复的分子机制远未阐明。目 前认为有 2个相互连续的步骤 : RDO 或 ssODN 与靶基因序 列形成异源双链 ;细胞自身修复系统识别错配并启动修复系 统。应用上述技术成功地纠正了多种组织细胞的多个致病 基因的少数碱基突变 (β2半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β2珠蛋白 及γ2珠蛋白、IX因子、载脂蛋白 E2、酪氨酸酶及肌营养不良 蛋白 ) [ 13, 14 ]。 基因原位修复无损基因组结构。无病毒载体所引起的 免疫反应不仅可校正隐性变异 ,还可以校正显性变异 ,尽管 其效率比病毒介导的基因增补要低 ,但修复后基因仍然受自 然调控因子长期稳定地调控。 四、基因的定点整合 过去几年中 ,在基因治疗临床试验中严重不良反应事件 的发生已成为人们关注的焦点。主要的原因是由于病毒载 体插入原癌基因的位置附近并激活原癌基因的表达 ,导致恶 性肿瘤的发生 [ 7 ]。促进外源治疗基因定点整合到宿主基因 的安全位点 (多为生物进化中的退化位点 ,与细胞增殖、肿瘤 抑制无关 ) ,既能克服随机插入导致的功能基因断裂、原癌基 因激活及染色体缺失等潜在危险 ,又可实现治疗基因的长期 表达。基因打靶技术是一种使基因通过同源重组按预期方 式改变生物体的遗传重组的实验手段。首先根据转基因受 体宿主细胞中特异染色体上特异位点的 DNA 序列特征 ,在 体外构建与此序列同源的、含目的外源基因并携带有一个或 几个条件选择标记基因的质粒载体 ,然后导入受体细胞 ,使 该质粒载体中含外源基因的同源区与受体细胞染色体特异 位点同源区进行同源重组 ,最后在一定的选择压力下 ,选择 出发生了同源重组的细胞克隆。定点重组酶在其中具有关 键作用 ,他们能识别宿主染色体的特异位点 ,并介导该位点 上的基因整合 [ 15 ]。定点重组酶多来源于细菌类原核生物 , 其中 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因的重组腺 相关病毒载体联合应用。先用 rep表达质粒转染 Hela细胞 , 再用重组腺相关病毒感染 ,通过 Southern杂交和荧光原位杂 交检测特定位点整合的情况 , 10个细胞克隆中有 7个克隆 报告基因整合到 AAVS1位点。 ·334·中华内科杂志 2006年 5月第 45卷第 5期 　Chin J Intern Med, May 2006, Vol 45, No. 5 五、RNA干扰 (RNA i) 所谓 RNA i是利用双链 RNA高效、特异地阻断体内特 定基因表达 ,促使其 mRNA降解 ,细胞表现出特定基因表型 缺失过程 ,即诱导特异基因的转录后沉默 [ 18 ]。外源性的或 细胞内源性的双链 RNA与细胞内的核糖核酸酶结合 ,然后 双链 RNA被核糖核酸酶切割成 21～25核苷酸长的小干扰 RNA ( siRNA) , siRNA双链结合一个胞质蛋白成分形成 RNA 诱导沉默复合物 (R ISC) ,随 siRNA解旋 , R ISC激活 ,活化的 R ISC通过碱基配对与同源性的 mRNA 结合 ,然后在距离 siRNA 3′端 12个碱基的位置切割 mRNA,从而使 mRNA降解 导致转录后基因沉默 [ 19 ]。因 RNA i对目的基因表达有高效 性、靶向性的抑制作用 ,已在基因治疗的研究中广泛开展 ,尤 其在病毒感染、肿瘤、遗传性疾病的治疗上显示出巨大的潜 力 [ 20 ]。目前 ,应用 RNA i可在培养细胞和动物疾病模型中有 效“沉默 ”疾病相关基因。 作为一项新兴技术 , RNA i较基因敲除技术简捷、经济 , 但这一技术尚存在一些缺陷 ,如它并不能使哺乳动物的特定 基因表达完全消除 ,且抑制效果也有赖于细胞类型和靶基因 的表达水平 , siRNA的大批量生产和向哺乳动物细胞的导入 等技术问题有待进一步完善。 六、展望 以病毒为载体介导转基因治疗的安全性问题已经成为 基因治疗走向临床应用的巨大障碍 ,它向从事分子生物学及 分子遗传学研究的专家提出了严峻的挑战。目前 ,基因定点 整合技术的发展是有望解决这一问题的手段之一。RNA i技 术则在沉默疾病相关基因方面有明显优势 ,因此也推动非病 毒载体研究的迅速发展。如何提高非病毒载体的转染效率 是亟待解决的问题。随着人们对病毒进入细胞机制研究的 不断深入 , 非病毒载体技术一定能得到不断的完善。此外 , 将不同的方法联合使用 ,扬长避短 ,也是提高基因治疗靶向 性与安全性的趋势之一。如有些学者试图在基因定点整合 中使用非病毒载体 ,既安全又可实现目的基因的长期表达。 我们相信 ,随着各学科间技术的相互交叉渗透 ,基因治疗的 靶向技术会向着高效、安全的方向不断完善。 参 考 文 献 1 Martin F, Neil S. 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(收稿日期 : 2005211230) (本文编辑 :游苏宁 ) 老年痴呆 (阿尔茨海默病 )及认知障碍百年纪念系列活动即将举办 　　随着中国经济的迅猛发展 ,生活质量提高 ,医疗水平进步 ,人均寿命相应延长 ,我们国家已经进入老龄化社会 , 与老龄相 关的脑功能障碍疾病逐年增多。据报道我国 65岁以上痴呆患病率 3% ～8% , 80岁以上患病率则达 30%以上。中国现有约 600万痴呆患者。今年是阿尔茨海默病发现 100周年 ,为了提高广大临床医师对痴呆及认知障碍的认识 ,提高临床诊断和治疗 水平 ,中国老年保健学会老年痴呆及相关疾病专业委员会 (ADC)与中华内科杂志将于 2006年 9月在北京组织老年痴呆 (阿 尔茨海默病 )及认知障碍百年纪念系列活动 ,届时将邀请国内外痴呆与认知障碍领域的著名专家进行讲座及研讨。会议征文 内容 :老年期痴呆流行病学、诊断、治疗、护理及痴呆患者照料者问题等文章。截稿日期 : 2006年 8月 20日。来稿请寄全文 (4000字左右 )和摘要 (1000字左右 )各一份 ,并同时邮寄审理费 30元。来稿应是未在杂志上公开发表者。会议接受网络投 稿 , Email: dingyunqiu@ cma. org. cn, 来稿请寄 :北京东四西大街 42号 中华内科杂志编辑部 丁云秋收。 ·434· 中华内科杂志 2006年 5月第 45卷第 5期 　Chin J Intern Med, May 2006, Vol 45, No. 5