食用蛋白质水解度的改良测定方法
摘要:当制备水解蛋白的时候，测定水解度(DH)是至关重要的。已建立的三硝基苯磺酸(TNBS)发被认为是测定酶水解度的常用方法。然为，三硝基苯磺酸法费时费力，不能连续的测定水解反应程度，并且需要使用有危险不安全的化学试剂。本文阐述了一种基于基本氨基酸与邻苯二甲醛(OPA)反应的水解度测定方法。结论是使用OPA法测定蛋白质的水解度更准确，方便，迅速，有更为广泛的使用范围，并且较之TNBS方法更环保。 关键词:水解度，食用蛋白，水解，蛋白质水解，测定
介绍
在蛋白质水解物当中，检测反应的一个关键参数就是水解度(DH)。DH值呗定义为断开的肽键的百分比:
DH=h/h*100% tot
试中htot是每蛋白质当量中肽键总数，h是被水解的肽键数。Htot是取决于原料的氨基酸组成。
在各种文献中，人们已经建立了几种测定蛋白质水解物DH值的方法，例如pH-stat法，渗压法，可溶性氮法以及三硝基苯磺酸(TNBS)法。pH-stat法(Jacobsen等，1957)测定DH值是基于一种基准物(或是由于水解物pH值变化产生的酸)来保持水解过程中的pH值。基准物质的使用量与DH值是成比例的。在实际的蛋白质水解试验中，Ph-stat法的使用仅限于pH略高于7的条件下(Adler-Nissen,1986)。当水解反应的DH值达到约30%时，采用Ph-stat法来测定水解度并不经济可行，在pH>7的单一酶反应系统中使用该方法是不可取的。这将使最适pH值低于7的酶不适用Ph-stat法。另外，在水解反应当中添加基准物可能会导致最终产物的使用不尽如人意。
在水解反应当中，混合物冰点的降低值可以通过渗压计(冰点测定器)来测得。这与DH值是相关的(Adler-Nissen,1984).渗压法是一种可以在多种反应当中使用的快速方法。这种方法的限制之处就在于它不能测定粘度大的溶液及溶质溶解度高的溶液，例如在长期反应当中作为防腐剂的盐。底物中的被夹杂在蛋白酶制剂当中的其他活性物质(如淀粉酵素)水解的非蛋白组分会导致渗压计读数与蛋白质的DH值之间的不相关。
通过测定三氯乙酸(SN-TCA)水溶液中的溶解氮的总量来测定水解度的方法在由Margot等人提出(1994)。他们报道在了胰蛋白酶水解乳清蛋白这一反应当中使用pH-stat法测定水解度的底物消耗量与SN-TCA之间的良好相关性。使用SN-TCA法获得良好试验结果的首要条件似乎是使用内切肽酶。如果反应酶系当中主要是外切肽酶，则会使得试验结果中SN-TCA与通过底物消耗而测定的水解度的相关性降低。这一理论是建立在这样一个事实之上的，即切断相同数量的肽键时，使用外切肽酶所产生的溶解度的增量与使用内切酶时是不同的。作为被切断的肽键的百分比，水解度的测定在参考文献当中没有做出规定。
TNBS法是建立在游离氨基与三硝基苯磺酸(TNBS)试剂的反应的基础上的(Adler-Nissen,1979)。然而该方法也有它的缺点。此法较为费力，不易在水解反应当中快速获得结果以准确反映水解程度。另外，TNBS试剂不稳定，有毒，并且由于有爆炸危险，必须谨慎操作。因此，需要一种无上述缺点的改进方法。
为了给完善中的适当方法提供基础，我们选择了氨基与邻苯二甲醛(OPA)在有β-巯基乙醇存在条件生成可用分光光度计在340nm波长检测的有色化合物之间的反应(图1)。Church等人曾在1983仔细描述过OPA法，他们在每日科学调查当中建议用此法测定牛乳蛋白水解。在我们采用OPA法的实验当中，采用与实验条件更相符的二硫苏糖醇(DTT)代替β-巯基乙醇。
在此方法中的另一个改变之处就是采用丝氨酸作为标准品，因为反应表明，丝氨酸更接近于平均氨基酸。表1当中列出了OPA与氨基酸和短肽反应在340nm处测定的吸光值。该表通过省略与总体平均值相差多于15%的数据来提高准确性。
表1 OPA与氨基酸和短肽反应在340nm出吸光值
OD/mmol/100ml %平均值 甘氨酸 5835* 82
丙氨酸 7156 101
亮氨酸 7310 103
苯丙氨酸 7107 100
丝氨酸 7075 100
半胱氨酸 2311* 33
蛋氨酸 7067 100
色氨酸 6776 96
酪氨酸 7147 101
天冬氨酸 7297 103
天冬酰胺 7808 110
谷氨酸 7646 108
赖氨酸 5814* 82
精氨酸 7451 105
组氨酸 6732 95
N-甘氨酰-甘氨酸 6869 97
N-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸 6099 86
N亮氨酰-蛋氨酸 7240 102
N赖氨酸-苯丙氨酸 7280 103
N-甘氨酰-亮氨酰-酪氨酸 6432 91
平均值 7088
s
*计算平均值时不包括
表中包括了半胱氨酸，甘氨酸和赖氨酸。半胱氨酸已在之前提过，它不予OPA试剂反应(Church等，1983年)。他们也报道了甘氨酸的吸光值相对较低，但我们在试验中发现的更低。报道中，OPA试剂与赖氨酸的游离氨基酸反应的吸光值与有理氨基相同。然而，我们发现除了半胱氨酸之外，赖氨酸的吸光值较之其他的氨基酸均低。
在试验当中，对OPA法与广泛使用的TNBS法的相关性进行了研究，特别是在一大豆蛋白和酪朊酸钠为底物，蛋白质水解度达到65%以上时。
为了从分光光度计上丝氨酸表品和样品的吸光值读数计算DH值，要使用类似于Adler-Nissen在1986年报道的TNBS法中的公式。
要计算出DH值，需要知道h和htot(见上)的值。OPA法当值的计算表达式为:
h=(serine-NH2-β)/αmegv/g蛋白
在此引用了19791年由Adler-Nissen报道的α、β值。
对于大多数的蛋白质而言，氨基酸的平均分子量大约是125g/mol,htot的值
约为8g当量每千克蛋白。下文将引用更为精确的由Adler-Nissen给出在1986年所给出的α、β及htot的值。
使用DH值达到65%的蛋白质水解物，分别用OPA法与TNBS法测定，比较分析两种方法所得结果，以确定OPA法可否用于检测蛋白质水解反应。随着水解程度达到很高的DH值，相关性就倾向于制备调味品。这类产品要求自由氨基酸和短肽含量高，DH值一致。通常，由酸水解制备的植物蛋白(HVP)被用做调味品。由于市场上需求使用较少化学方法制备的食品，酶水解的成为研究热点。
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