脊肌萎缩症(SMA)的产前基因诊断

脊肌萎缩症(SMA)的产前基因诊断 中华医学遗传学杂志 CHINESE JOURNAL OF MEDICAL GENETICS 1999年 第16卷 第6期 VOL.16 NO.6 1999 脊肌萎缩症的产前基因诊断 袁丽芳 刘天慈 马素参 周文敏 杨涛 吴沪生 孙念怙 赵时敏 脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是较常见的常染色体隐,1,性遗传病。在白种人中发生率为1/6000，我国尚无统计，但不少见。,2,根据病情轻重及病程，本病可分3型:?型又称重型，急性型、婴儿型，或Werdnig-Hoffman disease;?型又称中间型;?型又称Kuglberg-Walender disease。由于本病目前尚无治疗方法，再现率高，许多家庭要求产前诊断。为建立产前诊断方法，我们对46个SMA患儿作运动神经原存活基因(survival motor neuron,SMN)基因缺失的检测，对36个SMA家系应用3个与SMA基因紧密连锁的CA重复序列位点JK53CAl/2、5DS637及CATT1进行家系连锁 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。 1 材料与方法 1.1 材料 ,2,1.1.1 检测对象 46例患儿均符合SMA诊断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 :(1)临床表现符合脊髓前角运动神经原病变:肌力、肌张力减弱，腱反射减弱或消失，肌萎缩，纤颤;(2)血清CPK正常或稍高;(3)肌电图:前角运动神经原损害;(4)肌活检符合SMA病变;(5)家族史符合常染色体隐性遗传，有家族史者免活检。?型于6个月内发病，不能独坐，2岁前死亡;?型于1岁内发病，能独坐，但不能行走;?型于3岁后发病，能行走，但肌无力。 1.1.2 DNA来源 46例患儿来自北京市儿童医院及北京协和医院儿科遗传门诊。?型18例，?型28例。10名正常人作为对照。取患儿及其父母(家系核心成员)以及正常人血用盐析法提取DNA，产前诊断取绒毛或羊水细胞DNA用苯酚、氯仿法提取。 1.2 方法 1.2.1 SMA基因缺失的检测 对46例SMA患儿用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)分析作端粒侧(Tel)外显子7的检测。引物序列、SSCP分析方法见文献,3,。 1.2.2 PCR扩增SMA基因旁侧CA重复序列作家系连锁分析 (1)36个SMA家系成员的基因组DNA用3对SMA旁侧CA重复序列位点: JK53CA1/2,5DS637,CATT1进行PCR扩增，这三个位点均位于5q13，其特性、序列及扩增条件见文献,4,。(2)PCR产物分别行6%,8%变性聚丙烯酰胺电泳。电泳条件:1×TBE，电压580V，电流30mA,2,4小时。(3)银染 连锁分析方法见文献,4,。 1.3 7例SMA产前基因诊断 有两对夫妇生过1个SMA ?型患儿，已病故。于孕期9,10周取绒毛、或16周后取羊水提取DNA作PCR-SSCP分析，无先证者样品的家系仅测胎儿是否有SMA基因缺失，其他5个核心家系均作基因缺失检测及家系连锁分析。5例于孕早期9,10周取绒毛，1例取羊水细胞分析，另1例同时作绒毛及羊水细胞分析。 2 结果 2.1 基因缺失检测 40例有SMN基因端粒侧外显子7的纯合性缺失，其中一例的母亲、另一例的父亲也有同样的纯缺失。6例未见基因缺失，缺失率为87%。 2.2 核心家系作连锁分析结果 JK53CA1/2位点的可诊断率为25/36(70%)，5DS637的可诊断率为30/36(84%)，CATT?为15/16(94%)。 2.3 7例产前诊断结果 3例胎儿PCR-SSCP分析结果为父母正常，胎儿有SMN Tel外显子7的纯合性缺失(图1)，其中1例同时以5DS637作家系连锁分析，证明胎儿患病(图2)，终止妊娠。其他4例PCR-SSCP分析未见SMN Tel外显子7基因纯合性缺失，这四个家系都作了家系连锁分析，3例于5DS637位点获得信息，1例根据5DS637及JK53CA1/2两个位点作出判断。连锁分析结果说明胎儿为杂合子或正常纯合子。产前诊断结果判断为正常的胎儿均已出生，年龄分别为2个月、8个月、1岁2个月及1岁5个月，精神运动发育正常。 图1 应用PCR-SSCP检测SMATel外显子7 进行SMA产前诊断(例7) 箭头显示胎儿SMN外显子7缺失.N:正常对照;A:患儿;T:SMN Tel 外显子7标准;F:父亲;M:母亲;P:先证者;Fe:胎儿 图2 PCR及8%变性胶电泳 用5DS637位点作家系7连锁分析，进行SMA产前基因诊断。结果显示:羊水细胞的带型与患儿相同，与母亲不同，说明胎儿患病;F:父亲;M:母亲;P:先证者;Fe:胎儿(羊水细胞DNA) 3 讨论 ,5,,6, 1990年Brzustowicz及Melki等将三型SMA定位于5qll-5q13。此后不少学者在此区域找到许多与SMA基因紧密连锁的多态位点，为家,7,,8,系连锁分析提供了良好条件。1995年Lefebvre及Roy两组实验室分别克隆分离出2个SMA候选基因，各自命名为运动神经原存活基因及神经原凋亡抑制蛋白基因(neuronal-apoptosis inhibitory protein,NAIP)，二者都能满足基因条件，均位于5q13。并各有2个拷贝，一个位于着丝粒侧，另一个位于端粒侧，认为端粒侧具有功能。,7,Lefebvre等对229例SMA患者作PCR-SSCP分析，发现其中98%有SMN Tel外显子7的纯合性缺失。其他学者报道的缺失率为84%,100%。我们应用PCR-SSCP对46例SMA患儿检测SMN Tel外显子7是否缺失，并用与SMA基因紧密连锁的3个CA重复序列位点:JK53CA1/2、5DS637及CATT1，对36个SMA家系进行家系连锁分析，在此基础上作了7例SMA的产前基因诊断。结果说明，应用SMA基因旁侧CA重复序列作家系连锁分析联合SMN外显子7缺失检测，可有效地进行SMA的基因诊断及产前诊断。方法简便，可靠，快速，适用于临床。此外，由于SMA患儿的SMN Tel外显子7纯合性缺失率高达87%以上，因此可用于临床诊断SMA，取代肌活检，且特异性更高。至于1个SMA患儿的母亲也发现有SMN Tel外显子7的纯合缺失，经一些作者分析认为，他们虽有SMN Tel外显子7的缺失，但SMN着丝粒侧(Cen)外显子7的拷贝数增加，SMN Cen外显,9,子7作用虽弱，但拷贝数增加后可以完全代偿SMN Tel外显子7的功能，因而不出现症状。产前诊断必须严格、谨慎，尽可能于孕早期取绒毛，细心挑取绒毛至关重要。如果胎儿的基因型与母亲相同，必须选作另一条染色体上的多态位点进行分析，以排除样品为母体细胞污染的可能。 志谢 本课题承北京市协和医院郭玉璞教授、任海涛同志协助作病理学检查，Dr.Lefebvre惠赠SMNexon7标准，特致谢意 本项目受卫生部科学研究基金(94-1-012)资助 作者单位:袁丽芳 马素参 杨涛 100005北京，中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院医学遗传室 刘天慈 周文敏 吴沪生 首都医科大学附属儿童医院 孙念怙 赵时敏 北京协和医院 参考文献 1 Lewin B.Genes for SMA:Multum in parvo.Cell,1995,80(1)?1-5. 2 Cobben JM,Visser M de,Scheffer H,et al.Confirmation of clinical diagnosis on requests for prenatal prediction of SMA type ?. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1993,56(3)?319-321. 3 杨涛，袁丽芳，刘天慈，等.脊肌萎缩症基因缺失的初步研究.中华 医学遗传学杂志，1998，15(2)?95-97. 4 袁丽芳，刘天慈，杨涛，等.儿童期脊肌萎缩症的基因诊断及产前 基因诊断.中华儿科杂志，1997，35(12)?631-634. 5 Burzustowicz LM,Lehner T,Castilla LH,et al.Genetic mapping of chronic childhood-onset spinal muscular atrophy to chromosome 5q11.2-q13.Nature,1990,344(6266)?540-541. 6 Melki J,Sheth P,Abdelhak S,et al.Mapping of acute (type ?) spinal muscular atrophy to chromosome 5q12-q14.Lancet,1990,336(8710)?171-173. 7 Lefebvre S,Burgten L,Reboullet S,et al.Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.Cell,1995,80(1)?155-165. 8 Roy N,Mahadevan MS,McLean M,et al.The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy.Cell,1995,80(1)?167-168. 9 Campbell L,Potter A,Ignatius J,et al.Genomic variation and gene onversion in spinal muscular atrophy:implication for disease processs and clinical phenotype.Am J Hum Genet,1997,61(4)?40-50. (本文编辑 李秀普) (收稿:1999-02-25 修回:1999-04-15)