小鼠牙乳头间充质细胞自发牙向分化及相关基因表达分析

小鼠牙乳头间充质细胞自发牙向分化及相关基因表达分析 四川大学学焉医学版。。小鼠牙乳‘,,,,,,,,,,,,,,,,,,,—,…’……, ,,,,,,’,’’,,’,,’充胞自牙向分化及相基因表达分析朱蓉蓉吴凌刘磊田?四 川大学西口腔医院口腔疾病研究国家重点室成,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 都南京大学医学院附属口腔医院面外科南京大学医学院附,,,,,,,,,,,, 属口腔医院修科四川大学西口腔医院面外科【摘,,,,,,,,,,,,,,,,,, 要】目的察小鼠牙乳充胞在血清培基中的自,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,牙向分化并其特异性牙向和骨向分化的相因子 的基因表达行分析。方法取孕胎鼠的原代牙乳,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,充胞分在含血清培基和添加白血病抑制因 子的血清培基中代培察胞是否出成牙本胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 表型分化并牙向分化表型和持未分化表型的胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 的特异性因子的表达情况。果血清培基培,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 的牙乳充胞可在第代后自分化成牙本胞表,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 型而添加的含血清培基可使小鼠牙乳充胞的未分化,,,,,,,,,,,,,,,,,, 表型定至第代无胞是否出牙向分化表成牙,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 充胞特性的、、均有表达而成牙本,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞表型分化后尚能到、、等启向化胞 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,末分化的特异性基因表达。牙乳充胞的自牙向分化 模型可作其他成体充干胞牙向分化的阳性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 照其基因表达模式可研究其他成体干胞牙向分化后在,,,,,,,,,,,,,,,, 基因水平上的化提供佐。【】小鼠牙乳充,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 胞白血病抑制因子牙向分化基因表达【中分号】,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,??,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,?阢,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,。 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,。 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,【 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,成牙本 胞合成和分泌的牙本是构成牙体的主要成部分。研究,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,牙髓干胞等成体干胞可被分化成牙本胞 ‘?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,。但是于影响成牙本胞分化的因素尚不清楚。 牙乳国家自然科学基金批准号、中国博士后科,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 学基金和教育部重点研究目助?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,??,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,充胞是牙胚育程中唯一可分化成牙本胞的充胞群 作成牙的前体胞其在体外研究充胞向成牙本胞分化的因素提供了,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,一越的照模型。本研究通建立牙乳充胞自成牙分化的模型,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,并探其牙向分化后相基因的表达情况旨在一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,研究成体干胞牙向分化步 后在分子和胞水平上的化提供佐。万方数据材,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,料和方法材料周雄性及周雌性昆明小鼠由四川大学物中心提供,,,,,,,,,,,—,,,培基 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,准型胎牛血清自美国公司胰蛋白、白血病抑制因子。自美国 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,公司鼠抗波形蛋白克隆抗体自丹麦公司抗角蛋白 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,多克隆抗体自北京中杉金公司羊抗鼠牙本涎蛋白多克隆抗体自美国 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,公司小量胞抽提盒上海舜生物工程有限公司 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,立陶宛公司、 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,北京天代科技有限公司一常美国公司凝胶成像系美 国公司。胎鼠牙胚的取及牙乳充胞的原代培将周的雄性昆明小鼠和—,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 周的雌性昆明小鼠按照的比例在傍同第清晨察雌性小鼠道口有无白,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,色胶道栓形成有道栓形成的孕。死孕鼠取出小鼠胚胎在体式解,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,剖微下解离鼠胚下突出于陷中的磨牙牙胚将从同一只孕鼠来源的小鼠,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胚胎中取出的数个磨牙牙胚碎后均匀涂布接于培瓶底部隔不超,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,反培瓶?、、和湿度,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,培基正培瓶条件下培后再加入含有的 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,培内勿翻培瓶以免从瓶底脱落。后行首次液同察周 爬出的胞形。牙乳充胞的代化及自牙向分化察,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,待原代培的各个 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,周爬出的胞合成片后始首次代。倒去原瓶中的培基加入液漂洗 注意不要将,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,壁的洗脱落。加入胰蛋白置于?孵箱中消化倒置微 下察到大部分胞从瓶底,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,脱落立即用含血清培基止消化将消化下来的胞 分,,‘,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,个。平均接到两以两个培瓶中。?、。、和湿度条件下静置倒 置,,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,培基培微下察到大部分胞另已壁一后倒去培基一加入含 ,,,—,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,加入含、。的培基培。待两胞生至占瓶底面的可再次代 以后两,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞再代均采用上述差速消化和差速壁化法去除上皮胞。察两胞每次,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,代后的形学特征制作两胞在代次以后的各代胞爬片多聚甲固定后行、、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,免疫胞化学染色采用法色。牙乳充,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞牙向表型分化后的基因表达分析取已自牙向表型分化及持未分化状的第代牙乳充胞按照盒明,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,提取胞的立。即用逆反步操作 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,合成第一得到模板置于一?冰箱保存用。根据小鼠、、、、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,、、、知、基因序列以看家基因作内参照引物。正向引物反向引物及,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,期物度如附表所示。引物均由上海英生物技有限公司合成。以由,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,逆得到的第一模板行反增个循后取肛反物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,脂糖凝胶泳察并照相目的基因的表达。附裹引物序列、退火温度及,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,期物度 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,”,“,…,””,,。。? ,,,,,,—,,,,,,,,,,,,,万方数据四川大学学医学版年第卷第期果胎鼠 牙乳充胞的法培的鼠胚,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,已育成形下突 基本骨化牙胚表面被,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,覆一透明的口腔上皮。 牙胚采用,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,法培后可牙胚周爬出了两形的 胞。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,路石生的上皮胞着牙胚而牙乳来源 的充胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,呈梭形或多角形从中游出后呈放射 状分布在上皮,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞的周可正从游出后位于上皮 胞表面的充胞。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,两形的胞界限清楚位于上 皮,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞外周的牙乳来源充胞范逐大数个 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,爬出的充胞很快生接成片。小鼠牙乳充 胞的代化及牙向表型分化,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,根据差速消化和差速 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,壁化法代后得到的胞以充胞主只少量 上皮,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞多次代后可以得到胞形一、度高 的牙乳充胞第代胞中有个胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,免疫胞 化学染色阳性第代牙乳充胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,免疫胞化学染色阳性而,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,免疫胞化学染色性。没有添加的 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞在代至第代以后可部分胞聚集成出极化 胞体,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,伸出多个的胞突呈成牙本胞改免 疫,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞化学染色阳性棕黄色。添加的胞代至 第代仍未胞形有明,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,改仍呈多角形或梭形免疫 胞化学染色性。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,圈壁后爬出的上皮胞和充 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞相差微圈牙乳充胞分化成牙本胞 后染色阳性倒置相差,,,微×,,,,,,,,,,,,,,,,以持未分化表型的牙乳充 胞染色性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,倒置相差微 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,×,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,×—,,,牙向分化相基因的表达果。自成牙分化的第代牙乳充,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 胞阳性表达尸、、、、、、、口、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,而持未分,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,圈牙乳充胞分化成牙本胞后 和以堆持未分化表型的牙乳同充胞的基因,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,裹达 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,?? ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,万方数据化表型的牙乳 充胞阳性表达、、、、未到、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,、、等相基因表达。既往大多数牙 乳充胞的取材来源多,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,新出生物而此期 牙胚已,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,育至状期甚至末分化期部分牙乳充 胞已分化成牙本胞、牙髓成胞等由,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,此所培的牙乳充胞 的度,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,以得到保。本研究胎鼠的牙胚作取材象是因此牙胚恰育至帽状期,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,。此采用机械法取材准确可行既避免了早取材牙胚与突不易分离致取材困,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,不准确又避免了取牙胚部分牙乳充胞已出末表型分化而,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,来的培胞性混。牙乳充胞来源于由神胞迁移至面突的外胚充胞群是牙胚育程中自然牙向分化成牙本胞、牙髓胞的上,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,游干,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞。由于血清成份含有多未知的生因子干胞在含血清培基中体外培常常可出自分化,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,象如神胞在含血清培基中可自向神胶胞分化‘,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,。可以胞的增殖、分化和表型如小鼠胚胎干胞表面 有多的,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,受体与特异性合后可表出胚胎干胞的分化抑 制并且遵从度,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,依从性条件下可明抑制胚胎干胞的分化。 本中,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,以加入含血清培基可使小鼠牙乳充胞的未分 化表型定至第代血清培基培的牙乳充胞在,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 代后自分化成牙本胞表型。明体外培的牙乳,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,充胞不定向后可向成牙本胞分化而且在 含血清培基中可自分化成牙本胞。一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,明了步 蕾状期后牙胚成牙的信号已,,,,,,,,,,,,,,,从牙源性上皮至牙乳胞中 同牙乳胞中的成牙,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,信号已启可不依于新的信号通路直接牙向分化。在含的血清培基中牙乳胞可持其未分化表型,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,我推小鼠牙乳充胞表面可能亦有多的,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,受体与特异性合后可阻断成牙信号的放大从而抑制了其自牙向分化的能力。已知一些具空,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,表达特征的因子是牙胚育程中充胞分化成牙本胞及其前体胞的主要,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,控因子其中既有启化程所必需的特异性因子,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,如【也有与胚胎育分化系密切的同源异型盒基因家族成如族,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,、族等。和相互作用在水平的表达并可通形成蛋白合物,,,,‘,,,,,,,,,,,,,。作同源构决定牙胚育程中从蕾状期渡至帽状期域蛋白 的家,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,族一局限性的在第一腮弓和前基底表达并且在牙胚的育尚未始之前,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,的表达已格限制在将来形成牙的充胞中。。目前因子 在牙充胞中的,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,共同表达的特点具有唯一性因此可作成牙的充胞区于其他胞的特异性。本研究中,,,,,—,,,,,,,,,,,,,的果印了在牙乳充 胞中同源异型盒基因家族中的因子、、均有,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,表达而无胞是否,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,已出成牙本胞表型分化。 也表明它,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,的控作用生于牙乳充的上游而非牙 乳充胞向成牙本胞分化的程中。在成牙,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 本胞分化同到了、、、等相基因,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,的表达。在牙胚育程中的表达,,,,,,,,,,,,,,,,,,具有空特异性它主要 在部分前成釉,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞、前成牙本胞和成牙本胞中表 达而在牙,,,,,,,,,,,,,,萌出后表达减弱并性?,,,,,,,,,,,,,,,,。、、均参与,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,化胞分化的特异性因子其中胞启 化的始,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,因子和作骨骨祖胞向成骨胞或骨 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,胞分化的因子两者互一向控子可通抑 制的表达而,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,阻止具双向分化潜能的骨骨祖 胞向骨胞分化从而,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,确立成骨胞的表型引。小 鼠牙乳充胞在未添加的含血清培基中出成,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 牙本胞表型分化后表达,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,与的表达相一致而其 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,口、、等特异基因的表达表明了牙乳 充胞向成牙本胞一化末分化胞的分化,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,程其中和之的互相平衡控可能参与其中。 参考文献甜,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.