复芪止汗颗粒中黄芪甲苷含量的高效液相色谱—蒸发光检测法测定

复芪止汗颗粒中黄芪甲苷含量的高效液相色谱—蒸发光检测法测定 复芪止汗颗粒中黄芪甲苷含量的高效液相 色谱—蒸发光检测法测定 ? 136?齐鲁药事?QiluPharmaceuticalA厥its201IVo1.30.No.3 复芪止汗颗粒中黄芪甲苷含量的高效液相色谱一蒸发光检测法测定 张道广,毛丹,郑荣,王柯,季申 (上海市食品药品检验所,上海201203) 摘要:目的建立复芪止汗颗粒中黄芪专属性化学成分黄芪甲苷含量的高效液相一蒸发光散射检测器测定方法,完 善和提高质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 .方法以黄芪甲苷含量为指标,考察了液相色谱法色谱条件,流动相,线性范围,样品制备方法和中 药质量标准分析方法验证试验.结果以水为溶剂,加热回流后,用水饱和的正丁醇提取,用氨试液洗涤,正丁醇液蒸 千,残渣加甲醇溶解的方法制备供试品,样品的平均回收率为100.0%,RSD为1.5%(n=6),黄芪甲苷在0.4152, 12.456la,g范围内线性关系良好.结论该方法准确可靠,重复性好,适用于复芪止汗颗粒的质量控制. 关键词:复芪止汗颗粒;黄芪甲苷;高效液相色谱一蒸发光检测法 中图分类号:R927.2文献标识码:A文章编号:1672-7738(2011)03"0136-03 DeterminationofastragalosideIVinFuqiZhihanGranulesbyHPLC--ELSD ZHANGDaoguang.MAODan,ZHENG舶ng,WANGKe,JIShen (ShanghaiInstituteforFoodandDrugControl,Shanghai201203,China) Abstract:ObjectiveToestablishahighperformanceliquidchromatography—evaporativelight—scatteringdetector (HPLC—EISD)methodtodetermineastragaloside1V,oneofcharacteristiccompoundsinRad/xAstra galitoenhancequality standardforFuqiZhihanGranules.MethodsWiththecontentofastragaloside?asindex.chromatographicconditions-mobile phase,linearrange,preparationofsampleandanalyticmethodvalidationtextoftraditionalC hinesemedicinewereinvestigated. ResultsThesamplewasdissolvedbywaterandrefluxed-andthenextractedwithn—butanolsaturatedwithwater,washedwith ammoniatestsolution-n—butanolsolutionwasevap6rated.theresiduewasdissolvedinmethanolandthepreparationof textsolu- tionwasfinished.Theaveragerecoverywas100.0%andtheRSDwas1.5%(n=6).Thelinearr angeofastragalosideIVwas 0.4152—12.456g.ConclusionThemethodWasapplicabletoqualitycontrolofFuqiZhihanGranules withgoodaccuracy,re- liabilityandreproducibility. Keywords:FuqiZhihanGranules;Astragaloside1V;HPLC—ELSD "复芪止汗颗粒"收载于卫生部药品标准中药成方制剂 第十册,为上海雷允上药业有限公司独家品种具有益气,固 表,敛汗的功效,用于多汗症,对气虚型者尤佳.黄芪甲苷 为黄芪中十多种皂苷的主要成分,具有抗炎,降压,镇痛,镇 静作用,能够增加血浆中CAMP和再生肝DNA的含量,能增 加小鼠胸腺重量,即对免疫器官有影响J.原标准中没有收 载处方中药味的含量测定,也未见相关文献报道.为了进一 步提高复芪止汗颗粒的质量标准,更加准确科学地控制药品 的质量,本文对复芪止汗颗粒中黄芪甲苷含量的高效液相一 蒸发光散射检测器测定方法进行了系统的研究,建立了黄芪 甲苷的含量测定方法. 1仪器与材料 1.1仪器Agilent1100Series高效液相色谱仪(美国安捷 伦科技公司):含在线真空脱气机(G1322A),四元泵 (G1313A),进样器(G1313A),柱温箱(G1316A),蒸发光散 射检测器(PolymerLaboratoriesPL—ELS2100)和Agilent 1100Series色谱工作站;HWS28型电热恒温水浴锅(上海一 恒科技有限公司);细胞型超纯水机(上海摩勒生物科技有限 公司);电子分析天平(德国赛多利斯). 1.2药材与试剂5批复芪止汗颗粒(批号分别为080301, 080302,080303,080304和080305)由上海雷允上药业有限公 司提供,黄芪甲昔对照品(中国药品生物制品检定所提供,批 号110781—200311,供含量测定用);甲醇为色谱纯(MERCK 公司),水为超纯水,其余所用试剂均为分析纯(中国医药 (集团)上海化学试剂公司). 2方法与结果 2.1色谱条件与系统适用性试验色谱柱为DikmaIne~sil Cl8(5m,4.6mmx15mm);柱温为30?;流动相为乙腈一 水(25:75);流速为1.0mL?rain,,蒸发光散射检测器.理 论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000. 2.2黄芪甲苷提取方法的考察参照《中国药典}2005年 版一部"乙肝宁颗粒"项下含量测定条项下的提取方法J, 齐鲁药事?QiluPharmaceuticalAffairs2011Vo1.30,No.3 进行预实验,结果显示本品黄芪甲苷含量较低,为增大供试 品溶液的响应值,加大了取样量,水浴上加热使黄芪甲苷充 分溶解.为有效地提取出所测定成分,对提取溶剂提取的次 数进行了考察,取本品50g,研细,精密称定,精密加入水100 mL,称定重量,至水浴上加热1h,冷却,用水补足减失的重 量,摇匀,离心,精密量取上清液50mL,分别用水饱和的正丁 醇振摇提取3次,5次和6次,每次50mL,合并正丁醇液,用 氨试液洗涤2次,每次50mL,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇 适量使溶解,定量转移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀, 滤过,取续滤液,即得.分别注入液相色谱仪,测定,比较不 同提取次数的含量.结果表明用水饱和的正丁醇振摇提取5 次,黄芪甲苷基本提取完全,故采用水饱和的正丁醇振摇提 取5次. 2.3黄芪甲苷的含量测定 2.3.1对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适 量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得. 2.3.2供试品溶液的制备取本品50g,研细,精密称定, 精密加入水100mL,称定重量,置水浴上加热回流1h,取出, 放冷,用水补足减失的重量,摇匀,离心,精密量取上清液5O mL,用水饱和的正丁醇振摇提取5次,每次50mL,合并正丁 醇液,用氨试液洗涤2次,每次50mL,弃去氨试液,正丁醇液 蒸干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至5mL量瓶中,加甲醇 稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得. ? 137? 2.3.3方法学考察线性关系的考察:精密称取经五氧化 二磷真空干燥过夜的黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含0.4mg的溶液,作为对照品溶液.精密吸取对照品溶 液1,2,5,l0,20,30,注入液相色谱仪,记录峰面积.以进 样量(g)的自然对数为横坐标,峰面积自然对数为纵坐标, 绘制标准曲线,进行回归分析,线性方程为Y=1.359X+6. 7659,r=0.9996,黄芪甲苷在0.4152—12.456la,g范围内 线性关系均良好. 精密度试验:精密吸取黄芪甲苷对照品溶液(0.4mg? mL)1OL,连续进样6次,记录峰面积,结果黄芪甲苷平均 峰面积为6285.2938,RSD为0.87%(n=6). 重复性试验:取同一份样品,一式6份,按供试品溶液制 备方法制备,进样量为20,依法测定,黄芪甲苷的平均含 量为0.043mg?g,,RSD为1.2%(n=6).结果表明本方 法重复性较好. 稳定性实验:取同一份供试品溶液,在相同的色谱条件 下分别在O,1,2,3,6,9,12,18,24h进样分析,在24h内黄芪 甲苷的平均峰面积为7350.27501,RSD为1.3%(n=6), 结果表明,在0,24h内供试品溶液基本稳定. 加样回收率实验:取同一批本品一式6份,称取25g,精 密称定,分别精密加入浓度为0.332mg?mL的黄芪甲苷 对照品溶液3mL,按上述供试品溶液的制备方法操作,进样 2O,依法测定,计算回收率,结果见表1. 表1黄芪甲苷加样回收率测定结果 结果表明,平均回收率为100.O%,RSD为1.5%(/1,=A…U1lIll 6),该方法的准确度符合要求.1600{IIlI 样品中黄芪甲苷的含量测定:分别称取5批复芪止汗颗1I1fI 粒50g,按供试品溶液制备方法操作,精密吸取供试品溶液-ooo{lIfI 20进样,记录色谱图,以外标两点法对数方程计算各样品:】flIfl 中黄芪甲苷的含量,结果见表2.空白样品同法操作,未出现oo{J\I10 与黄芪甲苷色谱保留时间相同的色谱峰.对照品,样品和空0:圭==.::===三===;==; 一. 白样品(缺黄芪)的色谱图见图1,图2,图3..''""" 02,5S7S1012SI517,520225n 图1黄芪甲苷对照品高效液相色谱图 图2供试品溶液高效液相色谱图 图3空白样品(缺黄芪)溶液高效液相色谱图 ? 138? 表2样品中的黄芪甲苷含量 3讨论 本文参照了文献报道的有关黄芪甲苷的含量测定方法, 根据黄芪甲苷的溶解性和实际试验结果,改为水浴上回流提 取,增加了提取次数,从而使得样品中含有的黄芪甲苷提取 完全. 以黄芪甲苷的含量作为指标,分别考察了加热回流0.5, 1,2h,对黄芪甲苷含量测定结果的影响,试验结果表明加热 回流1h时黄芪甲苷提取基本完全. 参照"乙肝宁颗粒"项下含量测定条件,以乙腈和水为流 动相,分别考察了不同比例的流动相?乙腈一水(38:62),流 动相?乙腈一水(25:75)和流动相?乙腈一水(34:66),结果 表明,流动相??的对称因子均符合要求,但?的保留时间 适中,故选择流动相?作为本方法的流动相. 由于不同生产厂家不同牌号的色谱柱存在填料及性能 上的差异,为考察拟订方法的可行性及通用性,分别考察了 色谱柱(~)DikmaInertsilCl8,5Ixm,4.6mm×15mm,色谱柱? DikmaKromasilC18,5Ixm,4.6mmx25mm和色谱柱(~)Sepax 齐鲁药事?QiluPharmaceuticalAffairs2011Vo1.30.No.3 AmethystCl8,5I.tm,4.6lnln×20mm,结果表明,供试品色谱 均可获得满意的分离,峰形均较好,理论板数分别为16022, 7002,11361,表明拟订方法通用性较广. 黄芪甲苷在0.4152,12.456P,g范围内进样量的自然 对数和峰面积自然对数线性关系均良好.线性方程为Y= 1.359X+6.7659,r=0.9996,平均回收率为100.0%,RSD 为1.5%. 本文建立了采用高效液相色谱一蒸发光散射检测法测 定复芪止汗颗粒中黄芪甲苷含量的方法,该法准确可靠,重 现性好,可用于复芪止汗颗粒的质量控制.本方法已经被 《中国药典)2010年版收录. 参考文献: [1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国 卫生部药品标准中药成方制剂[s].第十册.北京:人 民卫生出版社,1995:120. [2]刘元元,戴稼禾,陈亮钜.黄芪苷?对损伤的人血白细 胞变形能力的影响[J].上海:上海医科大学, 1998,25(5):361. [3]国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版(一 部)[S].北京:化学工业出版社,2005:290. (上接第135页)件进样分析,按外标法计算得各有机溶剂 的平均回收率分别为91.09%,95.o7%,104.44%,93.38%, 95.35%,96.79%,93.18%和92.43%. 另精密称取已知各溶剂残留量的样品9份各0.2g,置5 mL量瓶中,分别精密加入三氯甲烷对照品溶液(5.272wg? mL)2mL,2.5mL,3.0mL,各3份,再加二甲基亚砜定容 至刻度,摇匀,精密吸取1.0,按色谱条件进样分析,按外 标法计算得三氯甲烷的平均回收率为97.99%. 2.4样品测定取对照品溶液与样品溶液分别进样测定, 按外标法计算3批样品中有机溶剂残留量.结果见表2. 表2样品测定结果 2.5讨论 2.5.1顶空进样与溶液法直接进样相比具有色谱柱污染少 和灵敏度高的优点,故试验选择顶空进样的方式.顶空进样 的平衡温度在摸索试验中,分别比较了6o,80,100,110?作 为顶空瓶加热温度,平衡30min后测定,结果显示,随着温 度的升高,各溶剂的峰面积逐渐增大,灵敏度随之提高,其中 N,N一二甲基甲酰胺的峰面积响应是所有溶剂中最小的,温 度的提高对其灵敏度的提高有很大的意义,但是到了110oC 以后,没有明显的变化,而且平衡温度过高易引起顶空瓶的 耐压和气密性等温度,最后试验选择100?作为平衡温度. 2.5.2在摸索试验中9种溶剂残留均采用顶空气相色谱 法分离,FID检测器检测,9个峰的分离尚可,但是三氯甲烷 的峰响应太低,检测限几乎只能做到《中国药典)2010年版 (二部)附录?P"残留溶剂测定法"中规定的三氯甲烷限度 浓度,故将三氯甲烷单独建立一个色谱系统,改用专属性强 的ECD检测器检测,结果灵敏度大大提高,准确可靠. 参考文献: [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典201O年版(二 部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010.