[文章编号 ] 100820678 (2005) 0420362203 [中图分类号 ] R74718 R741102 [文献标识码 ] A
[基金项目 ] 本课
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
由第三军医大学校中青年基金资助 (资助号 :2003D090)
[作者简介 ] 邓志宽 ,男 (19652) ,江苏东台市人 ,临床医学博士后 ,副教授。主要从事缺血性脑血管疾病及高原脑水肿发病机制及防治研究。
[通讯作者 ] 钱桂生
血管内皮生长因子在高原脑水肿形成中作用的实验研究
邓志宽 钱桂生 3 黄桂君 3 赵世福
(第三军医大学附属新桥医院神经内科 , 3 呼吸内科研究所 400037)
关键词 血管内皮细胞生长因子 ; 高原脑水肿 ; 血脑屏障
摘要 目的 :探讨血管内皮生长因子 (VEGF)在高原脑水肿形成中的作用。
方法
快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载
:建立大鼠模拟高原模型 ,应用脑干湿重比率法定量
脑水肿情况、应用荧光素钠透过率测定 BBB 通透性、应用实时荧光定量 RT2PCR 法
检测
工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训
脑组织 VEGF mRNA 含量以及应用蛋白印迹
法半定量脑组织 VEGF含量。结果 :大鼠在高原 24 h 后脑组织含水率明显增高 ( P < 0105) ,荧光素钠透过率显著增加 ( P < 0101) ;
VEGF mRNA 转录及其表达显著增高 ( P < 01001) 。结论 :VEGF表达在高原脑水肿形成中起重要作用。
An Experimental Study on the Role of Vascular Endothelial Growth Factor in the Formation of High Altitude
Cerebral Edema DENG Zhi2Kuan , QIAN Gui2Sheng 3 , HUANG Gui 2Jun 3 , ZHAO Shi2Fu Department of Neurology ,3 Institute of Respiratory Disease ,the Second Affiliated Hospital ,the Third Military Medical University1 Chongqing ,400037 ,
China
KEY WORDS vascular endothelial growth factor ; high altitude cerebral edema ; blood brain barrier
ABSTRACT Aim : To investigate the role of vascular endothelial growth factor in the formation of high altitude cerebral
edema1Methods :Wistar rats were exposed to low2pressure cabin for 24 hours and mimiced high altitude of 7 000 meters1 The
ratio of dry and wet brain weight was calculated and the sodium fluorescein leakage was calculated to evaluate the cerebral
edema and the blood brain barrier permeability1 Also the brain tissue was processed for Western blots to detect VEGF
expression and for realtime quantitative RT2PCR to detect expression of VEGF mRNA1 Results :After 24 hours of rats exposed
in mimiced the high altitude of 7 000 meters ,The ratio of water content of brain tissue increased significantly( P < 0105) ,the
permeability coefficients of sodium fluorescein increased significantly ,too ( P < 0101) 1 Meanwhile ,it was observed that the
expression of VEGF2mRNA and VEGF increased more significantly (both P < 01001) 1 Conclusion :It is suggested that the
expression of VEGF involves in the damage of blood brain barrier and may play an important role in the formation of high
altitude cerebral ischemia1
在脑内 ,许多细胞成分均可表达血管内皮生长因
子 (vascular endothelial growth factor ,VEGF) ,如神经元、
星形胶质细胞及脑血管内皮细胞等[1 ,2 ] ,缺血缺氧可
诱导其表达增高。VEGF 是一种引起血管通透性增高
的重要细胞因子 ,病理情况下与组织水肿的形成有
关[1~3 ] 。研究表明 ,高原脑水肿实质上是一种缺氧性
脑水肿 ,到目前为止 ,其发生机制仍不清楚。以往临床
影像学研究及动物实验均显示高原脑水肿是一种血管
源性脑水肿[4 ] ,而 VEGF 表达增高所导致的血管通透
性增高符合其发生机制 ,因此有理由推测高原脑水肿
的发生与 VEGF 有关。本研究拟通过建立大鼠高原缺
氧模型 ,观察其脑水肿的发生与 VEGF 表达的关系 ,以
阐明 VEGF 在高原脑水肿形成中的作用。
材料与方法
动物分组 清洁级健康 Wistar 大鼠 30 只 ,雌雄不
拘 ,体重 150~200 kg ;月龄 115~2 个月 ,随机将大鼠分
为对照组及高原组。每组 15 只。
·263· Chin J Clin Neurosci 2005 ,13 (4) ,362~364
模型建立 参考 Yang[5 ]等方法建立模拟高原模
型。大鼠置入自制的高原低压舱内 (由高压蒸气灭菌
器改制) ,低压舱内径 018 m ,长 112 m ,用 2X21 型旋片
式真空抽吸泵抽吸舱内空气 ,真空监测表监测舱内压
力。以 10 m·s - 1的速度匀速上升 ,达 7 000 m 海拔高度
(舱内压力 6014 kPa ,氧浓度约 717 %) ,室温在 22~
28 ℃,每天光照与黑暗各 12 h ,供给足够饲料及自来
水 ,从观察窗观察大鼠活动情况。对照组不进行任何
处理。
脑组织含水率的测定[6 ] 高原组在模拟高原低压
舱内维持 24 h 后以 15~30 m·s - 1速度匀速下降至平
原取出动物 , 315 %水合氯醛 ( IP) 深麻醉 ,随机取 5 只
迅速断头取前脑 ,滤纸吸去脑表面血液 ,用锋利刀片冠
状切为相似厚度的 4 片 ,轻轻挤压并吸去流出的脑脊
液及血液 ,置于已称重的具塞玻璃试管内 ,用电子天平
称湿重 (精度 011 mg) ,然后放入 95 ℃恒温干燥箱内 ,
烘烤 48 及 72 h 后 ,称干重至重量不再下降 ,应用 Elliot
公式计算含水百分率 :含水率 ( %) = (湿重 - 干重) / 湿
重 ×100 %。对照组则随机取 5 只进行上述处理。
BBB通透性的测定[ 7] 高原组及对照组随机各
取另 5 只动物经尾静脉注入 1 mL 荧光素钠 PBS 溶液
(6 mg·mL - 1) ,30 min 后 ,经左心室灌注 4 ℃磷酸盐缓
冲液 (0101 mol·L - 1 PBS ,pH 7125~7135) 250 mL ,断头
取全脑。将脑迅速投入液氮内 5 min。在冰冷条件下
用锋利刀片切成 3 mm 厚的冠状脑片。取感觉皮质所
在脑片约 500 mg ,称重后 ,加入 015 mol·L - 1硼酸缓冲
液 (pH = 510) 5 mL 中匀浆 (4 ℃下 ,300 r·min - 1离心 15
min) 。取上清液 1 mL 移入另一离心管内 ,加入 015 mL
无水乙醇 ,混匀。室温放置 15 min 沉淀蛋白 ,4 ℃下 ,
13 000 r·min - 1离心 20 min ,取上清液。用 LS50B 型
Luminescence Spectrometer ( Perkin Elmer 公司 ,英国) 在
激发光波长 330 nm 及散射光波长 485 nm 处测定其荧
光强度值 (FI) 。
以相对荧光单位 ( rfu) 表示每毫克脑组织中荧光
素钠的含量。计算方法 :相对荧光单位 = 5 ×FI/ 脑组
织湿重 (mg) (rfu/ mg) 。
VEGF mRNA转录及其表达的测定[ 8] 高原组及
对照组各取其余 5 只动物断头取前脑 ,冰冻条件下用
锋利刀片连续冠状切片 ,切成3 mm左右厚的脑片 ,将
感觉皮质区脑片从中线切开 ,左侧取约 100 mg ,提取总
RNA ,用 UV/ vis Spectrometer (LamdaB1020 型 ) ( Perkin
Elmer 公司 ,UK)测定 260/ 280 nm 处的吸光值鉴定其纯
度及含量 ,将 VEGF cDNA
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
品 (上海博亚生物技术
有限公司 ,中国)稀释成 1 ×107/μL、1 ×106/μL、1 ×105/
μL、1 ×104/μL 及 1 ×103/μL 作为标准参照 ,在 RG23000
仪上进行 VEGF mRNA 荧光定量 RT2PCR 检测 ;具体操
作步骤参照 SYBR Ò Green Quantitative RT2PCR 试剂盒
(Sigma 公司 ,美国)
说明书
房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载
进行。结果以kCopies/μg表
示。
右侧取约 100 mg ,提取总蛋白质 ,用 Lamda Bio20
型 UV/ Vis spectrophotometer (Perkin Elmer 公司 ,英国) 测
定蛋白质含量。
VEGF 蛋白印迹检测 ,应用 1∶300 稀释的抗 VEGF
抗体 (Promega 公司 ,USA) 特异性结合 ,生物素酰化抗
兔 IgG(Sigma 公司 ,美国) (1∶500) 为第二抗体 ,亲和素2
生物素酰化的辣根过氧化物酶溶液 (Sigma 公司 ,美国)
(1∶500) 为第三抗体 ,DAB 显色液显色。最后 ,应用
Microtec ScanMaker E6 系 统 扫 描 , ImageMaster VDS
Software 210 测定各显色条带的积分吸光度值。每条
带测定 2 次 ,取其平均值。结果以 A/μg 表示。
统计学处理 上述所得含水百分率应用秩和检验
(Mann2Whitney U test) 检验组间差异显著性。其余应
用 Student’s t test 分别检验各组之间差异的显著性。
以 P < 0105 作为显著性标准。
结 果
高原组大鼠在高原 7 000 m 24 h 后其脑组织含水
率明显增高 ,与对照组比差异有显著意义 ( P < 0105) ;
其荧光素钠透过率显著增高 ,与对照组相比差异有显
著意义 ( P < 0101) ;其脑组织内 VEGF mRNA 转录明显
增加 ,与对照组比差异有极显著意义 ( P < 01001) ;
VEGF 表达显著增高 ,与对照组比差异有极显著意义
( P < 01001) ,见表 1。
讨 论
有证据显示[4 ] ,高原脑水肿的实质为血脑屏障
(BBB)功能或结构的障碍 ,导致血管通透性增加 ,形成
血管源性脑水肿 ,到疾病晚期 ,也可伴细胞毒性脑水
肿。虽然国内外已对其发生机制进行了多方面探讨 ,
如高原缺氧可使脑毛细血管压增加 ;导致血管机械性
渗漏[5 ] ;低氧性血管舒张 ,可引起脑血管自动调节能力
丧失 ,血管渗漏增加 ,其他如氧自由基、兴奋性氨基酸
以及低氧诱导的化学介质如缓激肽、组胺、一氧化氮、
花生四烯酸等的释放也可能参与高原脑水肿发病机
制。但到目前为止 ,对于引起高原脑水肿的确切原因
仍不清楚 ,因而缺乏有效防治措施。
·363·中国临床神经科学2005 年第 13 卷第 4 期
表 1 高原状态下大鼠脑组织含水百分率、荧光素钠透过率、VEGF mRNA转录及其表达的变化
Tab 1 The changes of brain water percentage , sodium fluorescein leakage( SFL) and the expression of VEGF mRNA and its protein in
rats exposed to high altitude
组别
Group
含水百分率
Water percentage ( %)
荧光素钠透过率
SFL (RFU)
VEGF mRNA
(kCopies/μg)
VEGF
( A/μg)
对照组 Control 7614 ±110 551 ±58 2214 ±218 1 900 ±208
高原组 HA group 7910 ±111 3 660 ±27 3 3 3719 ±415 3 3 3 3 817 ±722 3 3 3
t 11984 (u) 41155 61518 51702
P 01047 01002 01000 01000
3 P < 0105 ; 3 3 P < 0101 ; 3 3 3 P < 01001 与对照组比较 3 P < 0105 ; 3 3 P < 0101 ; 3 3 3 P < 01001 vs control
近年来 ,VEGF 的释放在高原脑水肿发生中的病
理作用受到特别关注。低氧可诱导脑组织内 VEGF 基
因的转录和其表达增加 ;VEGF 是一种促进血管再生
的因子 ,低氧情况下其表达增高参与脑对低氧环境的
适应机制 ;但由于其可导致血管通透性增加[7 ] ,强效促
进血管渗漏[8 ] ,因而其释放增加可能引起 BBB 通透性
的改变 ,导致脑水肿 ,且这种水肿属于血管源性 ,与所
观察到的高原脑水肿的表现形式一致。基于该推测 ,
用小鼠进行实验[6 ] ,观察到模拟高原低压低氧可使小
鼠脑组织内 VEGF 表达显著增高 ,其增高程度与脑水
肿一致 ;如果应用 VEGF 抗体预先注入小鼠腹腔内 ,以
阻断 VEGF 作用 ,几乎可完全预防血管源性脑水肿的
出现 ,研究证明 VEGF 表达增高参与高原脑水肿的形
成 ,且可能是其关键原因。本研究建立模拟高原大鼠
模型 ,从 VEGF 的转录、表达、血管渗漏及脑水肿的形
成各个层次 ,阐明 VEGF 在高原脑水肿形成的作用。
本研究结果显示 ,大鼠在模拟高原 7 000 m 状态、
24 h 后其脑组织含水率显著增高 ,表明其出现明显高
原脑水肿 ,而荧光素钠透过率也出现显著增高。荧光
素钠是一种大分子物质 , 正常情况下难以透过
BBB[7 ,9 ] ,只有在 BBB 出现明显损害情况下 ,其透过率
才会明显增加 ,且其增加程度与 BBB 的损害程度一
致 ,结果表明高原脑水肿的发生伴随着 BBB 通透性的
明显损害。在高原脑水肿发生的同时 ,可观察到脑组
织内 VEGF mRNA 转录及 VEGF 蛋白的表达显著增加 ,
其增加的幅度与 BBB 损害程度一致 ,证明 VEGF 在高
原脑水肿的形成中起着十分关键的作用。
VEGF 表达增高导致 BBB 血管通透性增加的机制
尚不清楚。BBB 的血管通透性取决于 BBB 内皮细胞
间紧密联接 ( tight junction , TJ ) 蛋白复合物的完整
性[10 ] 。有研究显示 VEGF 可使 BBB 内皮细胞间 TJ 蛋
白磷酸化 ,表达降低 ,并出现排列紊乱 ,导致血管通透
性增加[11 ] ,正常情况下 ,这种改变可能与高原缺氧的
适应机制 (如增加血管再生 ,使脑血供增加)有关 ,并不
引起明显的脑水肿 ,但在严重缺氧、缺氧时间较长或存
在其他导致 VEGF 表达增高的生理或病理因素 (如寒
冷、应激、感染等)下 ,其表达过度 ,则 BBB 的结构严重
损害 ,其通透性显著增高 ,大量血浆内有机成分和大分
子进入脑组织间质内 ,从而引起明显间质性脑水肿 ,这
也解释了进入高原后仅部分人群发生高原脑水肿的原
因。
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(2005204208 收稿 2005207218 修回)
·463· 中国临床神经科学2005 年第 13 卷第 4 期