拟南芥突变体lls糖信号响应异常

拟南芥突变体lls糖信号响应异常 上 海交通大学学报 农 业 科 学 版 ( )第 卷 第 期 Vol,28 No 1, 28 1年 月 2010 2 Feb,2010 JOURNAL SHANGHAOF I JIAOTONG UNIVERSITY (AGRICULTURAL SCIENCE)文章编号:() 1671-9964201001-0019-05 拟南芥突变体 lls 糖信号响应异常 姚彬，邵兴华，王婧宇，李小方 (华东师范大学 生命科学学院，上海 ) 200062 摘 要:拟南芥突变体 ()是生活周期很长的单基因突变体。为了研究该突变对糖信号途径的影响，本文通过形 llslong life span 态和生理学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，结果发现 突变体具有一些糖相关的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型特征，如:植株矮小，叶色深绿，生长缓慢等。通过测定植株的可溶 lls 性糖含量及叶绿素和花青素含量，结果显示 植株的叶绿素和可溶性糖水平升高，可能由此引起花青素含量升高。施加外源的 lls 葡萄糖和蔗糖的实验结果表明 突变体对外源糖信号敏感，这说明 突变可能严重影响了糖代谢或糖响应的某一途径。 lls LLS 关键词:糖;突变体;拟南芥lls 中图分类号: 文献标识码: Q945A ArabidopsisMutant, long life span, Displays Altered Sugar Responses YAO Bin, SHAO Xing-hua, WANG Jing-LIyu, X iao-fang (School of Life Science, East China Noarlm University,Sh anghai 200062,Ch ina) ， Abstract: The Arabidopsis mutlongant life span (lls) was named firtso mlo ng life cycle. Previous results suggestedthat lls mutantwas causedby a single genem utation. In this paper, omrphological and physoilogical analysis were performed. The results shthoawedt some surg-arelated phenotypes were exhibiited n lls, such as dwarf phenotype, reduced erm iseednation grate, delayedflo wering. LLS mutation induced the elevation of sugar andh lcorophyll level ,which led to increased anthocyanin content. lls also showedthe sens)i tive to exogenous sugar. Thesell ind icaate that LLS muttioan could seriously affect sugaetarb molism and signal transdutcion pathway. Key words: sugar;lls mutnt;Arabidopsis 在植株的生长发育过程中，糖调节一系列重要由于 片卷曲等一系列特殊表型。 植株矮小、生 lls 的过程，诸如种子萌发，幼苗发育，根叶分化，形态建 长缓慢、叶色深绿等一系列表型可能与内源糖参与 成，开花转换，果实成熟，胚胎发生和衰老，还参与对 调控的发育过程相关，因此本文研究了该突变体中 [1]光、胁迫、病原体及创伤做出的响应过程，可溶性 糖水平和糖敏感性的变化，结果表明，突变改变 LLS [2]糖水平改变可影响植物发育、生理和代谢过程 。同 了植株糖代谢水平及糖信号响应，这为进一步研究 时，由于糖响应与植物激素代谢途径之间有着广泛 [3] 基因的功能提供了重要线索。LLS 的联系，许多发育和生理过程很可能受环境、代谢 [4，5]和激素因子组成的复杂网络影响，因此阐明植物 的糖响应途径是较困难的。 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1 (，意为长生活周期)突变体是 long life spanlls 1. 1 植物材料 我们实验室从拟南芥 插入突变群体中筛选 T-DNA 拟南芥(的 生态型以及得到的，比野生型通常的 个月生活周期还要长 Arabidopssi thalianaL(.)Col 2 2~ (，背景)。植物材料种植在含有蛭石、 lls long life spanCol 个月。并且在长日照和常温条件下，表现出生长极 3 黑土、珍珠岩(比例为 )的混合机质中，或者种植在 其缓慢植株极度矮化，顶端优势丧失，侧枝增多，叶7:2:1, (不含糖)培养基上。植物种子消毒采用 乙醇1/2 MS70% 收稿日期: 2009)07)09 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30771155) 作者简介:姚 彬(1981- )，男，上海人，硕士，研究方向:植物发育与分子生物学E-，mail:nike99579@gmail.co;李小方m(通讯联系人),女, 副教授,E-mail:xfli@bio.ecnu.edu.cn. [7]浸泡 ，随后用无菌水冲洗 次。种子经过 重。实验重复 次，取平均值。 春化 8 min3 4 ?3 后，置于 、1. 4 外源施加葡萄糖和蔗糖的敏感性实验 植物光照条件下培养。3 d 24 h 23 ? 种子消毒后，种在含不同浓度葡萄糖或蔗 1. 2 内源糖测定方法 [6] ，取1. 2. 1 糖(购自 )的 培养基平板上，春化 可溶性糖的测定 采用蒽酮比色法Sigma1/2 MS 4 ?3 后，置于 、光照条件下培养 ，检测植营养生长早期和刚抽苔时期的 个植株的叶 d 24 h23 ?10 d 15~20 株幼苗中叶绿素和花青素含量。以叶绿素和花青素片准确称量鲜重，将叶片在 的烘箱内烘 110 ?15 水平的变化(相对于无糖组)作为衡量植株对外源糖 ，然后调至 过夜;干叶片磨碎后，称取 min70 ?50 敏感性的指标。计算:相对含量(实验组无糖组),/× 样品倒入 刻度离心管内加入 mg l0 mL 4 mL 80, 。每个实验重复 次，取平均值。100,3 酒精，置于 水浴不断搅拌 ，离心收集 80 ?40 min 上清液，其残渣加 酒精重复提 次，合并上清 80%2 液;在上清液中加 活性炭，脱色 10 mg 80 ? 30 结果与分析2 ，定容至 ;过滤后取滤液测定。取一定量 min10 mL 2. 1 突变体的表型特征 的酒精提取液，浓缩至 ，加入 蒽lls 0.05:0.1 mL3 mL 突变体在长日照和常温条件下，植株极度矮 lls 酮试剂蒽酮溶于 稀硫酸 [150 mg 100 mL (76 mL 化，顶端优势丧失，侧枝增多，莲座叶数目增加。与 浓硫酸加 水中，沸水浴 取出冷却， 30 mL )]10 min, 野生型种子萌发率()相比，突变体 74.20%?0.25lls 在 处测定 值。根据标准曲线计算测定 625 nm OD 种子萌发率()降低 以上;抽薹时间50%?0.1720, 样品液的糖浓度，再根据所取酒精提取液的量计 ()与开花时间 ()都较野 38.77?3.75d 43.75?2.54d 算出每毫克植物叶片中的糖含量。实验重复 次， 3 生型略有推迟(表 )。同时，在常温下，突变体1lls 取平均值。 在生殖生长时期仍不断产生新的侧枝而使其寿命 1. 2. 2 蔗糖含量测定 取上述可溶性糖酒精提取 1 -显著增长到 个月左右 (野生型通常为 个月左 5 2 液一定量浓缩至 加入 ， ?0.l mL,50 μL 2 molLNaOH 右)。 煮沸 ，冷却，加入 和 100 ?5 min0.7 mL 30,HCl 0.2 表 突变体的发育特性1 lls 间苯二酚间苯二酚溶于 乙 mL 0.1%(0.1 g 100 mL9 5% Table1 The Development Characteristics of the lls Mtant 醇，棕色瓶内保存，摇匀，水浴内反应 ，冷 )80 ?10 min 却后在 处比色测定，记录 值。根据标准曲480 nm OD Col lls 线计算样品中的蔗糖含量。实验重复次，取平均值。Growth p ara meter s 74 .20%?0.25 5 0.00 %?0.17 ** 1. 3 叶绿素及花青素测定方法 Ra te of ger mina tion/% 1 1.35 ?0.75 13.1?1.3 2** 1. 3. 1 叶绿素测定方法 取营养生长早期和刚 / 抽苔时期的 个植株的叶片约 ，立刻用铝 15~20 2 gNo. o f rosee tte leaves 3 5.70 ?4.67 38.77?3.7 5* —U 箔包裹，在弱光下剪碎叶片并充分混匀。称取剪碎 Bolting time/d 3 9.91 ?3.66 43.7 5?2.54** 混匀的叶片 ，共 份，分别加入石英砂、碳酸0.2 g3 钙和 乙醇研磨，继续加入 乙醇，研 2~3 mL 10 mL 注:差异显著;差异极显著 * (P<0.05)** (P<0.01); Note:* Sig)Flo werin g time/d 磨至组织变白，静置 ，过滤，乙醇冲洗至残 3~5 min; nificant Difference (P<0.05)** Significant Difference (P<0.01) 渣无绿色，棕色容量瓶定容至 。以 乙醇 25 mL95% 2. 2 突变体内源糖含量升高 为空白，在 、波长测 值。计算:lls 665649 nm OD C= a 通过测定营养生长早期和刚抽苔时期莲座叶 ;。 叶绿素 13.95A6.88ACb =24.96A7.32A--665 649649 665 中的可溶性糖和蔗糖含量，表明在这两个时期，总浓度 。叶绿素含量叶绿素浓度提取 lls C=C+C=(×Tab -1 植株中的可溶性总糖和蔗糖水平高于野生型，其液体积稀释倍数样品鲜重?。实验重复 ×)/(mgg)3 中总糖水平在营养生长早期的差异较明显，的lls 次，取平均值。 -1 总糖含量 ，比野生型 ??1. 3. 2 花青素测定方法 取样方法同叶绿素。称29.16 μgmgDW(18.35 μg -1高 ，同时期 中的蔗糖水平比野 取 的叶片放入研钵，加入 提取液 mg DW) 58.9% lls 0.2 g 2 mL [99:1= 甲醇盐酸磨细，转入 容量瓶定容研钵 生型高 。在刚抽苔时期 的蔗糖水平下降， :(V/V)] 10 mL (14,lls 但仍比野生型高 ;同时期 与野生型的 中的材料要转完全，置于 低温下 后取出，35.02,lls )4 ?24 h 总糖水平都下降，但是 仍比野生型高 稀释至合适浓度，用分光光度计测量其相对浓度。lls 41.74%-1 计算:花青素浓度，单位:鲜?,OD)0.25×ODngg 530657 (图 )。2 姚彬，等:拟南芥突变体 糖信号响应异常 第 期 lls 1 21 [8]可溶性总糖是植物光合作用的产物。突变 和 (图 )。叶绿素水平升高暗示植 lls 18.03%77.65%3A [9]体叶色深绿，发育迟缓，与 野生型相比，在生殖 株的光合能力增强，光合产物增多。叶绿素水平 Col lls 升高与植株内源糖水平升高是一致的，提示 中的生长后期突变体的莲座叶仍没有明显的变黄衰老现 lls 光合同化途径正常，突变基因可能在糖运输和糖信象。实验结果显示 植株中的叶绿素水平在营养生 lls 号途径中起作用。 长早期和刚抽苔时期都比野生型高，分别高出 )1-mg 1)-?gμmg(A B t/?gneμ(tt/nnoect rnogac ues sloartoucTS 总糖含量蔗糖含量 营养生长早期叶片 刚抽苔时期的叶片抽苔时期的叶片 营养生长早期叶片 抽苔时期的叶片Leavesin the early growth stage Leavein thes bolting stage Leavesin the bolting stage Leavesin the early growths tage 图 植株中的可溶性糖含量(，可溶性总糖含量;，蔗糖含量) 2AB () Fig.2 The soluble sugarl evesl in plantsA, The content sooflub le sugar;B, The content of sucrose Data are the mea(nns 15) of threeind ependnte experiments?SE ? 植物细胞中内源糖的积累可诱导花青素水平的升而野生型的花青素水平却比营养生长早期有所升高，因[10]高。在营养生长早期 此在刚抽苔时期 和野生型中花青素水平差异的幅度 中花青素的水平高于野生型，为 lls lls 野生型 倍，在刚抽苔时期 缩小，但 的花青素水平仍是野生型的 倍(图 )。中的花青素水平降低，5.61 lls lls 3.55 3B )1- g)1-?g?(mg/n(mg/eA B tetnnooc c nillnaphycyoorohlthnCA 叶绿素含量花青素含量 营养生长早期叶片 营养生长早期叶片 抽苔时期的叶片刚抽苔时期的叶片 营养生长早期叶片 刚抽苔时期的叶片 抽苔时期的叶片营养生长早期叶片Leavesin the bloting stage Leavesin the early growths tage Leavesin the early growth stage Leavein thes bolting stage 植株中的叶绿素及花青素含量图 ，叶绿素含量;，花青素含量 3(AB) Fig.3 Chlorophyll and anthocyaninleve sl in plants (A, Thech lorophyll levesl in plants;B, The anthocyaninleve sl in plants) Data are the mea(nns 15) of threeind ependnte experiments?SE ? 2. 3 照相比，野生型叶绿素含量随着蔗糖浓度的升高而突变体对外源糖敏感 lls 葡萄糖可以诱导光合基因的表达，外源施加 升高，而突变体叶绿素含量在 蔗糖的培养基 0:5% 上变化不明显，超过 低浓度的葡萄糖可以诱导拟南芥幼苗叶绿素的积 ，随着蔗糖浓度的升高植株 6% [11]累;而对光照下生长的植株，外施蔗糖将会导致 萌发生长明显受抑制图 。(4B) [12] 糖对花青素的积累具有加效作用，因此花青植株细胞内糖的积累，低浓度时促进植株叶绿素 [10]素的积累是植株对外源糖的一种响应。测定生长 的合成，高浓度时则抑制叶绿素的合成，因此， 在含不同浓度葡萄糖或蔗糖培养基中的野生型和 测定生长在含不同浓度葡萄糖或蔗糖培养基上的 突变体幼苗的花青素含量，与空白对照(无糖组) 拟南芥幼苗叶绿素含量的变化可以作为考察植株 相比较，结果显示外源葡萄糖和蔗糖均能诱导野 对外源糖信号响应的指标。实验结果显示在含葡 生型和突变体花青素的积累(图 )。在外施不同 5萄糖的培养基上，随着外源葡萄糖的浓度增加， 浓度葡萄糖培养基中培养，野生型花青素含量分别 增加了 、、，而突变体花青素含 23.43%54.77%82.98% 和 叶绿素含量均 增 加 ，分 别 增 加 了Col lls Col 量则增加了 、、;在外施不同 77.04%106.25%164.64% 、、分别增加了 、、15.27% 66.96% 109.16% lls 26.11% 浓度蔗糖培养基中培养，野生型花青素含量分别增加 和 ，与野生型相比，随着葡萄糖浓度 94.74%157.33%了 、、、，而突变体花青素48.23%47.73%80.45%107.98% 增加，幼苗叶绿素含量增加更加明显图 。而 lls (4A) 生长在含 蔗糖的培养基上的植株，与空白对0:7% loA B tno of the c ll空白对照 phyo/%rol content of ch evitaleR葡萄糖 蔗糖 Glucose/%7%Sucrose 图 外源糖对植株叶绿素含量的影响4 Fig. 4 Effect of sugars onhlo rcophyll content. ，葡萄糖对野生型和突变体幼苗叶绿素含量的影响，;野生型和突变体在含 蔗糖培养基上生长 天的幼苗 AB7%7 A, Effect ogfl ucose on chlorophyll content ofo lC andll s seedling; B, Effect of 7%sucrose on the phenotyolpe and ofll sC seedling on the7 th Day; Data are the means (n15) of threeind ependnte experiments?SE ? 含量则增加了 、、和 ， 野生型的影响(图 ，和 )，这再次证 于对 98.79%146.35%206.86% 396.55%Col 5A B 不同浓度的外源糖对 明了 突变引起了植株对外源糖的敏感。突变体花青素积累的影响大lls LLS 花青素相对含量叶绿素相对含量 lloottnnooA B of the cof the c nniinn空白对照 空白对照 aacycy/%/%oohhttnnaa content of content of 花青素相对含量eevviittaalleeRR葡萄糖 蔗糖 Glucose/%7%Sucrose 外源糖对植株花青素含量的影响图 5 Fig. 5 Effect of sugars on anthocyaoninntent c ，葡萄糖对野生型和突变体幼苗花青素含量的影响，;蔗糖对野生型和突变体幼苗花青素含量的影响AB A, Effect ogfl ucose on anthocyanin contento lo af ndCll s seedling; B, Effect of sucrose on anthocyanin conotel ntand oll f sC seedling; Data are the means (n15) of threeind ependnte experiments?SE ? 突变体内源糖含量、叶绿素含量、花青素含量 lls 讨论3 均有显著升高，同时突变体对外源糖响应敏感性增强 的研究结果表明 突变可能影响了植物的糖代谢LLS 所有生物都需要在可利用的碳水化合物水平和 或糖信号途径过程。和此生理实验结果一致的是，实对碳水化合物的需要之间维持平衡，以保持它们的 验室对 突变体进行的基因芯片分析表明突变体中 lls 代谢，并支撑它们的生长和发育。植物像其它有机 一些参与植株体内蔗糖的合成与转运的基因，如 [2]体一样，需要对糖水平作出响应，糖作为植物的信 、()表达的确发 SUS4 (At3g4319)0ATSUC7At1g66570号分子，在整合环境因子、营养和由多种植物激素调 生了变化(未发表数据)，参与植株体内蔗糖的SUS4 [13]节的内在发育程序方面起着关键的作用，糖参与 ，[1415]调控的植物发育过程包括:种子萌发，幼苗发育，形 合成与转运，与植株中蔗糖的转运有关， ATSUC7 [3]态建成，胚胎发生和衰老等。而 突变体的植株矮 lls [16] 抑制植株中蔗糖的运输，会导致细胞内糖积累，同小、生长缓慢、种子萌发率下降等均是与糖信号相关 时，糖信号受损也会导致植株中糖水平升高。研 究 的表型特征(表 )，内源糖信号途径或糖代谢的改 1显示在高糖条件下，发育迟缓的拟南芥幼苗含有高浓 [17]变可能是造成这些表型的原因。 度水平的内源 。 有关 突变体中糖代谢或 ABA lls 糖信号受损的原因实验室正在进一步研究中。 姚彬，等:拟南芥突变体 糖信号响应异常 第 期 lls 1 23 Curr Opin Plant Bio, 2007:24,35 -246. 前人的研究表明叶绿素水平高，除非光合同化 途径受损，一般意味着植株的光合能力增强，光合产 [10] NemethK, SalchertK, Putnoky P,et al. Pleiotropic control [9]物增多，而基因芯片结果也显示在 中参与光合 lls of glucoseand hormone responseby PRL1, a nuclear WD 作用的标志基因 与 的表达水平没有显 CAB RBCS protein, in Arabidopsis [J]. GenesDev, 1998, 12 (19): 著变化(未发表数据)，叶绿素水平升高与植株内 lls 3059-3073. 源糖水平升高是一致的，提示 中的光合同化途径 lls [11] Jang JC, Leon P, Zhou L, Sheen J. Hexokinase as a sugar 没有受损，可能是糖运输和糖信号途径有问题。 sensorin higher plants [J]. Plant Cell, 199: 957,-1 9. 植株中引起花青素水平升高的原因很复杂，细胞 [12] S heen J, ZhouL, Jang JC. Sugars as signaling molecules [J]. [18][19]内糖积累，葡萄糖信号诱导，光受体和光传导途径 Curr Opin Plant Bio, 1999, 2-:4 4118.0 [20-21]受损都会造成花青素的积累，对 突变体而言可 lls [13] Fin kelsteinR , Gibson SIABA. and sugar interactions )reg u能是植株中的糖积累，导致了花青素水平升高。 lating developmencrosst: talk or voicesin a crowd? [J] Curr -总之，通过对 突变体的相关研究及进一步基 lls Opin Plant Bio, 2050(21),: 2632. -因的克隆，可以为研究该基因与植物糖代谢水平及 [14] Michoel B, Paul T, Patrick O. Cluster analysis and display 糖信号途径的关系，以及糖响应与环境和激素因子 of genom-ewide expression patterns.[J] ProcNatl Acad Sci, 之间的相互关系提供重要帮助。 1998, 95:1 4863-14868. 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