富含植物雌激素的草药制剂仙灵骨葆预防卵巢切除引起的老龄大鼠髋部肌肉骨骼组织退化

富含植物雌激素的草药制剂仙灵骨葆预防卵巢切除引起的老龄大鼠髋部肌肉骨骼组织退化 J Bone Miner Metab (2005) 23[Suppl]:55-61 _ Springer-Verlag Tokyo 2005 ORIGINAL ARTICLE Ling Qin • Ge Zhang • Wing-Yin Hung - Yinyu Shi Kwoksui Leung • Hiu-Yan Yeung • Pingchung Leung 富含植物雌激素的草药制剂仙灵骨葆预防卵巢切除引起的老龄大鼠髋部肌肉骨骼组织退化 摘要 本研究探讨了一种富含植物雌激素的草药制剂仙灵骨葆(XLGB)(含金雀异黄酮510μg/g和大豆黄酮2500μg/g)预防11月龄雌性Wistar大鼠卵巢切除(OVX)引起的肌肉骨骼组织退化的作用，大鼠被随机分为假手术组、OVX组、和 XLGB组。大鼠施行OVX术后开始XLGB(250mg/kg/day)每日一次经口给药，连续3个月，利用RT-PCR技术测定外展肌MHC-I IIa IIb的mRNA。分别采用pQCT、micro-CT和压缩实验评价股骨近端骨矿物质密度(BMD)、几何结构、微观结构和机械强度。评价骨转换生化指标血清中的骨钙素(OC)和尿脱氧吡啶啉(DPD)。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:(1)OVX引起骨密度、微观结构以及机械强度相关的指标发生了显著的退化(P < 0.05)，而XLGB治疗的OVX大鼠与假手术组大鼠相比，结果没有差异;(2)与OVX大鼠高骨转换相比，XLGB组与假手术组大鼠的生化指标没有差异(P < 0.05);(3)OVX大鼠的MHC-I IIa IIb的mRNA表达下调，但是经过XLGB治疗后上调(P < 0.05);(4)与OVX组相比，XLGB治疗组大鼠没有发现子宫肥大。总之，本研究的结果表明草药制剂XLGB能够预防OVX术引起的髋部骨骼肌肉组织退化，并且不会引起子宫刺激。 关键词:草药 • 植物雌激素 • 子宫 • 骨质疏松症 • 大鼠 • pQCT • Micro-CT • 机械测试 • 生化指标 L. Qin (N) • G. Zhang • W.-Y. Hung • K.-S. Leung • H.-Y. Yeung P.-C. Leung 中华人民共和国香港特区新界沙田香港中文大学整形和创伤学系肌肉骨骼系统研究实验室 电话+852-2632-3071;传真 +852-2632-4618 电子邮件:lingqin@cuhk.edu.hk Y.-Y. Shi 骨科和创伤科， 上海中医药大学，中国 引言 随着老龄化社会的趋势日益明显，骨质疏松症问题不断突出，它与骨质疏松性骨折密切相关，尤其是脊柱和髋部部位的骨折。因为女性的绝经和较长的预期寿命，骨质疏松性骨折发生率多于男性。激素替代疗法(HRT)是缓解绝经期症状以及预防和治疗骨质疏松症和骨质疏松性骨折的有效方法之一，尽管它同时会导致副作用相关性乳腺癌的发生率升高[3,4]。我们最近的一篇综述中显示，药物治疗下骨密度(BMD)的增加与骨折的风险的降低不平行[5]。这可以用以下事实来解释，即骨质疏松性骨折或脆性骨折(尤其是髋关节发生的骨折)是由于反复跌倒相关的骨骼和非骨骼2个因素引起的，而且骨骼肌也发生了与骨丢失(骨质疏 松症)相平行的年龄相关性萎缩(肌肉衰减征) [6-10]。 在不同种族人群间脆性骨折的发生率可能不同[1,2,10,11]。已有研究表明，与其他工业化国家相比，东方国家中绝经期症状、骨质疏松症、脆骨性骨折和乳腺癌的低发病率可能与食用含大量植物雌激素的食物有关。植物雌激素可分为异黄酮类、木酚素类及香豆雌酚类三类，它们存在于许多可食用的植物或草药中，是与雌激素结构相似并能与雌激素受体结合的一组不同类型的化合物[11-15]。Yin Yang Huo(YYH)(淫羊藿)是其中一种传统用于补「肾」和壮骨的植物或草药，并且几千年来人们认为它在预防和治疗关节疾病、性腺功能障碍、肌肉无力、骨折方面以及缓解绝经相关症状方面具有多重功效[16-25]。因此，近来在中国[16,21-24]和日本[17-20]等亚洲国家已经研发了以YYH为主要成分的用于防治骨质疏松症的草药制剂，并且目前已经上市，被许多亚洲国家的卫生系统认可用于预防绝经相关的疾病[23,26-28]。上市的仙灵骨葆(XLGB)是此类草药制剂中的一种，主要成分为70%的YYH和30%的补骨脂[22,23]。据报道，这种制剂富含植物雌激素，已被作为HRT的替代药物，用于增强绝经后妇女的骨骼和肌肉，同时对生殖组织没有雌激素的不良效应[21-23]。因为传统医学和相关研究在本质上属于一种以疗效为主导的方法[27-29]，因此这种主张尚缺乏科学依据。 本实验研究设计采用了最尖端的生物鉴定技术和方法，探讨了草药制剂XLGB中具有生物学活性的植物雌激素的特征，并研究了已提出的该药对老年卵巢切除大鼠肌肉骨骼组织的保护性作用。 材料与方法 动物、分组和治疗 27只11月龄雌性Wistar大鼠(中国上海SIPPR-BK实验动物中心提供)(体重440.1 ? 16.0g)，每3只一笼饲养在大学动物房中，动物房温度22?C，每天12 h光照、12 h黑暗交替。给予大鼠(SIPPR-BK实验动物中心提供)标准鼠料，自由饮水。大鼠适应环境1个月后，被分为3个体重匹配组，包括1个假手术组(Sham)、双侧卵巢切除术组(OVX)和草药XLGB组(每组n = 9)。OVX手术4天后开始经口给予市售的草药XLGB(中国贵州同济堂制药有限公司)浸液，剂量为250 mg/kg体重/天，连续用药3个月 。本实验研究中使用的剂量是基于已报道的XLGB预防绝经后骨质疏松症的有效剂量按体重转换的剂量[22，23]。采用高效液相(HPLC; Beckman System Gold, Beckman, Fullerton, CA, USA)技术对XLGB的生物活性成分进行定量检测(图1)。实验基线时和终末时测量大鼠体重。采取样本时收集大鼠尿液，是将大鼠放在单独的代谢笼内24 h，不提供食物和水。使用氯胺酮和赛拉嗪(分别100mg/kg和 5mg/kg)对大鼠进行腹腔麻醉后，通过腹主动脉穿刺采集大鼠血液制备血清。继而将尿液和血清标本储存在-20?C下，直到进行生化检验。 图1 草药制剂仙灵骨葆(XLGB)中植物雌激素分子定量的高效液相色谱(HPLC)色谱图，包括金雀异黄酮510µg/g (A)、大豆黄酮2500µg/g (B)、淫羊藿苷9200µg/g (C)、补骨脂素930µg/g和异补骨脂素950µg/g (D) 评价 手术后治疗3个月末给予大鼠过量的戊巴比妥钠处死，进行以下评价。 外周骨定量计算机断层摄影(pQCT) 分离大鼠左侧股骨，被裹入浸透生理盐水的湿纱布，置于-20?C保存备用。设计定制了一个塑料的大鼠股骨固定架用于股骨颈基底部的多层pQCT扫描(Densiscan 2000; Scanco Medical, Bassersdorf, Switzerland)(图2)，该部位是近来报道的压缩试验中骨折发生的部位[30]。测定股骨颈的整体和骨小梁矿物质密度 (BMD) (iBMD, tBMD)。还评价了股骨颈部的几何学，包括骨组织和骨髓腔的横断面积(CSTA和CSCA)以及皮质骨横断面惯性矩(CSMI)。以前报道的大鼠该区域的pQCT精度误差的范围在1.96%-2.25%[31]。 显微计算机辅助断层摄影技术(micro-CT) 采用Micro-CT (sCT-40; Scanco Medical)技术评价一个代表性股骨的微观结构学，该股骨的选择是根据平均pQCT tBMD值，扫描的分辨率为12µm(图3)。采用提供的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 对股骨大转子内的骨小梁体进行定量分析，包括骨小梁骨体积分数(BV/TV)、骨小梁连接性密度(Conn.Dens.)和结构模型指数(SMI)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间距(Tb.Sp)和各向异性度(DA) [32]。 力学试验 大鼠髋部压缩载荷夹具是根据模拟侧向跌倒构型的相似的设计定制的 (Fig. 4)。股骨干和水平线间的角度设定为10?，股骨颈内旋转15?角，这模仿了人试验用尸体的试验状态[33]。仪器为带有2.5 K N 负荷传感器的材料试验机，压缩试验的实施速度设定为2 mm/min (H25KS Hounsfield Test Equipment, Redhill, Surrey, UK)。 图2 大鼠股骨颈基底部外周骨定量断层摄影仪 (pQCT)扫描A 线a，股骨颈基底区域;线b，股骨颈轴B沿与股骨颈轴线相垂直的方向进行扫描，层面厚度为1 mm，分辨率为220 pm(像素大小)。绘出骨膜轮廓和骨内膜的轮廓，用以计算骨髓腔(内环内的区域)和骨皮质(两环之间的区域)的横断面积。 图3 假手术组大鼠(SHAM)、卵巢切除术组大鼠(OVX)和草药制剂XLGB治疗的OVX大鼠(XLGB)骨小梁的代表性micro-CT 3-D微观结构 骨转换生化指标 125采用放射性免疫测定法测定血清骨钙素(OC)，试剂包括I标记的大鼠OC、羊抗鼠OC抗体和驴抗羊二抗(Biochemical Technologies, Stoughton, MA, USA)，测定方法的批内分析和批间分析的精度误差为6.8%和8.9%。用HPLC法测定酸水解后的尿脱氧吡啶啉(DPD)，测定方法的批内分析和批间分析的精度误差为3.6%和8.5%。用改良Jaffés’s方法测定尿肌酐(Cr)水平，尿DPD的排泄用Cr排泄率来表示[34]。 髋部肌肉的mRNA表达 3在左侧外展肌处取大约1.5 mm的肌肉样本置于液氮中，随后保存在-80?C下，继而用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)(Light Cycler; Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)法对重链肌球蛋白(MHC)基因的mRNA表达水平进行定量测定。简而言之，用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从冰冻的肌肉样本中分离出总RNA，并依据标准操作规程进行处理[35]。在260nm处测定样本的吸光度(OD)(1个OD260单位相当于40µg/ml)以确定样本mRNA的浓度，调整终浓度到1 µg/µl。在电泳前，将每个肌肉样本的总RNA进行反转录和扩增[36]。 甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAPDH)的引物作为标准化对照如下:正向引物, 5'-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3'和 反向引物 5'-TCACCTTGCCCACAGCCTTG-3'。通过对比PCR产物与1个DNA分子量标志物( Smart Ladder MW; Eurogentec, Seraing, Belgium)，估计PCR产物的分子大小。 图 4. 为大鼠股骨近端定做的在「侧向跌倒」的构型的压缩试验台。通过一个外包聚乙烯(白色箭头所指)的金属压头提供压缩载荷，这种仪器可以使加压过程中的压力均匀分布在股骨头上。 表1 体重和子宫重量的对比 分组 体重(g) 子宫重量(mg) 基线 随访 差异(%) Sham 440.0 ? 17.3 497.2 ? 19.5 13.0%* 1100.0?43.2 OVX组 439.9 ? 17.3 571.9 ? 22.5** 29.9%* 219.9 ? 8.7** XLGB组 440.5 ? 16.1 563.8 ? 20.6** 28.1%* 222.4 ? 8.1** 数据为均值 ? SD;每组n = 9 Sham，假手术组;OVX，卵巢切除组; XLGB，仙灵骨葆组** P < 0.05, 与假手术组相比 统计分析 用post hoc检验单因素方差分析(AVOVA)评价3组间骨骼和非骨骼指标的差异。结果用均值? SD来表示;统计学差异定为P < 0.05。用SPSS10.0版(SPSS, Chicago, IL, USA)进行所有的统计评价。 结果 草药XLGB中生物活性成分的定量 HPLC分析表明草药制剂XLGB由异黄酮、黄酮和香豆素组成，可以定量的植物雌激素包括金雀异黄酮510 μg/g、大豆黄酮2500 μg/g、淫羊藿苷9200 μg/g, 补骨脂素930 μg/g, 和异补骨脂素950 μg/g。 体重和子宫重量 结果表明， OVX和XLGB治疗组的大鼠体重均明显高于假手术组(15.0%和13.4%)，子宫重量均显著低于假手术组(79.8%和80.0%)(P < 0.05)(表1)。 pQCT测定 XLGB治疗的OVX大鼠的BMD与假手术组相比没有差异，但是iBMD和tBMD结果与OVX大鼠相比明显升高，分别升高了12.9%和33.3% (P < 0.05)。相对于假手术组，OVX组大鼠的CSTA升高很少，但是XLGB治疗后CSTA较假手术组则显著提高(P < 0.05)。OVX大鼠平均CSCA分别明显高于假手术组和XLGB治疗组大鼠(40.8%和38.5%)(P < 0.05)。另外，OVX组大鼠CSMI也分别低于假手术组和XLGB治疗组大鼠(21.9%和24.2%)(P < 0.05)(表2)。 Micro-CT 分析 代表性的样本分析表明，XLGB治疗的OVX大鼠和假手术组大鼠测定的所有结构性参数没有差异。XLGB治疗组大鼠单独与OVX组相比时，BV/TV、Tb.N、Conn.D和Tb.Th值分别高66.7%、14.1%、43.3%和 22.2%，而Tb.Sp 和SMI值分别低7.8% 和26.0%。假手术组和XLGB组间结构指标没有明显差异(表2)。 力学试验 XLGB治疗组大鼠的最大压缩载荷与假手术组相比没有差异，但是明显高出OVX大鼠22.0% )。 (P<0.05)(见表2 生化指标 OVX组大鼠发生明显的高骨转换，血清OC和尿DPD水平高于假手术组大鼠15.0%和36.0%。结果揭示，草药XLGB起着双向作用，一方面抑制OVX诱发的DPD水平升高，抑制率为21.7%(与OVX 相比，P < 0.05)，另一方面保持OVX增加骨形成的作用，使血清OC水平升高13.3%(与假手术组相比，P < 0.05)(见表2)。 肌肉基因表达的RT-PCR 与假手术组对照大鼠相比，OVX组大鼠的mRNA 表达水平明显下调，MHC-I, MHC-IIa, 和MHC-IIb的重链肌球蛋白基因表达分别下降了65.6%、47.4%和33.3%(均为P < 0.05)。与假手术组大鼠相比，草药XLGB治疗组大鼠的重链肌球蛋白基因mRNA 表达甚至出现明显上调，MHC-I, MHC-IIa和 MHC-IIb基因分别升高了16.4%、205.3%和185.7%(均为P < 0.05)(表3)。 表2 骨矿物质、结构、强度和骨转换指标对比 方法 变量 假手术组 OVX组 XLGB组 3pQCT iBMD (g/cm) 1.30?0.13 1.16?0.10* 1.31? 0.13** 3tBMD (g/cm) 1.21?0.27 0.90?0.21* 1.20 ? 0.27** 2CSTA (mm) 14.91?1.37 15.97?1.55 16.71? 1.58* 2) CSCA (mm 4.80?1.43 6.76?1.61* 4.88?1.27** 4CSMI (mm) 22.82?4.19 17.82?2.95* 23.51? 4.31** aMicro-CT BV/TV (%) 0.24 0.12 0.20 2Conn.D (1/mm) 18.43 15.43 22.11 SMI 0.26 1.04 0.77 Tb.Th (mm) 0.12 0.09 0.11 基因表达 假手术组 OVX组 XLGB组 MHC-I mRNA 0.61? 0.02 0.21?0.02* 0.71?0.02*** Tb.Sp (mm) 0.44 0.51 0.47 Tb.N (1/mm) 2.29 1.92 2.19 力学试验 最高载荷 (N) 83.57 ? 11.26 69.56 ? 10.74* 84.89 ? 8.04** 生化 OC (nmol/I) 5.47 ? 0.22 6.29 ? 0.24* 6.20 ? 0.23* 标志物 DPD (pg/ml) 63.20 ? 25.38 85.94 ? 9.31* 67.25 ? 11.09** 数据为均值 ? SD;每组n = 9 a只有一个有平均pQCT BMD值的代表性样本用于microCT评价 pQCT，外周骨定量计算机断层摄影;micro-CT，显微计算机辅助断层摄影; iBMD， 整体骨密度;tBMD，骨小梁密度;CSTA，骨组织横断面积;CSCA，骨髓腔的横断面积;CSMI，横断面的转动冠量矩; BV/TV，骨小梁骨体积密度;Conn.D, 骨小梁连接性密度;SMI，结构模型指数;Tb.Th, 骨小梁厚度;Tb.Sp，骨小梁间距;Tb.N，骨小梁数量;OC，骨钙素;DPD，脱氧吡啶啉 *与假手术组相比，P < 0.05; **与OVX组相比，P < 0.05 表3. 用RT-PCR法对比外展肌MHC-I/IIa /Ib基因的mRNA 表达水平 基因表达 假手术组 OVX组 XLGB组 MHC-IIa mRNA 0.19 ? 0.02 0.10?0.01* 0.58?0.03*,** MHC-IIb mRNA 0.42 ? 0.02 0.28?0.02* 1.20?0.03*** MHC-IIa mRNA 0.19 ? 0.02 0.10?0.01* 0.58?0.03*,** MHC-IIb mRNA 0.42 ? 0.02 0.28?0.02* 1.20?0.03*** 数据为均值 ? SD;每组n = 9 MHC，肌球蛋白重链;RT-PCR，反转录聚合酶链反应 与假手术组相比，P < 0.05;** 与OVX组相比，P < 0.05 讨论 几千年来传统中药在许多东方国家已经广泛用于临床实践。本研究利用一种标准的OVX大鼠模型系统地评价了一种市售的「补肾」草药制剂仙灵骨葆，这种制剂被认为对预防和治疗骨质疏松症临床有效。 采用大鼠髋部作为研究部位，研究了仙灵骨葆对OVX引起的骨骼(股骨颈基底部)和非骨骼(外展肌)部位的退化或变弱的可能治疗效果。pQCT评价表明，根据骨髓腔横断面积(CSCA)、皮质骨横断面积(CSTA)以及横断面转动冠量矩(CSMI)显示的骨分布结果，我们发现草药治疗能够抑制OVX引起的骨内膜部位的骨重吸收，并轻度提高骨膜部位的骨形成。这种现象还见于利用生长激素或甲状旁腺激素治疗的OVX大鼠的研究中[37-39]。此研究中Micro-CT评价结果也表明了XLGB对骨小梁微观结构的保护性效应。因此，OVX大鼠XLGB 治疗后保持了股骨近端的机械强度。本研究中的骨转换生化指标评价解释了XLGB的这种抗骨质疏松症效应，与假手术组大鼠相比，XLGB组大鼠的骨重吸收被抑制，尿DPD降低，骨形成适度升高，血清OC升高。草药XLGB的药理学雌激素效应可能部分归因于其具有生物学活性的植物雌激素，后者包括最有效力的金雀异黄酮和大豆黄酮[13,15,21,40]。 植物雌激素在调节骨骼平衡方面的重要性已经得到了认可，主要认为它们通过基因组机制参与细胞核雌激素受体(ER-β)的活化或抑制，直接作用于造骨细胞，[40-43]。已有植物雌激素直接作用抑制破骨细胞骨重吸收的报道，但据推测是通过非基因组机制，因为哺乳动物破骨细胞缺乏雌激素受体，或在植物雌激素的作用下造骨细胞释放的抑制性细胞因子调节的间接作用[42-44]。一些以前的利用OVX大鼠模型的试验研究的生化、力学、组织形态测定和骨密度测定的评价结果表明，含有4种或更多的草药成份的提取液对雌激素缺乏引起的骨丢失具有类似的保护性效应[18,19,45]。体外生物分析也表明，含有植物雌激素的草药提取液能够抑制破骨细胞的活性，并适度提升成骨细胞活性[17，46]。一种人工合成的植物雌激素(iproflavone)的研究也揭示了相似的细胞机制[47]。但是，因为不同研究中草药配方和植物雌激素的浓度(其他一些研究中未详述)、大鼠年龄、干预持续时间、测定部位以及采用的评价技术不同，所以不能直接对比本研究与其他研究的结果。但是，依照其他一些研究发现药物可能对子宫有刺激效应[19，45]，本研究中也没有出现XLGB引起的子宫肥大。 众所周知，非骨骼因素在预防脆性骨折尤其是跌倒相关性髋部骨折方面有重要的作用[2,8,10,48,49]。本研究是首个通过草药对大鼠外展肌基因表达的干预效应，分析此草药制剂对非骨骼性的有益影响的实验。结果表明草药干预后，OVX引起的重链肌球蛋白基因mRNA的下调又出现了上调，尤其是II型肌肉纤维。其潜在的机制可能也与近来报道的骨骼肌纤维中的雌激素受体ER-β相关[50,51]。据报道，年龄相关性平衡和姿势控制损害是由于IIa型肌肉纤维的少肌症和退化[52]。是否IIa型肌肉纤维中分布着更多的ER-β受体这一问题仍然需要进行更进一步的研究。证实动物实验发现的临床证据也是很理想的，尽管据推测，东方国家中髋部骨折的发生率较西方国家妇女为低与大量食用富含植物雌激素食物相关[11-15]。 以下指出本研究中的试验设计和数据解释方面存在的一些局限性。首先，只有一个有平均pQCT测定值的代表性样本被用于micro-CT评价，尽管我们近来的研究表明，采用相同的pQCT和micro-CT方法，测定的OVX引起的羊骨小梁微观结构的退化与上述结果是一致或平行的[32]。第二，没有测定组织水平的肌肉形态学和功能或者甚至步态，这些都是与机体平衡、姿势和跌倒发生率以及脆性骨折有较好相关性的决定性参数[53-55]。第三，本研究不能阐明草药制剂对OVX引起的骨丢失的保护性效应是否也能部分地归因于与MHC亚型的mRNA更高表达相关的肌肉-骨骼间更好的相互作用[49]，MHC亚型被认为是肌肉收缩过程中负责将化学能量转换为机械力量的分子[56]，本研究也不能阐明是否上述保护性效应可以部分地归因于接受或未接受草药治疗的OVX大鼠的较高的体重。 最后应该强调的是，根据中药实际应用的建议[27,28,57]，除了已确定的70%的淫羊藿和30%的补骨脂的草药组合，本研究中植物雌激素的定量方法还可以作为草药制剂XLGB的质量控制的基础。 总之，本研究首次证明了临床应用的草药制剂XLGB预防OVX引起的髋部肌肉骨骼组织退化的作用，同时不会引起子宫肥大。该结果表明了这种草药制剂在降低骨骼源性和非骨骼源性的脆性骨折方面的作用。 致谢 本研究工作得到了香港特别行政区研究基金会基金的资助， 基金参考号:RGC Earmarked CUHK4097/01M. 参考文献1. 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