姜黄素联合顺铂对卵巢癌细胞COC1的体外抗肿瘤作用

第28卷 第 9期 2011年 9月 应 用 化 学 CHINESE JOURNAL OF APPLIED CHEMISTRY VoI_28 Iss．9 Sep．2011 姜黄素联合顺铂对卵巢癌细胞 COC1的 体外抗肿瘤作用 关松磊 胡秀丽。 刘忠英” 宋凤瑞 刘志强 (。吉林大学药学院 长春 130021； 中国科学院长春应用化学研究所，长春质谱中心 长春； 吉林农业大学生命科学学院 长春) 摘 要 利用 MTY比色法研究了姜黄素(Cur)联合顺铂(DDP)对卵巢癌 COC1细胞的抑制作用。结果表明， 当p(DDP)为 2．5～10 ms／L，P(Cur)：5 ms／L时，与 DDP相比，二者联合用药对卵巢癌 COCl细胞可产生协 同抑翩作用；p(Cur)=5 mg／L就可明显增强COC1细胞对顺铂的敏感性，增敏倍数为2．66倍；光学显微镜观 察发现，药物作用后 coc1细胞的形态发生了改变，细胞折光度下降，大小不一、形态各异、排列疏散和胞浆空 泡化严重。为探讨姜黄素协同顺铂抑制肿瘤的机制，本研究采用高效液相色谱法测定姜黄素辅助用药前后细 胞内DDP含量的变化。结果表明，在加入姜黄素前后，COC1细胞内顺铂含量虽然略有下降，但差异无统计学 意义(P>0．05)。由此可见，姜黄素与顺铂联合用药对人卵巢癌COC1细胞增殖具有协同抑制作用，且姜黄素 可同时增加 COC1细胞对顺铂的敏感性，但姜黄素可能并未明显改变顺铂在细胞内的含量，即姜黄素可能不 是通过影响顺铂进入细胞的通路而起协同抑制作用的。 关键词 姜黄素，顺铂，抑制作用，MrITI1比色法 ，高效液相色谱法 中图分类号：0629；R737．3 文献标识码：A 文章编号：1000-0518(201I)09—1022-06 DOI：10．3724／SP．J．1095．201 1．00588 顺铂(c／s—Diamminedich|oroplatinum，DDP)是目前临床上治疗卵巢癌的一线化疗药物，虽然其具有较 大的毒副作用——肾毒性、耳毒性、神经毒性和骨髓毒性 ¨，但由于以下几点原因使顺铂目前仍然是临 床上广泛使用的抗卵巢癌一线用药：1)顺铂是传统抗肿瘤药物，其抗肿瘤效果确切；2)卵巢癌的多种病 理类型对顺铂的药物作用较敏感；3)新的铂类抗肿瘤药物虽然毒副作用略低于顺铂，但价格昂贵，且药 效亦不能够完全替代顺铂；4)毒性谱与其它抗癌药物有不同之处，因此易与其它抗癌药物配伍，包括与 其它铂类抗癌药物配伍；5)与其它抗癌药物缺乏交叉耐药性，有利于临床的联合用药；6)顺铂价格低 廉，易被广大肿瘤患者接受。基于以上几点原因，临床医生仍将顺铂作为一线用药。多年来研究人员一 直在开发顺铂的替代药物或是寻找某种药物与顺铂合用减低其毒性，并有了一定进展 ，但寻找的辅 助药物多数价格昂贵、原料稀有，无法推广应用 J。姜黄素(eurcumln，Cur)是从姜科、夭南星科中的一 些植物的根茎中提取的一种化学成分，其中姜黄约含3％ ～6％，是植物界很稀少的具有二酮的色素，为 二酮类化合物，无毒副作用，可以作为食品添加剂应用，具抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗动脉粥样硬 化和调节免疫等多种作用H J，自从 1985年印度 Kuttan首次提出姜黄和姜黄素具有抗肿瘤特性以来，众 多细胞实验和动物实验确证了Cur的抑瘤活性，其抗癌谱较广，不良反应小，已成为肿瘤预防和治疗的 一 个研究热点，但关于姜黄素的作用机制的研究还缺乏系统性和完整性。多项研究表明，姜黄素通过影 响凋亡相关基因表达、阻遏细胞周期、抑制信号转导和抑制相关酶的活性等多种分子水平机制发挥作 用 。主要的研究集中于 NF—KB(P56)信号通路蛋白 和 p53依赖性途径0 ，这些途径均是在分子水 平的研究，而目前尚缺乏姜黄素在细胞水平上作用的研究证据。该研究主要探讨姜黄素联合顺铂对卵 巢癌 COC1细胞的体外抑制作用及其细胞水平的作用机制。 2010—10-06收稿，201 1-03-22修回 国家自然科学基金(20675079)资助项目 通讯联系人：刘忠英，教授 ；Tel／Fax：0431-85262236；E-mail：liuzy@jlu．edu．cn；研究方向：药物 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 第9期 关松磊等：姜黄素联合顺铂对卵巢癌细胞COC1的体外抗肿瘤作用 1023 1 实验部分 1．1 试剂 、仪器和材料 LM -004型倒置光学显微镜(重庆光学机械厂)；GENios型酶标仪(澳大利亚 TECAN公司)；2695 型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，检测条件：色谱柱 Cl8柱(Diamond 150 mm×4．6 mm，5 )，流 动相甲醇．水(体积比为 70：30)，柱温为(35±1)oC，进样体积 l0 L，流速 0．6 mL／min，波长 210 nm； Centrifuge5810R型冷冻超速离心机(德国Eppendorff公司)；KQ-50ODE型超声波清洗器(昆山超声仪器 有限公司)。 人卵巢癌细胞 COG1购于武汉中国典型培养物保藏中心；RPMI-1640培养基(美国 GIBCO公司)； 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所)；噻唑蓝(北京鼎国生物科技公司)；姜黄素(天津市科 密欧化学试剂开发中心，临用时用 95％乙醇溶解，再用0．9％生理盐水稀释至所需浓度)；顺铂(山东齐 鲁制药厂，纯度 >99％)。色谱级甲醇(美国Fisher公司)。 1．2 MTT比色法检测细胞活性 按常规悬浮细胞培养法接种于含体积分数为 10％小牛血清的RPMI一1640培养液中，100IU青霉素； 100 mg／L链霉素。在 37℃、含体积分数为5％CO：的条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。COC1 细胞以5×10 ／mL密度接种于 U底 96孔培养板，加药组加不同浓度药物，对照组加等体积的0．9％生 理盐水，每组设 6个复孔，无细胞孔为背景。置 37℃、5％CO 、饱和湿度条件下培养 18 h后加四唑盐 (Myr)20 I／well，继续培养 4 h，离心(3 500 r／min，10 rain)，弃去上清液，加二甲基亚砜 (DMSO) 200 txL／well，充分振荡直至沉淀完全溶解，用酶标仪检测 OD 实验重复 3次。细胞生长抑制率 (IR)=(对照组 OD值 一实验组 OD值)／对照组 OD值，增敏倍数 =未加增敏剂 IC 。／an增敏剂 IC 。。 1．3 细胞观察 取 1．2小节药物处理前后的细胞在倒置光学显微镜观察细胞加药前后的状态，观察内容包括细胞 大小、形态、排列、折光度和碎片等情况。 1．4 ItPLC检测细胞内DDP含量 COC1细胞接种于 12孔细胞培养板，1．5×10 ／well，Cur终浓度为0或 5 ms／L，DDP终浓度为 5或 10 mg／L，每组设3个复孔。置37 、5％CO 、饱和湿度条件下培养2 h，收集细胞，离心弃去上清，用冰 冷0．9％生理盐水反复清洗2次，离心弃上清。细胞破碎采取反复冻融法 +超声波破碎法：将收集的细 胞加蒸馏水50 ，置 一20℃冷冻20 min后取出置室温融化，再置入超声中破碎(超声功．~asoo W，频率 40 kHz)10 min，14 000 r／min、4℃离心 10 min，取上清液，如此反复 3次。采用最后得到的上清液检测 DDP含量。以顺铂对照品进样 ，对照品浓度是 20 mg／L，体积分别为 5、10、12、15和20 ，以峰面积对 样品的含量做标准曲线：’，：3．16e +5．57e ，r=0．996 2。 1．5 数据计算和分析 为了评价药物合用体外细胞抑制是否有协同作用，参照文献[8]中金氏公式判断：Q=E “／(E。+ 一 E ×E )，式中， “为合并用药抑制率，E 和 分别为 A药和 B药的抑制率，式中分子代表“实测 合并效应”，分母是“期望合并效应”，Q为二者之比。Q值 0．85～1．15为单纯相加，用“+”表示；大于 1．15～2．00为增强，用“++”表示；小于 0．85～0．55为拮抗，用“一”表示；小于 0．55为明显拮抗，用 “_-，’表示。数据统计采用方差分析和t检验。显著性检验水准 口=0．05。 2 结果与讨论 2．1 Cur联合DDP对 COC1的协同抑制作用 表 1为顺铂与姜黄素联合对卵巢癌 COC1细胞协同抑制作用的数据。从表 1可以看出，在对 COC1 细胞的增殖抑制率方面，顺铂 +姜黄素各浓度组与单用顺铂组比较，差异均有统计学意义(P<0．05)。 表明姜黄素与顺铂合用具有协同作用。姜黄素的这种辅助抗肿瘤作用已经在许多研究中有所报 道 。。。由表 1可以看出，单用顺铂 P(DDP)=10 mg／L时，对细胞 的增殖抑制率仅为 (36．67 4- 第 9期 关松磊等：姜黄素联合顺铂对卵巢癌细胞 COC1的体外抗肿瘤作用 1025 加药组(图 1A)细胞生长密集、表面清晰、折光度均一、细胞圆润、饱满、均匀，少见细胞碎片；DDP加药 组(图 1B)细胞大小不一、形状各异、排列疏散、折光度下降和有空泡化出现，视野内可见细胞碎片； DDP+Cur组(图1C)细胞胞浆空泡化严重，基本丧失折光性，可见较多细胞碎片，有出胞现象。 2．4 I-IPLC测定细胞内顺铂含量 最新的研究_l 结果表明，顺铂不是通过被动扩动进入细胞的，而是通过细胞膜表面的跨膜配体的 识别进行主动转运的。张慧珠等 副研究 Cur的体外增敏抗肿瘤作用，Cur与长春新碱、阿霉素合用，在 KB及 KBv200细胞中均有增敏作用。蓄积实验说明，在 KBv200细胞，其增敏作用与增加细胞内阿霉素 蓄积有关；而在 KB细胞中的增敏作用与细胞内阿霉素蓄积量无关。图2为加入姜黄素前后顺铂含量的 色谱图。由图2可知，加入姜黄素前后顺铂的峰形态、出峰时间均无明显变化。表2为顺铂含量的检测 数据，由表2可以知道，虽然加入姜黄素后细胞内DDP含量有所下降，但无统计学差异(P>0．05)。说 明姜黄素对顺铂的协同作用可能不是通过改变细胞内顺铂的量起作用的，即姜黄素可能并未影响顺铂 进入细胞的通路，所以姜黄素在细胞水平起作用的确切机制还有待进一步深入研究。 0·12 3 0．08 《 0．04 O - ． DDP - ／ me=3．086 n _ ● ● ’ j ． ． ． ● 2．00 6．00 1 0．00 l4．00 Tinit／rain 0．08 ● _ ’ B DDP ： 一 ／ 。。 n - ： - _ ： - - ● ● _ - ． ⋯ 。 ． ． 6．o0 10．oo l4．oo 图2 COC1细胞内顺铂含量测定的色谱图 Fig．2 Chromatograph of DDP in COC1 A．chromatograph ofDDP(10mg／L)；B．chromatogram ofDDP(10mg／L)+Cur(5 rag／L) 表 2 姜黄素对 COC1细胞内顺铂含量的影响(i-t-$。露--3) Table 2 Content change of DDP within COCI cells treated by curcumin 口．P>0．05 fJ$P(DDP)=5 ins／L group；b．P>O．05 P(DDP)=10 mg／L group 尽管姜黄素抗肿瘤的作用确切，但由于其水溶性低、稳定性差和肠道转化等原因，姜黄素的体内利 用率很低，难以达到抗肿瘤的作用，药物的开发很困难。尽管对其口服制剂进行了很多尝试，至今仍未 取得显著进展，其主要原因可能与其稳定性差及肠道的生物转化有关 ，研究发现，姜黄素对 pH值、温 度、湿度、光照均敏感，口服后在肠道可生物转化与葡糖苷醛酸和磺酸复合物，但其生物转化产物的比例 尚未明确 ，体内利用率低的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 是姜黄素药物开发和临床应用最大的障碍。解决了姜黄素的水溶性 和稳定性问题，就可以开展姜黄素的体内药物研究，也同时为姜黄素下一步的临床应用铺平了道路。为 此，国内外学者进行了大量的研究 孓 ，希望找到姜黄素的新型用药模式。新剂型包括纳米结晶固体分 散体、纳米粒、脂质体、胶束和纳米乳剂等受到关注，其载药微粒可能通过肠道的淋巴组织吸收，避免肠 道代谢提高口服生物利用度 ¨]。这些研究在提高姜黄素的生物利用率方面均取得了较大的突破。因 此，姜黄素的药物开发前景良好。 lO26 应 用 化 学 第 28卷 3 结 论 姜黄素与顺铂联用对卵巢癌细胞不仅可表现出明显的协同抑制作用，而且还可增加卵巢癌细胞对 化疗药物的敏感性，减少顺铂的使用剂量。虽然姜黄素起作用的系统机制还有待深入研究，但因其本身 是一种抗突变剂，即抗癌剂，其抗癌谱较广，无毒副作用，可明显降低由大剂量、长时间化疗产生的严重 的毒副作用，因此二者合用可能发展成为一种安全有效的临床用药 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。 参 考 文 献 [1]JIA Liqun，ZHU Shijie．Tumor Chemotherapy Untoward Effect[M]．Beijing：Technology Literature Press，2004：69-71(in Chinese)． 贾立群，朱世杰．肿瘤化疗不良反应[M]．北京：科学技术文献出版社，2004：69-71． [2]WANG Xiaoyong，GUO Zijian．New Strategies and Trends for the Design of Metal—Based Anticaneer Drug[J]．Prog Chem， 2009，Zt(5)：sot-soz(in Chinese)． 王晓勇，郭子建．金属抗癌药物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 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cells was analyzed with MTT colorimetric assay． I e morphological changes of COC1 cells were observed by inve~ed microscope．The result indicated that DDP of 2．5～10 mr,／L dose combined with curcumin(Cur)of 5 ms／L dose could enhance the inhibiting effect and induce apoptosis compared with the case when only DDP was used．Meanwhile。curcumin of 5 mg／L dose could improve the sensitization of COC 1 cells to DDP with 2．66 times．Optical microscopy results showed that COC l cells had a marked decreased proliferation and a great amount of cells necrosis in DDP +Cur group and DDP group than the control group．COC1 cells had lower diopter，scatter array，serious vacuolization treated with DDP+Cur．The HPLC result indicated that the contents of DDP within tumor cells decreased lightly after dosage of Cur．but it had no statistically significant(P >0．05)．In summary，curcumin combine with DDP can enhance the inhibiting effect on proliferation of COC1 cells，meanwhile，curcumin can improve the sensitization of COC1 cells to chemotherapeutics．However，the curcumin is unlikely to affect the amount of DDP within cells． Keywords curcumin，c／s—diamminedichloroplatinum，inhibiting effect，M1Tr，HPLC