浙江汉族RHD

浙江汉族RHD 536?中华医学遗传学杂志2006年1O月第23卷第5期ChinJMedGenet,Octo~r2006,Vo1.23,No.5 浙江汉族RHD1227A等位基因的 五个家系遗传研究 冻安心吕豪徐凤娟张丽英倪映华叶宏辉赵英 【摘要】目的研究DEL表型,RHD1227A等位基因的家系遗传规律.方法用吸收放散的血清学方 去鉴定RhDEL表型,用特异于RHD1227A等位基因的聚合酶链反应.序列特异性引物扩增方法(polymerase :hainreaction.sequencespecificprimer,PCR_ssP),RHD1227A等位基因第9外显子的序列分析方法和Rhesus hybridbox鉴定的方法来检测RHD1227A等位基因和RHD基因的杂合性.结果5个DEL表型先证者都 是RI-ID1227A等位基因阳性,同时缺失1个RI-ID等位基因,为RI-ID1227A/RHd杂合子;家系1,2,3的先证 蕾都有一位亲代成员携带RI-ID1227A等位基因,同时还携带正常RI-ID等位基因,为RI-ID1227A/RHD杂合 于,表现为正常D表型;家系1先证者子代遗传了RHD1227A基因,但是为RI-ID1227A/RHD杂合子,表现 勾正常D表型;家系2,4,5先证者的子代成员未遗传RHD1227A基因,为正常D表型.结论RI-ID1227A 尊位基因是DEL表型的重要遗传标记,相对于正常RHD等位基因隐性,而相对于缺失的RHd基因显性; RHD1227A等位基因为亲代遗传基因,而非个体基因变异. 【关键词】DEL表型;等位基因;家系调查 InvestigationofRHD1227AalleleinfivepedigreesinZhejiangHallpopulationCHENAn-xi n,LVHao,XU Feng-juan,ZHANGLi?,lg,NIYing-hua,YEHong-hui,ZHAOYing.(DepartmentofTransfusion,J~nhua ~ntralHospital,J~nhua,Zhejiang,321000P.R.Ch/na.Ema//:jha/xing78@sina.corn.cn);(CentralBloodBank 'Ql~holz,Quzhou,Zhejiang,324000P.R.Ch/na) 【Abstract】 ObjectiveToanalysisthegeneticmodeofRhDELphenotypeandRHD1227AalleleinZhejiang Hanpopulationthroughfamilyinvestigations.MethodsRhDELphenotypeswereidentifiedbyaserologicadsorption? elutionmethod.Twopolymerasechainreaction— sequencespecificprime(PCR-SSP)methodswhichdetectEDRHD 1227AalleleandRhesushybridbox,respectively,andanueleotidesequencingmethodfocusedontheexon9ofRHD 1227AallelewereemployedtodetenninethezygosityofRHDallele.ResultsAllfiveprobandswithRhDELphenotype harboredaRHD1227AalleleandhadaRHDalleledeletion,andtheywereRHD1227A/RHdheterozygote.Oneofthe parentmemberswasfoundtocontainaRHD1227AalleleandanormalRHDalleleinpedigree1,2and3,respective一 .Thus,theywereRI-ID1227A/RHDheterozygotesandpresentednormalDpositivephenotype.ThesonofprobandNo 1.inheritedtheRHD1227AalleleandpresentedanormalDpositivephenotypeduetoaRHD1227A/RHDheterozy— g0 【e;TheoffspringsofprobandNo.2,No.4,andNo.5didnotinheritRHD1227AalleleandpresentedanormalD positivephenotype.CondusionRHD1227AalleleisanimportantgeneticmarkerofRhDELphenotype;RHD1227A isrecessivetonormalRHDalleleanddominanttoRHdallele;RHD1227Aalleleisanancestra l,butnotaspontaneous— mutatedallele. 【Keywords】DELphenotype;allele;familyinvestigation SupportedbytheGrantsfromtheJinhuaScienceandTechnologyBureau(Proj.No.2O04—1—343)andtheQuzhouScienceand r~,chnologyBureau(Proj.No.2004.1-092) Rh血型主要由RHD基因编码的D抗原和RttCE 基因编码的C,c,E和e抗原组成,其中D抗原是Rh 血型系统中最具有临床意义的抗原,如果RHD基因缺 基金项目:浙江省金华市科技局基金项目(2004.1.343);浙江省衙州 科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(2004.1.092) 作者单位:321000浙江省金华市中心医院输血科(陈安心,徐凤娟, 张丽英,倪映华,叶宏辉,赵英);浙江省衢州市中心血站(吕豪) ? 论着? 失(表示为RHd)或者存在不表达的突变,则表现为D 抗原阴性(用d来表示).临床上一般通过盐水试管法 和间接抗人球蛋白结合的方法来鉴定D抗原,一般称 D抗原阴性的为Rh阴性血型,D抗原阳性的为Rh阳 性血型_l'2J.事实上用吸收放散方法还可以从约20% 的Rh阴性个体中检出一种极弱表达的D抗原,称为 DEL表型(Delutionphenotype)I3-81.因为吸收放散方法 中华医学遗传学杂志2006年1O月第23巷第5期ChinJMedGenet,Octo~r2006,.,_5 步骤比较繁琐,并且DEL抗原意义不明,所以临床上 一 直没有把DEL表型从Rh阴性血型中区分出来.最 近已经有关于DEL表型血液输注给Rh阴性患者,从 而导致抗D免疫事件发生的报道,这提示DEL抗原有 一 定的免疫原性,因此,DEL抗原的免疫原性和遗传规 律研究都应该引起重视_9.在我们的前期工作中已 经发现浙江人群DEL表型由RHD1227A等位基因引 起l3一,我们对5个浙江汉族家系DEL表型先证者作了 DEL表型遗传的研究. l对象与方法 1.1对象在浙江省居住或者工作的无亲缘关系Rh 调性汉族献血员5例(我们以往研究证实为DEL表 型),及其家庭成员. 1.2Rh表型血清学鉴定RhD表型鉴定采用常规盐 水平板法,使用加拿大Dominion公司的IgM和IgG混 合的抗D试剂.RhC,Rhc,RhE和Rhe鉴定采用盐水 试管法,试剂为Dominion公司的相应单克隆抗体. RhDEL表型采用吸收释放(氯仿)的方法鉴定,具体步 骤见文献[12]. 1.3RHD1227A等位基因聚合酶链反应.序列特异性 引物(polymerasechainreation.sequencespecificprimer, PCR.SSP)鉴定采用Wu等l133的方法根据RHD基因 阳RHD1227A等位基因相关序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 1组特异扩增 RHD1227A等位基因的引物:RHDEL-s:GAC. c~AGTITI'CTGGAAA(位置对应于AJ299028的68.85), RHDEL-a:CGAGAGAAn]厂rGAGCAC(位置对应于 ~B035185的849.832).1对特异扩增人生长激素基因 429bp的引物作为内对照,HGH.S:GCCTrCCCAAC. C~TYCCCTYA;HGH.a:TCACGGAqTI'CrGqqGTGqTI".反 f总体积10,含模板DNA0.2L(约含DNA50,60 ,g),特异性引物终浓度250nmol/L,内对照引物终浓 J蔓50nmol/L,MgCl2终浓度1.5mmol/L,dNTP终浓度 200p2nol/L,酶0.2u(TaRa,大连宝生).PCR扩 增条件:95clC预变性5min,然后94clC变性30s,58clC 退火30s和72~C延伸50s,循环30次,最后72~C延伸 5min.产物通过2%琼脂糖电泳,紫外灯观察结果. 1.4RHD1227A等位基因第9外显子序列分析参 照文献[3],根据RHD和RttCE基因内含子序列的差 导设计1组特异扩增包括RHD基因第9外显子及其 删翼序列的PCR.SSP引物.PCR反应总体积50,含 模板DNA1(25,50ng),特异性引物终浓度250 nmol/L,MgCl2终浓度1.5mmol/L(TaKaRa,大连宝生), dNTP终浓度200~mol/L(Pmmega,美国),酶1u TaKaRa,大连宝生).PCR扩增条件:95clC预变性5 rnjn,然后94clC变性30s,67oC退火30s和72clC延伸1 min,循环35次,最后72clC延伸10min.PCR扩增仪为 PE2700(AppliedBiosystems,美国).PCR扩增产物用 QIAquick~PCR纯化试剂盒(QIAGENGmbH,德国)纯化 后,直接用于序列分析反应.序列分析反应采用 "BigDyeTMTerminatorCycleSequencingKit"试剂盒,DNA 聚合酶采用AmpliTaq~DNAPolymerase(AppliedBiosys— terns公司,美国),最后用ABI377测序仪(Applied Biosystems公司,美国)做序列分析. 1.5D杂合性PCR.SSP鉴定采用Perco等lI4J的方 法,用特异性引物u1.s和mb31PCR检测Rhesushybrid box(AJ252313,4988—7710区域).如果可以扩增得到 2778bp的特异性片段,表明存在Rhesus杂交盒有 RHD基因的缺失;反之,则不存在Rhesus杂交盒没有 RHD基因的缺失.Rhesus杂交盒阳性个体的最大可 能单倍型按照cde推算_6j. 2结果 2.1家系1先证者血清学结果为CcDEkee,父亲为 CcDEe,其子为CCDee,丈夫为CCDee;特异检测RHD 1227A等位基因的PCR.SSP结果为先证者阳性,父亲 阳性,儿子阳性,丈夫阴性(图1);第9外显子序列分 析表明RHD基因的1227位点为先证者1227A纯合, 父亲1227G/A杂合,儿子1227G/A杂合;检测Rhesus 杂交盒的结果表明先证者有RHD基因缺失,而父亲, 儿子和丈夫都没有RHD基因缺失.先证者单倍型为 CDe/cde,父亲为CD物Ae/cDE,儿子为CD物Ae/ CDe,丈夫为CDe/CDe(图2a). 2.2家系2先证者血清学结果为CcDEkee,父亲为 CCDee,母亲为CcDEe,其子为CcDee,胞兄为CcDee;特 异检测RHD1227A等位基因的PCR.SSP结果为先证 者阳性,父亲阳性,母亲阴性,子阴性,胞兄阴性(图 1);第9外显子序列分析表明RHD基因的1227位点 为先证者1227A纯合,父亲1227G/A杂合;检测Rhesus 杂交盒的结果表明先证者有R//D基因缺失,而父亲没 有RHD基因缺失,母亲,子和胞兄都有RHD基因缺 失.先证者单倍型为CD眨e/cde,父亲为CD227Ae/ CDe,母亲为CDE/cde,子为CDe/cde,胞兄为CDe/cde (图2b). 2.3家系3先证者血清学结果为CcDEkee,父亲为 CcDee,母亲为CCDee;特异检测RHD1227A等位基因 的PCR.SSP结果为先证者阳性,父亲阴性,母亲阳性 (图1);第9外显子序列分析表明RHD基因的1227位 点为先证者1227A纯合,母亲1227G/A杂合;检测 Rhesus杂交盒的结果表明先证者和父亲有RHD基 中华医学遗传学杂志2006年10月第23卷第5期ChinJMedGenet,Oeto!,.垫,: bp 867 429 图l先证者及其家庭成员的RHD1227A等位基因检测M:分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 912000;1,1F,IS,1H分别代表家系1先证者及其父亲,儿子,丈犬;2,2F, 2M,2s,2B分别代表家系2先证者及其父亲,母亲,儿子,胞兄;3,3F,3M分别代表家系 3先证者及其父亲,母亲;4,4W,4S,4D分别代表家系4先证者 }乏其妻子,儿子,女儿;5,5F,5W,5B,5D分别代表家系5先证者及其父亲,妻子,胞兄, 女儿 Fig.1DetectionofRHD1227AallelebyPCR-SSPmethodamongprobandswithDELphenot ypeandtheirfamilymembersM:molecularweOltmarkerDL2000;1, 1F,IS,andIHrepresentsproband1,herfather,son,andhusband,respectively;2,2F,2M,2S,an d2Brepresentsproband2,herfather,mother,son,andbroth- er,respectively;3,3F.and3Mrepresentsproband3,hisfather,andmother,respectively;4,4W ,4S,4DrepresentsprobandNo4,hiswife,son,anddaughter,re' spectively:5,5F,5W,5B,5DrepresentsprobandNo5,hisfather,wife,brother,anddaughter,r espectively "D 忆de , CDe/ Il I?由nblei.~co"e,cdeCDe/CdeCDe/Cde ?? 图25个DEL先证者携带的RHD1227A等位基因冢系遗传图 Fig.2Fivepeaigr~oftheindividualwithDELphenotype 闻缺失,而母亲没有RHD基因缺失.先证者单倍型为者不同人群中的分子机理不 尽一致.在亚洲人群中, CD忙me/ede,父亲为CDe/ede,母亲为CD27Ae/CDe(图日本有RHDIVS1+1A和 RHD1227A等位基因,韩国人 2c).'群有RHD1227A和RHD1222C等位基因.中国台湾 2.4家系4先证者血清学结果为CCDELee,妻子为人群有第9外显子缺失和 RHD1227A等位基因2种 CCDee,其子为CCDee,其女为CCDee;特异检测RHD 1227A等位基因的PCR.SSP结果为先证者阳性,而妻 子,儿子和女儿为阴性(图1);第9外显子序列分析表 明RHD基因的1227位点为先证者1227A纯合;检测 Rhesus杂交盒的结果表明先证者,儿子和女儿有RHD 基因缺失,而妻子没有RHD基因缺失.先证者单倍型 为CD7Ae/Cde,妻子为CDe/CDe,儿子为CDe/Cde,女 儿为CDe/Cde(图2d). 2.5家系5先证者血清学结果为CeDELee,父亲为 CeDEe,妻子为CCDee,胞兄为CeDELee,其女为CeDee; 特异检测RHD1227A等位基因的PCR.SSP结果为先 证者和胞兄阳性,而父亲,妻子和女儿为阴性(图1); 第9外显子序列分析表明RHD基因的1227位点为先 证者1227A纯合,胞兄1227G/A纯合;检测Rhesus杂 交盒的结果表明先证者父亲,胞兄和女儿为阳性,而妻 子没有RHD基因缺失.先证者单倍型为CDe/ ode,父亲为CDE/ede,妻子为CDe/CDe,胞兄为CD e/ede,女儿为CDe/ede(图2e). 3讨论 RhDEL表型是一种极弱的D抗原,在不同地区或 (最近的研究表明前者还有待于证实)_1.中国深圳 人群和浙江人群则由RHD1227A等位基因引起l. 我们研究了5个DEL表型先证者及其家庭成员的Rh 血型和RHD1227A等位基因,并根据D杂合性结果推 测了单倍型.家系4的亲代样本和家系5的母亲样本 未取得,但是从家系1,3先证者的研究结果分析, DEL先证者携带的RHD1227A等位基因都在一位亲 代家庭成员中检测到,表明先证者的DEL表型是亲代 RHD1227A等位基因遗传所致,并非自身RHD基因的 自发突变引起的. 家系1,3先证者的亲代RHD1227A等位基因携 带者都同时还具有正常的RHD基因,是RHD1227A/ RHD的杂合子,RHD1227A等位基因表达的DEL抗 原和正常D抗原共存,而用目前常规的检测方法暂无 法区分RHD1227A/RHD和RHD/RHD个体细胞膜上 D抗原表达数目的差异,因此DEL抗原的表现被正常 D抗原掩盖,都表现为普通的Rh阳性血型.而家系1 , 3先证者除了RHD1227A等位基因外,另一条染色 体上RHD缺失,是RHD1227A/RHd杂合子.因为 RHd不表达任何D抗原,DEL抗原得以表现.同理, 【{J华医学遗传学杂志2006年l0』j第23卷第5期 ChinJMedGenet,October2006,Vo1.23,No.5 家系l先证者之子除RHD1227A等位基因外还携带 来自父亲的正常RHD基因,因此是RHD1227A/RHD 的杂合子,没有表现为DEL表型.家系2,4,5先证者 的RHD1227A等位基因没有遗传给子代,因此他们子 代的RHD1227A等位基因基因型和表型都为阴性. 综上所述,我们的结果从家系遗传的角度证实 DEL表型由RHD1227A等位基因所致,RHD1227A等 位基因是DEL表型的重要遗传标记;RHD1227A等位 基因为亲代遗传基因,而非个体基因变异.另外,RHD 1227A等位基因相对于正常RHD基因是隐性.而相对 于缺失的R删基因则是显性. 参考文献 1Fle~lWA.HominginonDantigenimmunogenieity.Transfusion,2005, 45:466468. 2Shat)CP,ZhouYY,XiongW.ThefamilyinvestigationofallBHD270A allelecarrier.ChinJMedGena,2003,20:186.188.[邵超鹏,周一炎, 熙文.一个RHD270A等位基因家系研究.中华医学遗传学杂志, 2003,20:186.188.] 3ChenAX,WuJj,XUFJ,eto2.StudyonmolecularbasisofRhDEL phenotypeinZhejiangHanpopulation.ChinJExpHemat,2006,14:501- 504.[陈安心,吴俊杰,徐风娟,等.浙江汉族RhDEL表型的分子机 理研究.中国实验血液学杂志,2006,14:501.504.] 4Wang)(z,LanJC,WuXH,eto2.StudyondetectionofsamplesofRh- weakDandDe1.ChinJExpffemat,2005,13:509.511.[王晓珠,兰炯 采,吴绪华,等.Rh弱D及Del样本的检测研究.中国实验血液学 杂志,2005,13:509511.j 5 6 7 8 9 13 ? 539? ShaoCP,HeCH.Sequenceanalysisof3'-non—codingr~ionofRttD. ChinJExpHemat,2005,13:219.221.[邵超鹏,何春辉.RHD基因3 非编码区序列分析.中国实验血液学杂志,2005,13:219.221.] ShaoCP,MaasJH,SuVQ,eto2.MolecularbackgroundofRHD-post- tire,D-negative,D(e1)andweakDphenotypesinChinese.Voxs0,, 2002,83:156.161. ChenJJ,LinTM,ChenYL,eta1.RHD1227Aisallimportantgenetic lnttrkerforRHDELindividuals.AmJClinPathol,2004,122:193198. ChangJG,WangJC,~angTY,eta/.HumanPHDeliscausedbyadele? tionof1,013bpbetweenintrons8and9includingexon9ofRHDgene. B/o~/,1998,92:2602-2604. WagnerTW,KormoeziGF,BuchtaC,eto2.Anti-Dimmunizationby DELredbloodcells.Transfusion,2005,45:520?526. YasudaH,OhtoH.SakumaS,eto2.Secondaryanti—Dimmunizationby Delredbloodcells.Transfusion,2005,45:1581?1584. KormoeziGF,GassnerC,ShaoCP,eto2.Acomprehensiveanalysisof DELtypes:partialDELindividualsarepmnetoanti-Dalloimmunization. Transfusion,2005,45:1561-1567. BranchDR,HianAL,PetzLD.Anewelutionprocedureusinganon- fammableorganicsolvent.Transfusion,1980,20:635. WuJJ,HongXZ,XuXG,eto2.Theestablishmentofgenotypingmethod forDELphenotypeinZhejiangHanpopulation.ChinJExpHemat,2006, 29:460-462.[吴俊杰,洪小珍,许先国.RHD基因测序方法的建立及 其在弱D表型分子鉴定中的应用.中华检验医学杂志,2OO6,29: 460-462.] PercoP,ShaoCP,MayrWR,eto2.TestingfortheDzygositywiththree differentmethodsrevealedalteredRhesusboxesandanewweakDtype. Transfusion,2003,43:335—339. (收稿13期:2005.1228) (本文编辑张谦) 先天性多指畸形一家系八例 杨帆杨太珠朱琦罗红郭文琪 先证者(?)女,2^5岁,汉族.因孕30"周,要求行彩超 查:查体:孕妇右手拇指外侧可见长约2cm陈旧手术斑痕. 学妇自诉患先天性多指畸形,表现为右手拇指侧多指,已行切 涂术;余无发育异常.行胎儿彩色超声检查显示:胎儿右手拇 指外侧查见长约1.0cm的条状等回声,无骨骼样强回声.超声 拟诊:胎儿右手拇指侧多指畸形.产后经X线检查证实为软组 l性多指. 家系调查该家系4代21人中共8人患病(图1).先证 的祖父(I1),父亲(115),二伯(1I3),姑妈(II.),表哥(?,), &妹(?)及其女JL(?.)均有相同病史,其多指表现均为先天 右手拇指侧多指畸形. 讨论先天性多指是新生儿中常见的肢体畸形.病因不 lj],目前一般认为其主要与遗传因素有关.据文献报道,多个 冈突变,染色体畸变与非综合征型多指的发生有关,临床表 观多种多样,在不同家系和同一家系患者问,受累指(趾)和疾 作肯单位:610041成都,四川大学华西第二医院超声科 lI III ? 病例 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 ? 图1患者家系图 病轻重程度不一. 该家族中连续4代出现多指病例,且男女发病机会均等, 为常染色体显性遗传.患者临床特征表现度小,4代中8例多 指患者均表现为右手桡侧(轴前型)软组织性多指. 超声是一种简便,安全及无创的产前检查方法,对先天性 肢体结构畸形有较高的敏感性和特异性.超声产前检查可用 于胎儿遗传性疾病的筛查和早期诊断. (收稿13期:2006-06.14) (本文编辑张丽玲)