益发复方对人头皮毛囊体外生长的影响

中药新药与临床药理2009年9月第20卷第5期 ·419· 3讨论 组织工程皮肤为修复皮肤缺损提供了光明的前 景，并且在治疗瘢痕挛缩及整形美容等领域都具有重 要的应用价值1，I，生肌中药外敷治疗皮肤损伤具有毒 副作用小、使用方便、价格低廉等优点，至今，在临 床上仍被广为应用‘41。但生肌中药能否用来促进组织 工程皮肤修复皮肤缺损则尚待研究。 乳没生肌散是中医药治疗皮肤损伤的经典方剂， 据《古方汇精》所载，该方剂中含有生乳香、生没 药、血竭、麝香、冰片等。乳香、没药为重要的活血 化瘀药，乳香具有活血行气止痛、活血消痈、去腐生 肌的功效，为外伤科要药，与其他具有生肌功效的中 药相比较，乳香的生肌作用较佳，这主要与乳香有抗 炎和促进组织再生的药理作用有关lsl；没药亦具有抗 炎生肌的作用，常与乳香相兼而用；血竭为“活血圣 药”，具有重要的止血生肌和敛创作用；麝香、冰片 外用时亦有抗炎的功效，该方剂在临床工作中有着悠 久的应用历史和确切的疗效。 本研究结果显示，乳没生肌散作用于移植后的组 织工程皮肤创面，在炎症早期能促进毛细血管的增 生，Ln、I型胶原成分的增加，毛细血管增生能为局 部创面修复提供允足的血供和丰富的营养；I型胶原 和L肌均为细胞外基质的主要成分，I型胶原可促进 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 皮细胞的迁移，使创面再上皮化，上皮化过程又可 抑制胶原的过度增生，减少瘢痕的形成№1；Ln又是 正常皮肤基膜的组成成分，基膜形成后能有效的促进 表皮细胞的迁移和增殖，因此，乳没生肌散在组织工 程皮肤移植后对创面愈合具有促进的作用。本研究为 利用生肌中药促进组织工程皮肤血管化进程提供了重 要的实验依据，并为进一步探讨中药生肌的分子机理 奠定了实验基础。 参考文献： 【l】MetealfeAD，FergusonMWJ．Bioengineeringskinusingmechanismsof regenerationandrepair[J】．Biomaterials，2007，28(34)：5100— 5113． 【2】刘爱军，靳俊峰．人皮肤成纤维细胞的高效分离培养及鉴定【J】． 广东医学，2008，29(12)：1969—1970． 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作者简介：刘维(1974一)，女，主治医师，主要从事中医药治疗脱发病的研究。Email：liuweitiger@163．corn。 基金项目：广东省科学技术厅资助项目(C30202)。 万方数据 ：垒至Q：!塑尘!i!望尘￡塾i翌!!!坠盟蝎基!!!堡丝h鱼g!i翌i!旦!里!!塑!!!!!!gY：2QQ皇曼!卫!!塑照LyQ!：2Q盟!：』 ProvincialHospitalofTCM，Guangzhou510120，China) Abstract：ObjectiveTomakeapreliminarybiomoleculardiscussionontheeffectofYifaCompoundPrescription(YCP)on humanhairfolliclegrowth．MethodsHairfolliclewasculturedinvitroandtheculturedhairfolliclewasdividedinto7groups． GrouplwasculturedwithWilliamsEmediumwithouserum，groups2～4wereculutredrespecitvelywith5％，10％and20％ blankserumadded，andgroups5～7wereculutredrespecitvelywith5％，10％and20％YCP—includingserumadded． TheeffectofYifacompoundprescriptiononhumanfreehairfolliclegrowthinvitrowasstudiedbyseropharmaeologyofChinese materiamedicaandsemi—quantitativeRT—PCRinexperiment．ResultsInWilliamsEculturemediumwith10％and20％ YCP—includingseFumadded，thehairfolliclesgrewbetterthanthatintheculturemediumwith10％and20％blankserum added(P<0．05)．Theexpressionlevelofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)mRNAinhumanhairfolliclescultured with10％and20％YCP—includingserumwasdistinctlyhigherthanthatculturedwith10％blankserum(P<0．01)． ConclusionYifaCompoundPrescriptioncanacceleratethegrowthofhairfolliclesandmaintaintheirnormalshapeinvitro． Keywords：YifaCompoundPrescription；Hairfollicles；Orgenculture；Vascularendothelialgrowthfactor 益发复方是根据本院皮肤科名老中医诩国维教授 的经验方，结合现代药理学方法研制开发而成的内服 中药生发制剂，在近年来治疗脱发病的临床应用中取 得了较好的疗效⋯。我们通过在体外建立毛囊器官培 养模型，观察该方对游离人发毛囊生长情况的影响， 并从分子生物学角度初步探讨其作用机理，为临床治 疗提供理论依据。 1材料与方法 1．1药品与试剂益发复方的组成：女贞子20g、菟 丝子209、黄芪15g、制首乌15g、蒲公英15g、丹参 15g、甘草10g，原药材由广东省中医院中药房提供。 毛囊培养基的组成：WilliamsE无血清培养基，Gibco BRL公司，批号为1153605；L一谷氨酰胺，Amresco 公司，2mmol·L。1；Hepes，20mmol·L“；牛胰岛 素，10斗g·mL。；转铁蛋白，10斗g·mL～，Sigma 公司；氢化可的松，0．4斗g·mL～，扬州制药厂；青 霉素、链霉素，100U·mL一，均为华北制药股份有 限公司产品。 1．2标本来源 20～40岁脑外科手术病人的正常全 层头皮(无秃发、感染等异常)。 1．3仪器手术显微镜(YZ20P5，苏州六六视觉科技 有限公司)，倒置显微镜(NikonT300带目镜测微尺， 日本尼康公司)，COz培养箱(HSO301T—VBA，美国 Harris公司)，电热恒温水浴箱(HH·W21·600，上 海跃进医疗器械厂)，净化工作台(SW—CT—IF，苏 州净化设备厂)，CO：培养箱(Harris)，PE一9600型 基因扩增仪(ABI)，GelDoc1000一次性凝胶成像系 统(Bio—Rad)，GS一15RCentrifuge高速低温离心机 (Beckman)，DF—D电泳仪(恒压恒流，北京东方仪 器厂)。 1．4血清的制备 1．4．1空白血清的制备健康志愿者1名，清晨空腹 时肘部浅静脉采血，取血于无抗凝试管中，常温静置 一段时间后，在离心机内分离血清，取上清液，经 56℃、30min灭活处理后，用针头滤器滤过除菌， 一20℃以下保存备用。 1．4．2益发复方含药血清的制备幢。1取益发复方中 药材，加水1000mL，浸泡30min，煮沸后文火煎至 200mL，倒出药液；复煎加水400mL，煮沸后文火 煎至100mL，合并两次药液，给同一健康志愿者服 用，每次1剂，每天2次，连续给药7d，于第8天 清晨空腹服药(服药前禁食12h)后1h采血。血清制 备方法同1．4．1项下。 1．5游离毛囊的分离与培养¨1从手术室取回新鲜全 层头皮标本，用生理盐水漂洗血污，并剪除外露的毛 干及部分过多的脂肪组织(注意勿伤及毛球)，再用 D—Hanks液(含青霉素400U·mL～、链霉素400 U·mL。1)连续冲洗3遍，每遍3～5min。将头皮标 本剪成0．3～0．5cm宽的皮条，用眼科手术剪从真皮 与皮下组织交界处剪开，弃真皮和表皮部分。在解剖 显微镜下(×8)用显微外科镊夹紧毛根远端，顺毛囊 方向轻轻从皮下组织中拔出完整的毛囊，置于无菌培 养液中待养。在倒置显微镜下选取结构完整的生长早 期毛囊(即外毛根鞘完整、毛乳头形态圆润光滑，第 一天即有明显生长，长度≥0．1mm的毛囊)，在超净 工作台内将其小心转移至24孔板内，每孔1根毛 囊，再加入毛囊培养基0．5mL，加盖，置于37℃、 含5％CO：及一定湿度的培养箱中培养，每隔4d 换培养液1次，每次换液50％左右。 1．6分组与给药 实验共分为7组，第1组以 WilliamsE无血清培养基作为空白对照组；第2—4 万方数据 蛸新药与临床药理2009年9月第20卷第5期 ·42l· 组为分别加入体积分数为5％、10％、20％血清的 空白血清组；第5．7组为分别加入体积分数为5％、 10％、20％益发复方中药含药血清组。 1．7观测指标 1．7．1毛囊形态的观察在倒置显微镜下连续观察每 日各组毛囊毛球部及其内部结构(包括毛母质、毛乳 头以及内、外毛根鞘)的形态变化， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 其变化特 点，并分别照相。 1．7．2毛囊的生长速度及可生长天数的测定在装有 目镜测微尺的倒置显微镜下，测量每24h各组毛囊 自毛根基部至毛干游离顶端的长度，直至毛囊不再 延长。记录毛囊的生长长度和生长天数，并计算出 前4d的平均生长速度和最终生长长度。 1．8毛囊VEGFmRNA的表达 1．8．1引物的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 人血管内皮细胞生长因子(VEGF) mRNA引物：上游5’一CCCACTGAGGAGTCCAA— CAT一3’， 下游5’一CATTTACACGTCTGCG． GATCT一3’，预期扩增产物203bp；B—actin引物i上 游5’一ATGTTTGAGACCTrCAACAC一3’，下游5’一 CAcGTcACACTTCATGATGG一3’，预期扩增片段长度 为489bp。以上引物均由上海生工公司(Sangon)合成。 1．8．2mRNA的提取取出体外培养4d的10％空白 血清组、10％和20％中药含药血清组毛囊，严格按照 mRNA直接抽提试剂盒说明步骤进行mRNA的提取。 所用的器具和物品均已事先经过RNase—free处理。 1．8．3逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)采用 MMLV一步法RT—PCR扩增试剂盒，每管加入2× RT—PCRBuffer25lAL(含400斗mol／LdNTP，2．4 mmol／LMgS04)，RNA模板1lag，10lamol／L正向和 反向引物各2斗L，RT／Taq酶1ILL，补足DEPC水至 总反应体积50斗L。在基因扩增仪上37℃30min后 完成cDNA的合成，并立即进行PCR反应。反应条 件为：94℃变性5min后，94℃15s、58℃30s、 72℃1min，经35个循环，最后72℃延伸5min。 1．8．4PCR产物分析取10此扩增反应产物经1％ 琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后进行密度扫描，得 出各阳性条带的绝对光密度，然后拍照记录，打印图 像，用QuantityOne软件对RT—PCR扩增产物进行 半定量光密度分析。VEGFmRNA的相对含量以 VEGF与B—actinmRNA的光密度(OD)比值来表示。 1．9统计学方法采用SPSS11．0统计软件包进行数 据处理，组间比较采用t检验和方差分析。 2结果 2．1毛囊大体形态的变化情况倒置显微镜下动态观 察可见，各组毛囊逐13延长，表现为毛干和内、外根 鞘的共同生长，结缔组织鞘未见延长。毛囊快速生长 主要集中在前4d，此时各组毛囊总的形态没有明显 变化，毛囊各层结构清晰，毛球部饱满，毛乳头与毛 母质界线分明且呈锥形嵌入其内。生长初、中期，毛 干与内、外根鞘的增长长度基本相等；到末期，毛干 的生长速度稍快，最后毛干稍突出于毛根鞘外。随着 培养时间的延长，部分毛囊开始贴壁生长，生长速度 明显减慢。贴壁后的毛囊稍有延长或长度基本无变 化，其形态结构开始发生改变，表现为毛囊各层次稍 显模糊，毛球部逐渐增大变圆，毛囊皋部与毛母质之 间的距离缩短，毛囊中段变粗。毛囊停止生长后开始 出现退行期样改变，毛球部形态变得极不规则，毛囊 下段轻度弯曲，毛根呈棒状；随后毛母质逐渐上移， 与毛乳头距离拉长，直至完全分离。空白对照组的毛 囊在培养的第l周形态完好，层次清晰；部分毛囊在 第8天开始贴壁，1～2d后毛囊停止生长，呈早期退 行性变化。空白血清组的毛囊平均5d贴壁生长，第 6天大部分毛囊形态开始发生改变，随即迅速进入退 行期。中药含药血清组的毛囊平均6—7d开始贴壁 生长，8d后逐渐进入退行期，见图1。 A．10％空白血清组毛囊 B．10％中药益发复方含药血清组毛囊 图1 培养第6天的毛囊形态(×40) 2．2各组毛囊的生长情况毛囊在WilliamsE培养基 (即无血清空白对照组)中生长良好，毛囊持续生长最 长可达11d，最终平均生长长度为(1．25±0．26)mm， 培养过程中未发现污染情况。各组毛囊在培养前4d 生长速度较快，其中前2d长得最快，之后生长速度 逐渐减慢。10％和20％中药含药血清组前4d的平 均生长速度和最终生长长度均优于相应体积分数的空 白血清组(P<0．05或P<0．01)；各组毛囊生长时 间的比较结果显示，10％和20％中药含药血清组的 可生长天数均长于相应体积分数的空白血清组(P< 万方数据 ：垒2至： !!!亟i丛!迥堡hi坠!璺星坠婴g垦!盟璺堡b鱼￡!逾!垒!里h垒墅墼丛!赶，垫塑墅卫!!堡遮!：yQ!：垫塑!：§ 0．05)，但比空白对照组缩短。中药含药血清组中，10 ％中药含药血清组的平均生长速度和最终生长长度均 优于其余两组，见表1。由图2可见，随着血清加入 量的增多，空白血清组中毛囊总生长长度逐渐递减。 表1 各组毛囊生长情况的比较(i±s) 注：与空白对照组比较，6P<0．05，“P<0．01；与等体积分数 空白血清组比较。‘P<0．05。”P<0．0l。 O l 2 3 4 5 6 7 8 9 Io E囊m长时问／d 图2 各组毛囊的生长情况 --4．--5％。≯fI咖衍钌I 一5％·I·乱粗汕组—1■一10％中r1帆ilIj靠l —*一10*小岛衄；^钎l ---',1(---20％，卜rlm；^细 —●一20％111拍血j．～组 —+一中fi计j!cc组 2．3各组毛囊VEGFmRNA表达情况的比较10％ 空白血清组、10％和20％中药含药血清组毛囊标本 均可见B—actin特异性mRNA表达(见489bp条 带)，三组毛囊都有明显的VEGFmRNA表达(见203 bp条带)，但表达程度有所不同。RT—PCR产物电泳 结果的凝胶密度扫描半定量分析结果显示，培养第4 天，10％和20％含药血清组的OD比值分别为 0．9907±0．0031、0．9754．4-0．0087，明显高于10％ 空白血清组(OD比值为0．9496±0．0037)，具有非常 显著性差异(P<0．01)；10％含药血清组的OD比值 比20％含药血清组稍高，但差异无统计学意义(P> 0．05)，见图3。 3讨论 研究发现，多种中草药对体外培养的小鼠、猪或 人的头皮毛囊具有一定的促生长作用b～1，但有关的 实验研究多针对的是单味中药或其提取物(单体)，采 用的方法为将药物成分加入培养基中与游离毛囊直接 作用，其结果尚不足以说明中药在人体内的药理效 应。为使其条件更接近药物在体内环境中产生药理效 M：Marker；A：10％中药含药血清组； B：20％中药含药血清组；C：10％空白血清组 图3 人头皮毛囊VEGFmRNART—PCR产物电泳结果 应的真实过程，克服中药粗制剂中非有效成分和本身 的理化性质对实验结果的干扰，我们参照中药血清药 理学的实验方法【81，将含益发复方成分的人血清掺入 毛囊体外培养反应体系中，在一定程度上更能反映整 体给药的作用效果。 在预实验中我们发现，在含有血清的培养基中毛 囊虽能保持一定的增长速度，但与无血清空白对照组 相比其生长速度相对较低，生长时间有所缩短，贴壁 时间提早，因而，毛囊总生长长度也相应减小。这证 实了血清中的某些成分可诱导毛囊进人退行期，对毛 囊的生长具有一定的负影响归】。为了排除这种干扰， 我们设立了与中药含药血清组相对应的三个空白血清 组，以保证实验的可比性。通过毛囊在不同条件下各 项生长指标的观察，结果显示10％和20％含药血清 组毛囊的生长速度、生长时间和最终生长长度均优于 相应的空白血清组(P<0．05)，其中，以10％含药 血清组的作用最为显著(P<0．01)。此外，我们发 现，在5％一20％的体积范围内，随着中药含药血 清加入量的逐渐增加，其药理效应曲线并非相应地呈 现递增的趋势。分析原因，可能是由于血清本身所含 有的抑制毛囊生长、促使毛囊贴壁的成分所致，如转 化生长因子(TGF—B)、表皮细胞生长因子(EGF)、 成纤维细胞生长因子(FGF)、黏附因子等。其中， TGF—B可抑制毛囊上皮增殖，促使其提前进入退行 期l101；EGF则促进毛母质细胞向外根鞘细胞分化， 诱导毛囊停止生长⋯J，因此，它们可在一定程度上 对抗血清中药物成分的药理效应。在5％含药血清组 中，反应体系中的血药浓度低，故促进毛囊生长的作 用尚不明显；而10％含药血清组血药浓度较高，血 清的对抗作用较弱，因此，该组的作用最为显著； 20％含药血清组血药浓度虽高，但由于同时增加了 血清的体积，使血清的对抗作用大大加强，所以，对 毛囊的促生长作用反而低于10％含药血清组。 血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowth 4 2 ， 8 6 4 2 0 l 1 O O O O _啊／苍半半一掣∞ 万方数据 中药新药与临床药理2009年9月第20卷第5期 ·423· factor，VEGF)是新近发现作用于毛囊的一种多肽生 长因子，近年来的研究表明，VEGF对毛囊生长周 期和毛发生长具有正相调节的重要作用¨引。Lachgar 等【131从毛乳头培养基中分离出VEGF样蛋白，首先 证实了毛乳头细胞分泌VEGF，并发现VEGF可促进 毛乳头细胞的增殖和迁移。有学者认为【14WEGF还可 能通过诱导毛囊周围的血管形成而调控毛囊的周期 性循环和促进毛发生长。VEGF一方面通过自分泌方 式作用于毛乳头本身，另一方面通过旁分泌机制影 响毛囊其他细胞和血管形成而参与毛囊生长周期的 调控n引。本实验采用RT—PCR技术对三组体外培养 4d的人发毛囊VEGFmRNA表达进行了观察，结果 表明，10％和20％含药血清组VEGFmRNA的表达 水平明显高于10％空白血清组，提示益发复方能在 一定程度上促进毛囊分泌VEGF，增强VEGFmRNA 的表达，进而促使周围血管的增生，改善局部微循 环，增加毛囊营养。但10％与20％含药血清组两者 相比，VEGFmRNA的表达水平并未随着含药血清加 入量的增多而相应增加，我们推测这可能是与此时血 药浓度趋于饱和的状态有关。 本研究结果显示，益发复方能够维持毛囊的正常 形态，使VEGFmRNA表达增强，对于毛囊的生长具 有明显的促进作用，进而减少毛发脱落、促进生发， 这可能是该方治疗脱发的作用机制之一。此外，本研 究是以含药血清对毛囊进行体外培养，而当中药内服 时，其药物作用于毛发的途经和结果是否与本文一 致，有待于进一步的研究。 参考文献： fil陈达灿，胡东流，橱国维．中药益发治疗脂溢性脱发576例的近 期疗效观察【J】．新中医。1996，28(8)：49—50． 【2】李仪奎．中药血清药理学实验方法的若干问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 【J】．中药新药与l临 床药理，1999，10(2)：96—97． 【3l李振光，王净净．关于中药血清药理学方法的思考【J】．中国中医 药信息杂志，2002，9(2)：5—6． 【4】屠军波，杨壮群，姚天华，等．游离毛囊体外培养模型构建及形态 学检查的实验研究(J】．中国美容医学，2003，12(6)：565—568． 【5】范卫新，朱文元．55种中药对小鼠触须毛囊体外培养生物学特性 的研究【J】．临床皮肤科杂志，2001。30(2)：81—84． 【6】张兴洪，范卫新．何首乌、女贞子等中药煎剂对体外培养的猪毛囊 毛发生长的影响[J1．中华皮肤科杂志，2005，38(2)：102—104． 【7】谷朝霞，汪晒，杨淑霞，等．首乌、川芎、甘草、侧柏叶对体外 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摘要：目的观察黄芪四君子汤和四君子汤对脾虚大鼠肝组织线粒体琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶活性的 影响，从能量代谢角度揭示脾虚证的发生机理，阐明健脾益气中药的作用机制。方法取SD大鼠40只， 随机分为4组，即空白对照组、脾虚模型组、四君子汤组(10．5g／kg)和黄芪四君子汤组(18g／kg)，每组10 只，空白对照组与脾虚模型组给予等体积的生理盐水，每日1次，连续4周。除空白对照组外，其余各组大 收稿日期：2009—02—25 作者简介：宋雅芳(1968一)，女，博士，副主任中医师，主要从事中医内科学以及中药药理学的研究。Email：sallysongyue@163．corno 基金项目：广州中医药大学博士后科研基金(2006—5—18)。 万方数据 益发复方对人头皮毛囊体外生长的影响 作者： 刘维， 陈达灿， 陈修漾， 韩凌， 孙静， 周丹， LIU Wei， CHEN Dacan， CHEN Xiuyang， HAN Ling， SUN Jing， ZHOU Dan 作者单位： 广东省中医院,广州,510120 刊名： 中药新药与临床药理 英文刊名： TRADITIONAL CHINESE DRUG RESEARCH & CLINICAL PHARMACOLOGY 年，卷(期)： 2009,20(5) 参考文献(15条) 1.唐建兵;陈璧;汤朝武 不同条件对人游离毛囊培养的影响[期刊 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 ]-西北国防医学杂志 2001(01) 2.范卫新;朱文元 环孢素A促毛发生长机理的研究[期刊论文]-临床皮肤科杂志 2000(05) 3.Bond JJ;Wynn PC;Moore GP Effects of epidermal growth factor and transforming growth factor alpha on the function of wool follicles in culture[外文期刊] 1996(07) 4.Soma T;Ogo M;Suzuki J Analysis of apoptotic cell death in human hair follicles in vivo and in vitro[外文期刊] 1998(06) 5.曹俊;张红梅;王旋 中药血清药理学研究概况[期刊论文]-中国中医药信息杂志 2002(01) 6.谷朝霞;汪旸;杨淑霞 首乌、川芎、甘草、侧柏叶对体外培养人头皮毛囊的影响[期刊论文]-中国皮肤性病学杂志 2007(12) 7.张兴洪;范卫新 何首乌、女贞子等中药煎剂对体外培养的猪毛囊毛发生长的影响[期刊论文]-中华皮肤科杂志 2005(02) 8.范卫新;朱文元 55种中药对小鼠触须毛囊体外培养生物学特性的研究[期刊论文]-临床皮肤科杂志 2001(02) 9.屠军波;杨壮群;姚天华 游离毛囊体外培养模型构建及形态学检查的实验研究[期刊论文]-中国医学美学美容杂志 2003(06) 10.李振光;王净净 关于中药血清药理学方法的思考[期刊论文]-中国中医药信息杂志 2002(02) 11.李仪奎 中药血清药理学实验方法的若干问题[期刊论文]-中药新药与临床药理 1999(02) 12.陈达灿;胡东流;禤国维 中药益发治疗脂溢性脱发576例的近期疗效观察 1996(08) 13.宋志强;郝飞;杨希川 毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因的筛选及分析[期刊论文]-中华皮肤科杂志 2003(09) 14.Yano K;Brown IF;Detmar M Control of hair growth and follicle size by VEGF-mediated angiogenesis 2001(04) 15.Lachgar S;Moukadiri H;Jonca F Vascular endothelial growth factor is an autocrine growth factor for hair dermal papilla cells[外文期刊] 1996(01) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zyxyylcyl200905006.aspx