精液DNA提取
1.4.1 提取牛冻精基因冻DNA所需冻冻的配制
1.0.5mol/L EDTA,在800ml水中加入186.1g二水乙二四乙酸二冻;胺EDTA-
Na?2H2O,～在磁力冻拌器上冻烈冻拌～用NaOH冻冻溶液的pH冻至8.0～然后定
容至1000ml～分高冻冻菌冻用。装
2.1mol/L Tris?Cl,在800ml水中溶解121.1g Tris碱～加入冻酸冻pH冻至8.0～使
溶液冷至室后～方可最后冻定温pH冻～加水定容至1L～分后高冻冻菌。装
3.10%SDS;十二冻基酸冻,,在磺900ml水中溶解100g的SDS～加冻至68?用
磁力冻拌器冻拌助溶～用HCl冻冻pH至7.2～定容至1L。室～无需冻菌。温
4.20%SDS;十二冻基酸冻,,在磺900ml水中溶解200g的SDS～加冻至68?用
磁力冻拌器冻拌助溶～用HCl冻冻pH至7.2～定容至1L。室～无需冻菌。温
5.生理冻水,取称9克冻化冻～溶解在少量蒸冻水中～稀冻到1000ml。6.2mol/LNaCl,116.88 g NaCl溶于蒸水中～加水定容至双1L～高冻冻菌。7.蛋白冻K(20 mg/ mL),200 mg蛋白冻K溶于10 mL水中～以1 mL分～,装
20 ?冻藏。
8.TE冻液,冲20 mmol/L Tris-HCl;pH8.0,～1 mmol/L EDTA;pH 8.0,;配
方冻2 mL 1 mol/L Tris-HCl,～ 加0.2 mL 0.5 mol/L EDTA～加水定容至100
mL～高冻冻菌。
2.1.1 公牛冻精DNA的提取
方法
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用高冻法牛冻精中提取基因冻从DNA～步冻如下,
取2mL离心管～放入一支冻精～加入500mL生理冻水～冻旋混～匀12000rpm离心
1min。倒去上液～保留淀;透明的冻精心清沉离12000rpm～2min,。
重冻步冻1一次
向淀中加入沉400μl加入DDT的牛冻精裂解液～向管中加入100μl 20%的SDS～盖上心盖子～放置一～然后冻旋～是淀完全溶于裂解液。再加入离会沉10μl 的
蛋白冻K,冻倒混。匀
将匀混的冻品放入56冻氏度的保箱～消化温4个小冻以上～最好消化冻夜。取消化好的冻品～向心管中加入离300μl 冻和食冻水。冻倒2-3min～放入箱置冰静一。会儿12000rpm心离5-10min。心后的上移到新的心管中～将离清离扔
掉淀。沉
向心管中加入离1000μl冰冻的无水乙醇。冻倒1-2min～然后12000rpm离心2min。倒去上液～保留清DNA沉沉将沉淀。如果所得到的淀冻大～冻需要淀冻入
新的心管～再冻行以下步冻。离
向心管中加入离500μl 75%的乙醇～混;不要冻倒,～然后匀12000rpm离心
2min。倒去上～保留清DNA沉淀。
重冻步冻7一次。
向心管中加入离300μl 56冻氏度的TE;如果淀冻小～冻用沉200TE溶解淀,沉～
56冻氏度冻盖放置十分冻。冻淀溶解。沉
用1%的冻脂糖冻泳冻冻～点冻冻buffer 3μl,冻品2μl。130V冻泳10min。
将冻冻合格的冻品放入-20冻氏度的保存。冰柜
浙公网安备 33021202002483