ox_LDL对巨噬细胞表达miRNA_155和miRNA_146a_b的影响

第 17卷 � 第 4期 河南医学研究 Vo.l 17� � No. 4 2008年 � � 12月 HENAN � MED ICAL � RESEARCH D ecem ber 2008 收稿日期: 2008�08�27; 修订日期: 2008�09�06 基金项目: 国家重点基础研究发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 ( 973 计划 No: 2007CB512000)。 作者简介: 姚瑞 ( 1979�), 女,河南信阳人,医学博士, 主治医师, 研究方向为心血管免疫学和分子生物学。 通讯作者: 程翔,医学博士, 副教授, E�m ai:l na thancx@ sina. com. 文章编号: 1004�437X ( 2008) 04�0317�03 �基础研究 � ox�LDL对巨噬细胞表达 m iRNA�155和 m iRNA�146a/b 的影响 姚 � 瑞 1, 程 � 翔 1, 张金盈 2, 廖玉华 1, 余 � 娴1, 唐婷婷 1, 聂少芳1 ( 1.华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科 � 湖北武汉 � 430022; 2. 郑州大学第一附属医院心内科 � 河南郑州 � 450052) 摘要: 目的: 探讨氧化低密度脂蛋白 ( ox�LDL )刺激对巨噬细胞表达 m iRNA�155和 m iRNA�146a /b的影响。 方法: 培养人巨噬细胞,随机分为三组: 空白对照组、ox�LDL ( 10 �g /mL )组和 ox�LDL ( 20 �g /mL )组, 刺激 6 h后, 收集细胞,实时定量 PCR方法检测 m iRNA�155和 m iRNA�146a /b的表达。结果: ox�LDL刺激可以增加 巨噬细胞表达 m iRNA�155和 m iRNA�146a /b, 且呈浓度依赖性。结论: m iRNA�155和 m iRNA�146a /b可能参 与 ox�LDL致动脉粥样硬化过程。 关键词: 氧化低密度脂蛋白; m iRNA�155; m iRNA�146a /b; 巨噬细胞 中图分类号: R329� � 文献标识码: A Effect of ox�LDL on the expressions of m iRNA�155 and m iR� NA�146a /b in macrophage YAO Ru i 1 , CHENG X iang 1 , ZHANG Jin�y ing2, L IAO Yu�hua1, YU X ian1, TANG T ing�t ing1, N IE Shao�fang1 ( 1. D epa rtm en t of Ca rd iology, UnionH ospital, Tong jiM ed ica l Colleg e of Huazhong Un iversity of S cien ce and T echnology, Wuhan 430022, Ch ina; 2. D epartm en t of Card iology, th eF irstAff iliated H osp ita l, Z hengzhou Universi ty, Zheng zhou 450052, C hina ) Abstract: Objective: To investigate the e ffect o f ox�LDL on the expression of m iRNA�155 and m iRNA�146a /b in macrophage.M ethods: H um anmacrophages w ere cu ltured. And d ifferent con� centrat ions of ox idat ive low�density lipoprote in ( ox�LDL) ( 0, 10 �g /mL and 20 �g /mL) w ere used to stimu late the macrophages respect ively. And then rea l�time RT�PCR was used to detected the expressions o f m iRNA�155 and m iRNA�146a /b. Results: ox�LDL stimulation could increase the expressions o fm iRNA�155 andm iRNA�146a /b in macrophage. And the increasing w as posi� t ive ly re lated to the concentration of ox�LDL. Conclusion: m iRNA�155 andm iRNA�146a /b m ight take part in the pro�atherosclerosis process by ox�LDL. Keywords: ox�LDL; m iRNA�155; m iRNA�146a /b; macrophage � � M icroRNA (m iRNA )是一种内源性、大小约 22个 核苷酸、不能编码蛋白质的单链小分子 RNA, 可以通 过特异性靶基因沉默来调控基因表达 [ 1]。研究表明 m iRNA s在物种间具有高度的保守性、细胞或组织特 异性、时序性和位相性 [ 2] ,因此 m iRNAs在生物发育过 程中发挥重要作用,对基因功能研究、人类疾病防治及 生物进化探索具有重要意义。迄今为止, 已发现 500 多种 m iRNA s与人类有密切关系, 其中又有多种和心 血管系统相关 [ 3] , m iRNA s在心血管疾病中的重要作 �317� 河南医学研究 第 17卷 用正引起国内外学者的极大关注。 研究表明 m iRNA�155和 m iRNA�146a /b是参与免 疫炎症反应最重要的两种 m iRNAs, 可以在巨噬细胞 大量表达 [ 4, 5]。动脉粥样硬化是免疫炎症性血管疾 病,氧化低密度脂蛋白 ( ox�LDL)在其中发挥至关重要 的作用,而 ox�LDL是否和 m iRNA�155、m iRNA�146a /b 相关, 目前尚无报道。基于此, 本研究初步探讨 m iR� NA�155, m iRNA�146a /b与 ox�LDL 的相关性, 从而为 明确 m iRNAs调控免疫炎症反应机制及动脉粥样硬化 的防治奠定基础。 1� 材料与方法 1. 1� 材料 � 人单核细胞株 THP�1(中科院细胞库 ) ,佛 波醇肉豆蔻酸乙酸酯 ( PMA, B iov ision公司 ), ox�LDL ( sigma公司 ) , 胎牛血清、RPM I M edium 1640 ( G IB� CO), T rizo l( Invitrogen)。 1. 2� 细胞培养 � 按传统方法进行培养和传代。细胞 为椭圆形或类圆形, 悬浮生长, 0. 4%台盼蓝测定细胞 存活率 > 95%。细胞生长达一定数量后分瓶, 转分化 的细胞在培养液中加入 PMA ( 160 nmo l/L ) , 37 , 5% CO 2条件下培养 48 h, 使 THP�1细胞分化成为巨噬 细胞。分化良好的巨噬细胞呈阿米巴样贴壁生长, 伸 出伪足,富含颗粒,具有巨噬细胞的特点。调整细胞数 为 4 ! 106 /mL,更换为无血清 RPM I 1640培养基,继续 培养。 1. 3� 细胞分组及处理 � 将培养的巨噬细胞随机分为 以下 3组: ∀空白对照组; # ox�LDL( 10 �g /mL)刺激 组:将培养的细胞加入 ox�LDL 10 �g /mL, 刺激 6h; ∃ ox�LDL( 20 �g /mL)刺激组:将培养的细胞加入 ox�LDL 20 �g /mL刺激 6 h。随后收集细胞。 1. 4� 实时定量 PR�PCR检测 � 取收集的细胞, 采用 Trizo l一步法抽提总 RNA, RT�PCR法逆转录至 cDNA, 所有引物均参照 Genebank提供的序列, 采用 Primer 5. 0,由上海生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 公司合成。引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 如下: m iRNA�155: 5 % �CCAAAGGAATCACTGGAGGA�3 ( fo rw ard) and 5% �CCCACAGGTCACTAGGCA AT�3% ( reverse) ; m iRNA�146a: 5% �CAGCTGCATTGGATTTACCA�3% ( forw ard ) and 5% �GCCTGAGACTCTGCCTTCT G�3 % ( reverse) ; m iRNA�146b: 5 % �AGACCCTCCCTGGAATAGGA� 3 % ( forw ard ) and 5% �CACCTGGCTGGGAAGTTG�3% ( reverse) ; U6: 5 % �TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG�3 % ( forw ard) and 5% �TAGAAGGCACAGTCGAGG�3% ( re� verse) 1. 4� 统计学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 � 采用 SPSS13. 0 forw indow s统计软 件包进行统计学处理。数据以均数 & 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差 ( x & s)表 示,各组数据进行正态性和方差齐性检验,两样本的均 数比较采用 t检验,检验水准 �= 0. 05。 2� 结果 2. 1� ox�LDL对 m iRNA�155的影响 � ox�LDL刺激巨 噬细胞可以增加 m iRNA�155的表达, 随着 ox�LDL刺 激浓度的增加, m iRNA�155表达增加,见图 1。 2. 2� ox�LDL对 m iRNA�146a/b的影响 � ox�LDL刺 激可以同时增加 m iRNA�146a和 m iRNA�146b的表达, 且呈浓度依赖性,见图 2。 3� 讨论 m iRNA是一种不能编码蛋白质的单链小分子 RNA,它由 m iRNA基因表达出具有发夹结构的、约 70 �318� 第 4期 ox�LDL对巨噬细胞表达 m iRNA�155和 m iRNA�146a /b的影响 ~ 90个核苷酸的单链 RNA前体 ( pre�m iRNA), 再经过 D icer酶加工后生成,它不同于 siRNA (双链 RNA ), 但 是和 siRNA密切相关。其作用机制: 通过其反义链与 靶 mRNA分子的 3%端非编码区域 ( 3% �untranslated re� gion, 3% UTR )完全互补结合或者不完全互补结合、切 割同源性靶 mRNA分子或抑制其翻译, 导致特异性靶 基因沉默来调控基因表达 [ 6]。每个 m iRNA可以有多 个靶基因, 而几个 m iRNAs也可以调节同一个基因。 这种复杂的调节网络既可以通过一个 m iRNA来调控 多个基因的表达, 也可以通过几个 m iRNAs的组合来 精细调控某个基因的表达。m iRNAs在特定的细胞或 组织、时间、发育阶段才会表达, 这决定了组织和细胞 功能的特异性,对组织的发育具有鲜明的时序性和位 相性 [ 2] , 因此, m iRNAs正成为最热点的研究领域 之一。 动脉粥样硬化是一慢性免疫炎症性血管疾病, ox� LDL介导的氧化应激和炎症反应在其中发挥关键的作 用。目前研究表明, 有多种 m iRNA s参与血管免疫炎 症反应, m iRNA�155和 m iRNA�146是其中最重要的两 种 [ 3]。在人类, m iRNA�155和 B IC基因共同定位于 21 号染色体 [ 4 ] ; m iRNA�146家族包括两个成员, m iRNA� 146a和 m iRNA�146b,分别定位于 5号染色体和 10号 染色体, 两者的区别是 3%端有两个核苷酸不同 [ 7]。 m iRNA�155和 m iRNA�146是先天免疫反应的有效调 控因子,且 m iRNA�155是维持正常免疫功能必须的因 子 [ 8, 9]。由于 ox�LDL和 m iRNA�155、m iRNA�146都在 免疫炎症反应中扮演重要角色,我们推测,两者之间可 能存在一定的关系。 基于此,本研究采用不同浓度 ox�LDL刺激人巨噬 细胞, 结果显示 m iRNA �155和 m iRNA �146a /b对 ox� LDL的刺激反应均表现为浓度依赖性的表达上调。由 于 m iRNA s对免疫炎症反应的调控可能是通过对炎症 信号通路的反馈调节起作用,因此, 我们认为针对 ox� LDL刺激后, m iRNA�155和 m iRNA�146a /b的表达增 高可能是一种反应性增加,机体可能通过 m iRNA�155 和 m iRNA�146a /b等的表达增高反馈性调控炎症信号 通道,从而对抗 ox�LDL的致炎作用。 由此可见, m iRNA�155和 m iRNA�146a /b可能参 与 ox�LDL致动脉粥样硬化过程。进一步明确 m iRNA� 155和 m iRNA�146a /b参与动脉粥样硬化过程的具体 环节,将有可能为动脉粥样的防治开辟新的治疗靶点。 参考文献 [ 1] � Bartel DP. 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