氧化苦参碱对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响

氧化苦参碱对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响 氧化苦参碱对免疫功能低下小鼠免疫功能 的影响 昆明医学院2009,(6):53,56 JournalofKunmingMedicalUniversity CN53—1049/R 氧化苦参碱对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响 温先敏",杨缅南",刘德权' (1)云南名扬药业有限公司新药研发部实验室,云南昆明650011;2)昆明医学院第三附属医院乳 腺科,云南省乳腺癌临床研究中心,云南昆明650118) [摘要]目的观察氧化苦参碱对免疫低下小鼠免疫功能的影响,寻找氧化苦参碱治疗慢性乙型肝炎的可 能机制. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 采用环磷酰胺建立免疫低下小鼠模型,小鼠腹腔注射氧化苦参碱后,观察氧化苦参碱对小鼠网 状内皮系统吞噬廓清能力,对T淋巴细胞酯酶染色率,对二硝基氯苯所致迟发型超敏反应的影响和对小鼠血清 溶血素抗体的影响.结果氧化苦参碱能抑制T淋巴细胞酯酶染色率,增强网状内皮系统的吞噬能力,但对迟 发型超敏反应和血清溶血素抗体无明显影响.结论氧化苦参碱对免疫低下小鼠的细胞免疫具有明显抑制作 用,并能增强其非特异性免疫. [关键词]氧化苦参碱;免疫调节;细胞免疫 [中图分类号]R96[文献标识码]A[文章编号]1003—4706(2009)06—0053—04 EffectofOxymatrineonImmunologicalFunctionsof ImmunocompromisedMice WENXian—min",YANGMian—nan",LIUDe—quan2】 (1)Dept.ofNewMedicineResearchandDevelopment,YunnanMingyangthePharmaceutic alLimited Company,KunmingYunnan650011;2)Dept.ofMammaryCancer,The3rdAffiliatedHospitalof KunmingMedicalUniversity,KunmingYunnan650118,China) [Abstract]ObjectiveToobservetheeffectofoxymatrineonimmunologicalfunctionsof immunocompromisedmicewiththehopetofindoutthelikelymechanismintreatingchronichepatitisB.Methods Immunocompromisedmicewereadministratedwithoxymatrineofdifferentdosages,then,theabilityof reticuloendothelialsystem,thecarboxylesterasedyeingrateofT— leukomonocyte,thedelayedtype hypersensitivityinducedbydinitrochlorobenzol,andtheantibodyofserumhemolysinwereobserved.Results Oxymatrinewasablenotonlytoinhibitthecarboxy1esterasedyeingrateofT-~leukomonocyte,buttoenhancethe ? abilityofreticuloendothelialsystem.Therewasnosignificanteffectsontheothers.ConclusionOxymatrinecan inhibitcellmediatedimmunity,andenhancenonspecificimmunity;whichCan.. beoneofthemechanismsin treatingchronichepatitisB. [Keywords]Oxymatrine;immunomodulation;cellmediatedimmunity 氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)临床上主要 用于治疗慢性乙型病毒性肝炎I],临床疗效确切, 是中华医学会重点推广的一种治疗乙型肝炎的药 物.慢性乙型病毒性肝炎常伴有免疫功能失调, 治疗慢性乙型病毒性肝炎需长期用药,口服是较 好的给药方式.目前慢性乙型病毒性肝炎的治疗 [作者简介]温先敏(1959,),男,山西长治市人,医学博士,副主任医师,主要从事药物 研究与开发工作 [通讯作者]刘德权.E-maihgaoligongshan@sohu.COIn 昆明医学院第30卷 主要是通过抗病毒和免疫调节来治疗,本研究从 免疫角度出发,初步探讨OMT调节免疫的机制. 1材料与方法 1.1实验材料 ICR小鼠,l8,24g,雄性,由南华大学医学 院提供.OMT由宁夏盐池丰利源生物化工制品有 限公司提供;环磷酰胺(cvcl(1phosphamide,CTX) 由上海华联制药有限公司提供;印度墨汁 D一48161(Manster);0[一醋酸酯酶(中科院上海 生化研究所);二一乙醇单甲醚(上海永生试剂 厂),孔雀绿(上海标本模型厂);副品红(上海 试剂三厂),二硝基氯苯(DNCB)由上海试剂一 厂提供,用前用丙酮麻油(1:1)配制. 小鼠随机分为OMT低(18.8mg/(kg.d),中(37.5 mg/(kg.d),高(75.0mg/(kg.d)三个剂量组及阴性对照 (生理盐水)组和阳性对照(左旋咪唑(3.75mg/kg)) 组,每组l0只,均进行腹腔注射(ip)给药.其中 OMT的高浓度为小鼠腹腔注射LD50的1/1041. 755PC型分光光度计由上海光谱仪器有限公 司生产,32型生物显微镜由日本奥林巴斯公司 生产. 1.2对免疫功能低下小鼠网状内皮系统炭粒吞噬 廓清能力的影响(炭粒廓清法) 小鼠每日上午腹腔注射给药,下午给予CTX, ,连续5d,末次给药后24 10mL/kg,每天1次 h,于鼠尾静脉注入稀释印度墨汁O.1mL/lOg体 重,注入墨汁后1rain和10rain,用特制吸管从 小鼠眼眶后静脉丛取血25L,吹人0.1%Na2CO 液2mL,并充分洗出吸管壁附着之血液,取血完 毕以25L正常小鼠血溶于2mL0.1%Na2CO液 调零,于675nm处比色.完毕后脱颈椎处死小 鼠,解剖,取肝脏,脾脏并称重,计算脏器指数, 吞噬指数K和吞噬系数j. 吞噬指数K—LgC1-Lg , C2一 』一』』 吞噬系数仅=K WLL) c:血中炭粒浓度;T:时问,w:体重;WLS:肝 脾合重. 1.3对免疫功能低下小鼠T淋巴细胞酯酶染色率 的影响 小鼠每日上午腹腔注射给药,下午给予CTX, 10mL/kg,连续5d,末次给药后4h,眼眶后静 脉丛取血0.5mL,静置于载玻片上,迅速推成均 匀的血涂片,并将玻片冷风迅速吹干,浸入已预 热30min的孵育液中37?孵育3h,并用自来水 冲洗3,5rain,去沉渣,用滤纸吸干水珠.然后 将玻片置入0.067mMpH7.6的磷酸缓冲液89mL 中并缓慢滴入六偶氮副品红液6mL,充分混匀后 再慢滴2%的,醋酸萘酯溶液2.5mL,边滴边 摇,并在酸度计上用冰醋酸调pH至6.4.再加 1%孔雀绿溶液复染5,10s,自来水冲洗,滤纸 轻轻吸拂,冷风吹干备检IS,61. 1.4对免疫功能低下小鼠迟发型皮肤过敏的影响 小鼠每天上午腹腔给药,下午给予CTX,10 ml/kg,第2天后动物腹部去毛(面积3cm×3 era),将1%DNCB丙酮麻油液5OL均匀涂抹致 敏.并继续给药4d,第5天将1%DNCB溶液20 L均匀涂于右耳(两面),24h后,颈椎脱臼处 死小鼠,剪下左右耳朵,用8mm直径打孔器取 下同面积左右耳片,称重,以左右耳片重量差为 肿胀度_5_61. 1.5对免疫功能低下小鼠溶血素抗体的影响 各组小鼠每日上午腹腔注射给药,下午给予 CTX10mL/kg,给药第2天,均腹腔注入绵羊红细 胞(sR~c)3:5V/V,0.2mL/只鼠,连续给药6d;末次 给药1h后,眼眶取血,静置1h后,2000r/rain离心, 取血清50L,用生理盐水40倍稀释,37?温 箱孵育20min,2000r/rain离心10min.取上清 液1mL,加入都氏液3mL,于540Iim处测OD 值,放置10rain以上测定,另取SRBC0.25mL 加入都氏液4mL,测定半数溶血时吸收值I5.61. 1.6统计学处理 实验数据以x?S表示,采用单因素方差分 析,组问两两比较采用最小差异法(LSD法),以 P<0.05为具有统计学意义. 2结果 2.1对免疫功能低下小鼠网状内皮系统炭粒吞噬 廓清能力的影响 氧化苦参碱增强免疫低下小鼠的吞噬指数K 和吞噬系数仅,与NS组比较差异有统计学意义, 见图1A,B. 第6期温先敏,等.氧化苦参碱对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响55 2.2对免疫功能低下小鼠T淋巴细胞酯酶染色率 的影响 OMT增强免疫低下小鼠的T淋巴细胞酯酶染 色率,见图2. 2.3氧化苦参碱对免疫功能低下小鼠迟发型超 敏反应(DTH)的影响 OMT对免疫低下小鼠两耳肿胀度与NS组比 有升高趋势,但差异无统计学意义,见图3. 2.4氧化苦参碱免疫功能低下小鼠溶血素抗体的 影响 左旋咪唑组对CTX致免疫低下小鼠血清溶血 素抗体呈明显增加,而OMT3个剂量组对抗体的 生成有增加趋势,但与NS组比较未见显着性差 异,见图4. IlIllIIItl~l:t左旋咪哇耋HoIIT低姐T中组0耵高组 ^簸化苦参科吞毫指报(k)的髟畸 25 ,?2 5 甘0 窿05-iI-I???惦五震晖哩OUT4~O_仲0?T爵 图3氧化苦参碱对小鼠二硝基氯苯所致DTH的影响 ?s) Fig.3Thedelayedtypehypersensitivityinducedby dinitrochlorobenzolaffectedbyoxymatrinein immunocompromisedmice?s) 与NS组比较,P<0.05,每组/t=10. 一 I'' 0 S.. 趔' o8 0 .. 逛n 妊 .. O 爵五?I嘎皿t饵T啊T? 图4氧化苦参碱对CTX致免疫低下小鼠溶血素抗体的影 响?) Fig.4eantibodyofserll/llhemolysinaffectedby oxymatrineinimmunocompromisedmice (?s) 与NS组比较,P<0.05;与左旋咪唑组比较,< O.O5,每组n:10. Ns组左攘味.宝缉.舯低组.IIT中组o.1T赢组3讨论 B氯化苦参曩对吞啦系数(a)的影响 图1氧化苦参碱对免疫功能低下小鼠网状内皮系统吞噬 功能的影响?s) Fig.1Theabilityofreticuloendothelialsystem越f_ fectedbyoxymatrineinimmunocompromised mice(互?) 与NS组比较,P<0.05,每组=10. ?I"i左旋眯睦0-T低0中OIIT高 图2氧化苦参碱对免疫功能低下小鼠T淋巴细胞酯酶染 色率的影响?s) Fig.2ThecarboxylesterasedyeingrateofT—leuko— monocyteaffectedbyoxymatrineiniIIllllUIIO— compromisedmice(?s) 与NS组比较,P<0.05;与左旋咪唑组比较,< 0.05,每组n=10. ICR小鼠腹腔注射给药18.75,75.0mg/kgOMT 后,OMT对小鼠网状内皮系统的吞噬功能有增强 作用,而对溶血素抗体形成无明显影响,但具有 T此剂量范围内对免疫低 增强的趋势,提示OM 下小鼠的非特异性免疫和体液免疫有一定的增强 作用.同时OMT可明显减少正常小鼠T淋巴细 胞酯酶染色率;但对正常小鼠二硝基氯苯所致迟 发性超敏反应无明显抑制作用,这表明小鼠腹腔 注射给药l8.75,75.0mg/kgOMT可以一定程度上 降低小鼠的细胞免疫.由于慢性乙型肝炎的患病 因素是多种原因的,导致的直接原因与自身的细 胞免疫关系密切,但OMT对乙肝病毒没有直接 的杀灭或抑制作用[71,这表明OMT对免疫低下小 鼠的免疫作用主要是抑制细胞免疫,有利于减少 炎症的发生,减少肝细胞的坏死,这恰是慢性肝 ?坫m0 ? 一褂鞋普导曲蒸LIJ 昆明医学院第30卷 (上接第38页) [参考文献] [1]JONASSONP,LILJEQVISTS,NYGRENP,eta1. Gene— ticdesignforfacilitatedproductionandrecoveryof recombinantproteinsinEscherichiacoli[J].Biotechno1 ApplBiochem,2002,35:91—105. [2]NILSSONB,ABRAHMSENL,UHLENM.Immobilizat— ionandpurificationofenzymeswithstaphylococcal proteinAgenefusionvectors[J].EMBOJ,1985,4(4): 1075—1080. 13jLEEYJ,JUNGKH.Modulationofthetendencyto— wardsinclusionbodyformationofrecombinantproteinby theadditionofglucoseinthearaBADpromotersystemof Escherichiacoli[J].JMicrobiolBiotechnol,2007,17 (11):I898—1903. 14jFARMERWR,LIAOJC.ReductionofAerobicacetate productionbyEscherichiacoli[J].Appliedand EnvironmentalMicrobiology,1997,63(8):3205—3210. [5jCARRIOMM,VILLAVERDEA.Constructionanddec— onstructionofbacterialinclusionbodies[J].Joumalof Biotechnology.2002.96:3—12. [6jSORENSENHP,MORTENSENKK.Solubleexpressi— onofrecombinantproteinsinthecytoplasmofEscherichia coli[JJ.MicrobialCellFactories,2005,4:1—8. [7』HAMMARSTROMM,HELLGRENN,BERGSV,eta1. Rapidscreeningforimprovedsolubilityofsmallhuman proteinsproducedasfusionproteinsinEscherichiacoli lJJ.ProteinScience,2002,11:313—321. 18JDIAMANTS,ELIAHUN,ROSENTHALD,eta1.Che— micalchaperonesregulatemolecularchaperonesinvitro andincellsundercombinedsaltandheatstresseslJ].J Bio1Chem,2001,276(43):39586—39591. [9]MACROA,VIGHL,DIAMANTS,eta1.NativefoldingO— faggregation-pronerecombinantproteinsinEscherichia colibyosmolytes,plasmidorbenzylachohol—overexpre— essedmolecularchaperones[J].CellStress&Chapero— nes,2005,10(4):329—339. (2009—03—17收稿)