甲亢型阴虚模型小鼠焦虑行为的观察

模型建立应具备三要素:科学性、特异性和可重复性。本病通常 认为主要是由沙眼衣原体 ( 24. 53% ~ 38. 9% )和解脲支原体 ( 7. 57% ~ 26. 53% )引起, 也有人认为人型支原体 ( 4. 18% ~ 12. 42% )、生殖支原体 ( 15% ~ 25% )以及其它一些病原体 (如 滴虫、白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄菌、单纯疱疹病毒、兰 氏鞭毛虫等 )也与本病有关 [ 8]。在 Uu感染动物模型的制备中 需在完全的洁净工作区内严格按照无菌操作技术, 结合组织粘 膜 PCR检测技术对 Uu的 MB抗原进行特异性检查, 同时控制 大肠杆菌、金黄色葡萄菌等引起的假阳性, 提高模型动物的敏 感性和特异性。 本研究中发现 Uu感染引起的 NGU可以是尿道黏膜上皮 细胞空泡变、基底层和固有层内炎细胞浸润、间质水肿、局灶性 增生, 使黏膜组织细胞核形不 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 、畸变明显, 核膜下出现高度 明显浓缩染色质, 胞质内有大量线粒体出现嵴性肿胀或空泡变 性, 胞质内出现大量次级溶酶体颗粒。本模型简便、可靠, 为今 后进一步研究 Uu感染引起的 NGU的过程、机制及防治方法提 供了一个良好的研究平台。 参考文献 1 廖明敏,欣伟鸣,乐嘉豫,等.性疾病高危人群沙眼衣原体感染的初步 调查.中华皮肤科杂志, 1991; 24B 53 2 AbeleM, H ohn IG, E lliot JL, et a.l The com p lete sequence of th em uco- sal p athogen urea plasm a urealyt icum. N ature, 2000 ; 407B 757~ 761 3 杨建宏,张俊威,吴秉纯,等.解脲栓体外抗解脲支原体作用.中药药 理与临床, 2006; 22 ( 6) B 68~ 69 4 Teng LG et a.l J C linM icrob io l1994; 32B 1464~ 1469 5 李俊杰,万德胜,梁沛杨,等.泌尿生殖道支原体感染状况及药物敏 感性动态分析. 中国艾滋病性病, 2003; 9 ( 1) B 46 6 赵季文.淋病患者中支原体和衣原体感染频率的初步血清学调查. 中华流行病学杂志, 1991; 12( 5) B 269 甲亢型阴虚模型小鼠焦虑行为的观察* 崔 瑛,代永霞 1, 张 宾 (河南中医学院, 郑州 450008; 1郑州澍青医学高等专科学校, 郑州 450064) 摘 要 目的: 观察甲亢阴虚模型小鼠焦虑行为状态, 探讨作为阴虚焦虑模型的可行性。方法:雄性昆明种小鼠用 320m g /kg 甲状腺片混悬液连续灌胃 9天造成阴虚模型, 以高架十字迷宫和明暗箱实验观察阴虚模型小鼠焦虑行为状态,并测定 GABA和 G lu 的含量及 GABAAR1和 NMDAR1的表达。结果: 与对照组比较,阴虚模型组小鼠在高架十字迷宫实验中进入开臂的时间比和次数 比显著降低, 在明暗箱实验中穿箱次数显著减少, 脑内 GABA含量显著降低, G lu含量显著增加脑内 GABAAR1平均积分光密度值降 低、NMDAR1平均积分光密度值增加。结论:甲亢阴虚小鼠模型有显著的焦虑状态增强, 可以作为阴虚型焦虑模型使用, 其焦虑机 制可能与小鼠脑内 GABA含量降低, GABAAR1表达减弱, G lu含量增加, NMDAR1表达增强有关。 关键词 甲状腺片;阴虚模型; 焦虑 焦虑性神经症 ( Anx iety Neurosis)简称焦虑症, 是以广泛和 持续性焦虑或反复发作的惊恐不安为主要特征的神经性障 碍 [ 1]。中医学认为本病属于内伤七情致病, 与心、肾等功能失 调有关。临床辨证分为心神不宁型、肾精不足型、阴虚火旺型、 心火亢盛型等, 其中肾阴虚型占了较大比重 [ 2]。中药抗焦虑基 础研究, 多借助于焦虑装置观察, 不能体现中医药的证候特点。 因此, 我们对甲亢阴虚模型的焦虑状态进行观察, 以评价其作 为阴虚焦虑模型的可行性。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1. 1 试验药物 甲状腺片:济南维尔康生化制药有限公司,批 号: 0607504, 规格: 40mg /片, 用时水洗去糖衣,研成粉末, 用 0. 5% CMC-N a溶液配制成 320m g /kg混悬液。地西泮片: 天津力 生制药股份有限公司 ,批号: 0601001, 规格: 2. 5mg /片, 用时水洗 去糖衣, 研成粉末,用 0. 5% CMC-Na溶液配制成 2. 0m g /kg混悬 液。 1. 2 动物 昆明种小鼠,体重 20 ? 2g, 雄性, 分笼饲养在 20 ? 2e 的动物室,专人负责饲养和管理。实验鼠喂饲为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 全价饲 料,以上均购自郑州大学医学院实验动物中心。小鼠生产许可 证号: SCXK (豫 ) 2005-0001。 1. 3 试剂 C-氨基丁酸 ( GABA ): S igm a公司, 上海化学试剂站 分装,批号: 050213;谷氨酸 ( G lu): Sigm a公司, 上海化学试剂站 分装,批号: 050321; GABAAR1兔 IgG多克隆抗体: 武汉博士德 生物工程有限公司, 批号: 060318; SABC免疫组化试剂盒: 武汉 博士德生物工程有限公司, 批号: 060321; NMDAR1兔 IgG多克 隆抗体:武汉博士德生物工程有限公司, 批号: 060323。 1. 4 仪器 高架十字迷宫装置,成都泰盟科技有限公司。 小鼠明暗箱装置: 参照文献自制 [ 2, 3] ,实验装置包括相连 的明暗两个小室组成。整个装置为一个 44cm @ 21cm @ 21cm的 动物笼, 笼的 1 /3为暗室, 2 /3为明室,一块 21 cm @ 21cm中间有 洞的隔板将明暗室分开,小鼠可在明暗室之间自由活动。 1. 5 方法 1. 5. 1 行为学实验 雄性小鼠 30只随机分为 3组, 分别为对 78 中药药理与临床 2008; 24( 5) * 基金项目:河南省高校杰出科研人才创新工程项目,编号: 2005KYCX006 照组、阴虚模型组、地西泮组, 灌胃以 0. 2m l/10g容积给药,每组 上午 8: 00除对照组外, 均灌胃给予 320m g /kg甲状腺片混悬液, 对照组给予同体积 0. 5% CMC-N a混悬液,连续灌胃 9天,于第 7 天开始, 每天下午 15: 00对照组和阴虚模型组分别给予同体积 0. 5% CMC-Na混悬液, 地西泮组给予 2. 0m g /kg地西泮片混悬 液, 连续给药 3天, 第 10天上午 7: 00给药 (同第七、八、九天下 午给药 ) 1h后做高架十字迷宫实验和明暗箱实验, 分别 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 在 实验期内小鼠在十字迷宫中 ( 5m in)进入开臂的时间比和次数 比及在明暗箱中 ( 10m in)穿箱次数。 1. 5. 2 GABA和 G lu的含量测定 行为学测试结束后, 立即断 头处死, 冰台上迅速剪开颅盖和脑膜, 剥离大脑, 沿矢状缝切成 左右半球, 左脑置于液氮中保存, 用于 GABA和 G lu的含量测 定; 右脑以 10%甲醛溶液固定, 用于 GABAAR1和 NMDAR1表 达的测定。 样品处理 取出大脑半球漂洗、拭干、称重 ( 1m in内完 成 ) ,用预冷的 80%酸化乙醇在冰浴中迅速制成 1B 15的匀浆。 匀浆置冰箱内放置 1h后,以 3500rpm 4e 离心 20m in, 取上清液 用适量氯仿充分乳化 ,再以同样条件离心 30m in,吸取上层水相 供点样用。薄层层析条件: 吸附剂为硅胶 G, 羧甲基纤维素钠为 粘合剂, 玻璃板规格为 10cm @ 20cm, 铺板厚度为 0. 5mm, 室温 干燥, 用前烘箱 105e 活化 20~ 30m in。GABA展开条件: 正丁 醇B冰乙酸B水 ( 13B 3B 4) ; G lu展开条件: 正丁醇 B冰乙酸B 水 ( 13B 4B 4)。室温下 GABA展开 5h, G lu展开 4h,取出晾干, 10g /L茚三酮乙醇液喷雾显色, 晾干, 置 105e 烘箱内烘 5 ~ 7m in,至出现紫红色斑点。于薄层板上覆盖同样大小的玻璃板, 周围胶布固定, 放冷,扫描。测定波长: Ks= 530nm, KR= 450nm。 GABA含量测定 样品溶液 8L ,l对照品溶液 1L l和 3L ,l分 别点于同一硅胶 G薄层板上, 按上述条件展开, 测定, 测得供试 品溶液吸收度积分值和对照品溶液积分值, 按外标两点法计 算。 G lu的含量测定 样品溶液 4L ,l对照品溶液 2L l和 4L ,l分 别点于同一硅胶 G薄层板上, 按上述条件展开, 测定, 测得供试 品溶液吸收度积分值和对照品溶液积分值, 按外标两点法计 算。 1. 5. 3 GABAAR1和 NMDAR1表达 将右脑组织在福尔马林 液中固定 24h, 取出,经梯度乙醇洗脱, 二甲苯透明后石蜡包埋, 于海马部位连续冠状切片, 厚度 5um, 切片用于 HE 染色、 GABAAR1和 NMDAR1免疫组织化学染色。 组织切片进行脱蜡, PBS液冲洗 3次 (每次 5m in) , 双氧水 封闭 15m in,再用 PBS液冲洗 3次 (每次 5m in),进行抗原修复, PBS液冲洗 3次 (每次 5m in), 加入正常羊血清孵育 20m in, 甩 干, 每张 切片直接 加 50L lÑ 抗 (兔 抗, GABAAR11 B 50, NMDAR11B 80稀释 ) , 4e 孵育过夜, PBS冲洗后加 50L l/片生 物素标记的羊抗兔 Ò抗处理 40m in, PBS 液冲洗 3次 (每次 5m in), 生物素标记的辣根过氧化物酶 ( ABC, AB BB C= 1B 1B 400, 提前 60m in配制 )振荡孵育 2h, PBS液冲洗 3次 (每次 5m in), 用新鲜配制的质量分数为 0. 03%H 2 O 2 , 0. 05%二氨基联 苯胺 ( DAB)显色, 适时用 PBS液中止反应, 苏木素复染、蓝化, 乙醇梯度洗脱, 二甲苯透明,中性树脂封片。免疫组化空白对照 组不加第Ñ抗体, 用 PBS液代替, 其余步骤同前。免疫反应阳 性标志: 细胞浆染为棕黄色, 细胞复染为蓝色。光镜观察 GABAAR1及 NMDAR1免疫组化切片并摄片, 随机选取 4个等 面积高倍视野 ( 400倍 ), 采用高清晰度图象采集系统进行图像 采集,用 B iosers D ig ita l分析系统对染色阳性细胞进行定量分 析,以阳性区平均积分光密度表示阳性细胞表达的情况。 2 结果 2. 1 焦虑行为观察 与对照组比较, 阴虚模型组进入开臂时间 百分比 ( TO% )、次数百分比 ( OE% )以及穿箱次数均明显减少, 提示阴虚能加重小鼠的焦虑;与模型组比较, 给予地西泮的阴虚 小鼠各项行为指标接近对照组, 提示地西泮能对抗阴虚所致焦 虑,见表 1。 表 1 小鼠高架十字迷宫及明暗箱行为的观察 (€x ? s, n= 10) 组别 剂量 ( g /kg) 开臂时间百分比 ( OT% ) 开臂次数百分比 ( OE% ) 穿箱次数 (次 ) 正常对照 47. 3 ? 4. 1* 43. 8 ? 5. 6* 24. 3 ? 2. 1* 阴虚模型 39. 4 ? 5. 7 36. 4 ? 4. 8 17. 4 ? 4. 7 地西泮 0. 002 47. 7 ? 4. 8* 43. 6 ? 1. 8* 24. 5 ? 1. 8* * 与模型组比较 * P < 0. 05, * * P< 0. 01(下同 ) 2. 2 对递质、受体影响 与对照组比较, 阴虚模型组脑组织 抑制性递质 GABA含量明显减少, 而兴奋性递质 G lu含量显著 增加, G lu /GAB显著增高; GABAAR1受体表达降低, NMDAR1 受体表达升高。西泮明显升高阴虚小鼠 GABA含量, 见表 2、表 3。 表 2 小鼠脑内 GABA、G lu含量的变化 (€x ? s, n= 10) 组别 剂量 ( g /kg) GABA (L g /g ) G lu (Lg /g ) G lu /GABA 正常对照 81. 8 ? 9. 3* 283. 6 ? 141. 2* * 3. 6 ? 2. 1* * 阴虚模型 49. 3 ? 5. 6 580. 3 ? 96. 5 12. 0? 2. 9 地西泮 0. 002 120. 0 ? 37. 0* * 284. 3 ? 121. 9* * 2. 4 ? 0. 8* * 表 3 小鼠脑内 GABAAR1和 NMDAR1平均积分光密度值变化 ( €x ? s) 组别 剂量 ( g /kg) 鼠数 (只 ) 平均积分光密度值 GABAAR1 NMDAR1 正常对照 10 82. 9 ? 0. 6 84. 6? 0. 6 阴虚模型 10 82. 1 ? 0. 4 85. 9? 0. 8 地西泮 0. 002 10 82. 9 ? 0. 5 84. 5? 1. 0 3 讨论 观察药物抗焦虑的药效应在焦虑动物模型上进行, 一般采 用穿梭箱、高架十字迷宫等焦虑实验装置。根据中医辨证施治 的原则,我们开展甲亢阴虚小鼠焦虑状态的观察, 以期获得阴虚 焦虑小鼠实验模型。实验结果表明, 甲亢阴虚模型小鼠与对照 组比较,高架十字迷宫实验中进入开臂的时间比和次数比显著 降低,在明暗箱实验中穿箱次数显著减少, 有明显的焦虑状态增 强表现;这种焦虑加重状态,可被地西泮对抗。因此, 甲亢阴虚 加装置的复合模型可以做为阴虚焦虑模型使用。 C-氨基丁酸 ( GABA )是中枢的主要抑制性递质, C-氨基丁 酸与其受体结合介导抑制性的神经过程。其中, GABAA受体与 氯 ( C -l )离子通道偶连, GABAA与 GABA相互作用, 则促使与其 连接的 C -l离子通道开放, 介导抑制性神经过程。GABAA受体 激动剂具有抗焦虑作用。研究表明, 哺乳动物大脑中许多脑区 存在苯二氮 受体结合位点,这一受体与抑制性神经递质 C-氨基 79中药药理与临床 2008; 24( 5) 丁酸的受体相邻接, 苯二氮 类与其受体结合可促进 GABA的功 能, 产生抗焦虑作用。兴奋性氨基酸能神经介导中枢神经的兴 奋过程, 抑制兴奋性氨基酸能神经可能在抗焦虑治疗中有重要 意义。本实验中观察到,甲亢阴虚模型组与对照组比较, 小鼠脑 内 GABA含量显著降低、G lu含量显著增加, GABAAR1平均积 分光密度值降低、NMDAR1平均积分光密度值增加, 提示甲亢 阴虚状态不仅增强了抑制性氨基酸能神经的兴奋性, 又增强了 兴奋性氨基酸能神经的兴奋性,因此导致焦虑状态加重。 参考文献 1 张亚林,主编.神经症理论与实践.北京: 人民卫生出版社. 第一版, 2000B 179 2 崔瑛,冯静,王世宏,等.焦虑症的中医用药及组方规律探讨.中国临 床康复, 2004; 8 ( 18) B 3620~ 3621 间隙性人工呼吸合并拉钩扩胸法在大鼠急性心肌缺血模型中的应用* 刘剑毅 1,温红艳 2,黄崇刚 1,罗先钦 1,徐嘉红 1* * ( 1重庆市中药研究院,重庆 400065; 2云南省丽江市生物资源开发创新办公室, 丽江 674100) 摘 要 目的: 改进大鼠冠脉结扎急性心肌缺血模型, 提高动物存活率并探讨模型制备关键点。方法: 采用间隙性人工呼吸 合并拉钩扩胸法对大鼠冠脉结扎急性心肌缺血模型进行改进。结果: 60只大鼠进行冠脉结扎造模术后存活 53只;模型组大鼠经心 电图、血清酶、心脏系数和梗塞区百分比测定表明急性心肌缺血模型造模成功。结论:改进后的造模方法简便易行,成功率高。 关键词 冠脉结扎;心肌缺血; 模型;大鼠 大鼠冠脉结扎心肌缺血模型 (以下简称大鼠冠脉结扎模 型 )作为一种经典、快速的急性心肌缺血模型, 在心血管药物的 研究中应用广泛, 但就模型本身而言还有很多值得改进之处, 下面笔者就该模型的改进探讨如下。 1 材料与方法 1. 1 动物 W istar大鼠 70只, 雌雄兼用,清洁级动物, 合格 证号: SCXK (渝 ) 20020004号, 重庆市中药研究院动物室提供。 试验时在重庆市中药研究院合格实验动物实验室 (合格证号: SYXK (渝 ) 20020002号 )饲养及观察。 1. 2 试剂 水合氯醛: 青岛红旗化工厂生产, 批号: 920501。 磷酸肌酸激酶 ( CK )、乳酸脱氢酶 ( LDH )试剂盒: 四川迈克科技 有限责任公司提供, 批号: 0403012、030411。TTC:上海化学试剂 公司提供, 批号: F20020401。 1. 3 仪器 SB-613D型心电图机: 日本光电公司生产; TKR- 200C型小动物呼吸机: 江西麻醉呼吸设备公司生产; 7020型全 自动生化分析仪: 日本 H ITACH I公司生产。 1. 4 方法 大鼠冠脉结扎按文献方法 [1]加以改进: 动物用水 合氯醛 ( 300m g /kg)腹腔注射麻醉后仰位固定于自制固定板,正 中纵向剪开颈部皮肤, 分离气管并在气管旁垫一消毒棉球, 气 管剪一小口以备插管; 连接心电图机以标准 Ò导联检测心电; 于左锁骨中线处纵向剪开胸部皮肤 2cm 左右, 仔细钝性分离肌 肉层, 注意不要弄破胸膜。气管插管接呼吸机 (第一次 ), 潮气 量 3m l/100g体重, 60~ 70次 /分, 迅速剪断 3、4肋骨并用自制弹 力拉钩 (在木板左右各钉一颗钉子, 用来固定橡皮筋连接的小 钩,充当扩胸器 )固定胸壁, 充分暴露心脏, 用镊子小心提起心 包膜并剪开;取下拉钩用手捏紧大鼠胸部开口, 抽出气管插管, 使大鼠自主呼吸 1分钟左右。待其呼吸平稳后第二次插管及用 拉钩固定胸壁,两只细棉签分别略微固定心尖及左心耳,在肺动 脉圆锥与左心耳之间冠状动脉左前降支处穿线结扎, 迅速缝合 外部皮肤关闭胸腔, 取下呼吸机, 手指轻微节律性挤压大鼠胸 部,帮助其恢复自主呼吸。假手术组只行手术穿线, 而不结扎冠 状动脉。记录大鼠结扎前及结扎后 1m in、5m in、10m in、15m in、 30m in、1h和 4h的标准Ò导联心电图, 测定 T波及 J点电压, 计 算其变化值。4h后股动脉放血处死动物, 测定血清 CK、LDH; 取心脏用生理盐水洗净心腔内积血,去掉心房组织, 称重并计算 心脏系数;将心室心肌横切 7~ 8片, 定量组织学 ( TTC染色法 ) 测定心肌梗塞范围。 2 结果 60只造模大鼠术后存活 53只, 存活率达 88%。与假手术 组相比,模型组大鼠冠脉结扎后心电图出现明显缺血性改变,各 个时间点 T波、J点均明显偏移, 血清 CK、LDH活性、心脏系数 及心肌梗塞区百分比明显增加, 表明急性心肌缺血模型造模成 功,见图 1、表 1。 80 中药药理与临床 2008; 24( 5) * 重庆市科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目资助,项目编号 01- 6609- 1 * * 通讯作者