青霉素类药物族特异性抗体及IAC柱的制备

青霉素类药物族特异性抗体及IAC柱的制备 安徽农业大学 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 青霉素类药物族特异性抗体及IAC柱的制备 姓名:陈号 申请 关于撤销行政处分的申请关于工程延期监理费的申请报告关于减免管理费的申请关于减租申请书的范文关于解除警告处分的申请 学位级别:硕士 专业:基础兽医学 指导教师:祁克宗 20080601 中文摘要 青霉素类药物是一类高效广谱抗生素，在兽医临床上广泛应用于治疗细菌感染引起的畜禽肠道、呼吸道等疾病。由于能引起人的过敏反应和容易诱导细菌产生耐药性等原因，致使许多国家对动物用青霉素类抗生素和在食品中的残留进行了严格监控。又因青霉素类抗生素使用范围广、使用量大，其在动物性食品中的残留令人关注。因此，建立高效、灵敏的青霉素类药物残留检测方法在动物源性食品安全方面具有非常重要的意义。 本研究以青霉素类药物母核,一氨基青霉烷酸(,一,,,)偶联牛血清蛋白(,,,)和卵清白蛋白(,,,)分别合成两种免疫抗原和包被抗原;制备的高效价的抗,一氨基青霉烷酸 (,一,,,)的抗血清经活性检测后被纯化;纯化的，,,偶联,,,,活化的,,,,,,,,, ,,制备免疫亲和层析柱(，,,)，初步测定了免疫亲和层析柱对青霉素,的柱容量及添加回收率。结果如下:,(青霉素类药物族特异性人工抗原的合成及鉴定 采用戊二醛法，将,(氨基青霉烷酸(,(,,,)分别与牛血清蛋白(,,,)和卵清白蛋白(,,,)偶联，分别制备免疫抗原,,,,,,,,,和包被抗原,,,,,(,,,。合成的人工抗原经紫外扫描和红外扫描鉴定 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,,,,,与蛋白载体偶联成功，且经紫外光谱扫描法计算出,,,,,(,,,、,,,,,(,,,的半抗原结合比分别为,,(,,、,(,,。,(青霉素类药物族特异性抗体的制备 用,,,,,(,,,常规免疫实验兔制备抗血清。 建立检测青霉素药物族特异性抗血清效价的间接,,，,,法，其中包被抗原,,,,,(,,,工作浓度为,,‖,,，阴性血清的工作浓度为,,,,倍稀释，酶标二抗的最佳稀释倍数为,,,,,倍稀释。利用建立的间接,,，,,法检测抗体效价，制备的三个抗血清的效价分别为,(,,×,,,、,(,,,,,、,(,×,,,。 采用间接竞争,,，,,法检测抗体的特异性。青霉素,、氨苄西林、邻氯西林、苯唑青霉素、阿莫西林的交叉反应率在,,(,,,,,,之间，磺胺嘧啶钠、恩诺沙星、氯霉素、土霉素、林可霉素等非青霉素类抗菌药物的交叉反应率皆小于,(,,,。说明抗血清族特异性良好;批内变异系数都在,(,,以内，批间变异系数都在,,,以内。,(青霉素类药物族特异性，,,柱的制备及初步评价 将制备的青霉素类药物族特异性抗血清通过硫酸铵粗提和,,,,—,,,,,,,, , ,,凝胶层析柱进一步纯化，,,，经,,,,,,,(,,,电泳鉴定为目标蛋白。 将所纯化蛋白与,,,,活化的,,,,,,,,, ,,琼脂糖偶联，偶联率为,,(,,,，装柱制备青霉素类药物族特异性，,,柱。 采用,,,,检测方法对，,,柱柱效进行初步评价。建立青霉素,的,,,,检测标准曲线，青霉素,标准品浓度峰面积在,”,’,,,腿,,,范围内线性良好，标准曲线回归方程为,,,,,(,,,(,(,,,,，,,,,(,,,,。峰面积日内、日间平均变异系数均低于,,;回收率在,,(,,,,,(,,之间。，,,柱对青霉素,的动态柱容量为,,,,(, ,, ,,,,(,,,，绝对柱容量为,,(,,,,,,, ，,,。在一星期内重复使用,次，青霉素,的动态柱容量仍能达到,,, ,, ,,,, ,,,，并且不影响使用。青霉素,样品添加回收率为,,(,,,”,,’,,(,,,，变异系数,(,,,”,,’,,(,,,。淋洗液选用甲醇一乙腈一醋酸,醋酸钠缓冲液(,,:,,:,,)为淋洗液。方法在准确度和精密 度上均达到了残留分析的要求。关键词:青霉素类抗生素，,(氨基青霉烷酸，酶联免疫吸附，免疫亲和层析柱 ? ,,,,,,;, ,,,,;,,,,,,，,,, ,,【,, ,,,,;,,,, ,,,,,,,,,;,，,,, ,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,;,,, ,,, ,,,,,,,,;,,,,,, ,,,,;,,,,, 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,,,,;,,,,, ,,,,,,,, 多克隆抗体,,，,, ,,,,,,—,,,,,, ，,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, 酶联免疫吸附试验,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, 牛血清白蛋白,溺 ,,,,,,,(,,, ,,,,,) 卵清白蛋白,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 辣根过氧化物酶,,, ,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, 十二烷基磺酸钠,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,,,,, 聚丙烯酰胺凝胶电泳,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,;,, 聚乙二醇，,, ，,,,,,,,,,,,,, 免疫球蛋白, ,,,,,,,,,,, ,,,;,,,,,, 紫外光谱,, ,,,,;,, ,,,,,,, 光密度,, ?,,—,,,,,, 千道尔顿,,(,) ,,,,,,,,, ,,,,,,(,,,,,,) 磷酸(盐)缓冲液,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, 含,(,,吐温的磷酸盐缓冲液,, ,，,’，,，,’,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,，,’，,，,’一四甲基联苯胺,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, 邻苯二氨胺’, , ,,(,,,,,,,,,,,,,),,,,,,,,,,,, 三羟甲基氨基甲烷,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,, 每分钟转数,(, ,,,,,;,,,, ,,,,,,,,,,, 变异系数 ,，， 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名: 降等 时间:如扩年乡月,,日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名: 陪学 时间:加啦年石月’,日 第一导师签名 时间: 年 月 日 文献综述,(青霉素类药物简介及其残留危害,(,青霉素类药物的分类 青霉素类药物结构中含有,(内酰胺环(结构如图,)，故属,(内酰胺类抗生素。其作 用主要通过抑制细菌细胞壁的合成而发挥杀菌作用。,,,,年由,,,,,,,发现的青霉素 (,,,,;,,,,,,)，于,,世纪,,年代初临床，人们对青霉素进行大量研究后对青霉素进行 化学改造，得到了一些有效的半合成青霉素，,,年代又从微生物代谢物中发现了一些母 核与青霉素相似也含有,(内酰胺环，而不具有四氢噻唑环结构的青霉素类药物。 青霉素类药物可分为三代:第一代青霉素指天然青霉素，如青霉素,(苄青霉素): 第二代青霉素是指以青霉素母核(,(氨基青霉烷酸(,(,,,)，改变侧链而得到半合成青霉 素，如氨苄青霉素、羧苄青霉素;第三代青霉素是母核结构带有与青霉素相同的,(内酰 胺环，但不具有四氢噻唑环，如硫霉素、奴卡霉素等。 ,—,,,, , , 图,: 青霉素类药物母核的结构图 ,,,(, ,,, ,,,,;,,,, ,, ,,,,,(,青霉素类药物的抗菌机理及兽医临床上的应用概况 研究认为，青霉素类药物的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。细菌的细胞壁是一层坚韧的厚膜，用以抵抗外界的压力，维持细胞的形状。细胞壁的里面是细胞膜，膜内裹着细胞质。细菌的细胞壁主要由多糖组成，也含有蛋白质和脂质。革兰氏阳性菌细胞壁的组成是肽聚糖(其占细胞壁干重的,,,,,,,，革兰氏阴性菌为,,”,,,,)、磷壁酸质、脂蛋白、多糖和蛋白质。其中肽聚糖是一种含有乙酰基葡萄糖胺和短肽单元的网状生物大分子，在它的生物合成中需要一种关键的酶即转肽酶，青霉素作用的部位就是这个转肽酶。现已证明，青霉素内酰胺环上的高反应性肽键受到转肽酶活性部位上丝氨酸残基羟基的亲核进攻形成了共价键，生成青霉噻唑酰基一酶复合物，从而不可逆的抑制了该酶的催化活性。通过抑制转肽酶，青霉素使细胞壁的合成受到抑制，细菌的抗渗透压能力降低，引起菌体变形，破裂而死亡。 在畜牧生产中因其广谱、高效而广泛应用?，青霉素类药物对敏感菌所致的肺部、尿道感染和某些革兰氏阴性杆菌引起的一些感染亦有效，主要用于控制奶牛乳房炎、畜禽细菌感染引起的肠道、呼吸道等疾病。给药途径多采用肌肉注射、皮下注射和口服等方式。青霉素类药物半衰期短，在动物体内很快消除，血药维持时间短，每隔,”,,需给药一次。主要由尿和胆汁排泄，给药,,,大部分药物从尿中排出。 (几种常见的青霉素类药物 的结构，如下图,所示) 使用较广泛的几种青霉素类药物 药物名称 侧链结构(,,) 苄青霉素(,,,,,～,,,,;,,,,,) ;,,,(,,,( 青霉素,(,,,,;,,,,, ,) ,,,,(,(,,,( 苯唑青霉素(,,,;,,,,,) ,,,,(,,,,,,( 邻氯青霉素(,,,;,,,,,,,) ,,,,,,(,,,,,,, 双氯青霉素(,,;,,,,;,,,,,) ,,,,,,,(,,,,,,, 氨苄青霉素(,,,,;,,,,,) ,,,,(,,(,,,)( 羟氨苄青霉素(,,,,,;,,,,,),,,,,,,,—,,(,,,)一 环烯氨苄青霉素(,,,;,,,,,) ,,,,(,,(,,,)( 甲烯氨苄青霉素(,,,,,,,;,,,,,) ,,,,(,,,(,,,)一 哌拉青霉素(,,,,,,;,,,,,) ,,,,(,,,,,,,,一 苯咪青霉素(,,,,;,,,,,) ,,,,(,,,, ,,,,( 羧苄青霉素(,,,,,,;,,,,,) ,,，,,,(,,(,,,,)( 磺苄青霉素(,,,,,,;,,,,,) ,,,,(,,(,,,，,，)( ’ 图,(青霉素类药物的侧链结构 ,,, ,(,,, ,,，,;,,,,, ,, ,,,, ,(,青霉素类药物的残留危害及其残留限量标准 青霉素的问世无疑是,,世纪医学发展中的里程碑，但是随着青霉素的大规模使用，越来越多的细菌对它产生了耐药性。畜禽养殖过程中大量的用于预防治疗用药，再加上管理混乱、使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，造成其在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害，主要有:(,)使人体产生耐药菌株，增强细菌耐药性，给患者使用抗生素治疗带来不良影响: (,)过敏反应:对抗生素过敏的过敏体质的人会引起过敏反应，引起免疫性贫血心,、皮疹等，严重者危及生命;(,)破坏胃肠道菌群平衡，使菌群失调，甚至造成“二重感染”。,,,,,;,等认为在动物体内的残留的药物预先形成的致敏原是引起人类过敏的祸首，并且长期食用含有青霉素残留的动物性食品会引起细菌耐药性，造成人体微生物环境平衡紊乱和失调。据,,,统计，该类药物引起的变态反应发生率为,(,,,,,，过敏性休克发生率为,(,,,，,,,,(,,,。 世界粮农组织(,,,)、世界卫生组织(,,,)的食品法对食品中抗生素最高残留限量都有明确的规定，欧盟(,,)和美国食品与药品管理局(,,,)等也有具体严格的规定，明文禁止 ,抗生素残留超出最高残留限量(,,,)的牛奶上市，日本,,,,年,月开始实施的“肯定列表”制度明确将氨苄青霉素等列为进口食品必检项目。 许多国家包括我国对动物使用这类药物和残留实行严格的监控管理。如美国规定牛奶中青霉素,、阿莫西林、氨苄青霉素和邻氯青霉素的,,,分别为, ,,,,,、,,,,,,,、,, ,,,,,和,, ,,,,,，监控非常严格。欧盟规定青霉素,、阿莫西林、氨苄青霉素在牛奶中的,,,为,,,,,,，邻氯青霉素和双氯青霉素为,,?,,，动物肌肉组织中,,,为,, , ,,,,。韩国规定羟氨苄青霉素、氨苄青霉素的,,,为,(,,,,,,,，青霉素的,,,为,(,, ,,,,,。中国农业部制定的氨苄青霉素在牛奶中的,,,为, ,,,,，在动物可食组织中的,,,为,(,,,,,,,，青霉素在动物肝、肾的,,,为,(,,,,,,,。鉴于此类药物应用带来的问题，各国科学家对其残留检测方法的应用也各不相同。,青霉素类药物残留前处理方法的研究概况 动物性食品中兽药残留的特点是样品中残留物含量水平很低，样品基质复杂，干扰物质多，不易从样品中分离、纯化残留物。 因此，兽药残留分析是复杂生物样品基质中痕量组分的分析技术，样品的分离纯化是兽药残留分析中最费时费力的前处理 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 。样品处理过程通常包括提取、净化和浓缩富集等过程。传统的样品处理技术如液一液分配、液一液萃取等仍在广泛使用，同时一些新的样品分离纯化技术也不断被引入到兽药残留分析中如基质固相分散技术、免疫亲和色谱技术、分子印迹技术、超临界流体萃取(,,,)等。这些方法都是目前兽药残留分析领域中的研究热点。,(,免疫亲和色谱法(，,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,，，,,) 免疫亲和色谱技术(，,,)是用色谱柱技术，把抗体固定在适当的固相支持物上，制备出用于药物残留检测的分离纯化样品的，,,柱，其再与,;—,,或,,,,等联用，达到很好的分离检测效果。其利用抗体与抗原或半抗原可逆的生物专一性相互作用来达到净化和富集分析物的目的。它的特点是具有高度的选择性和特异性，特别适用于复杂样品基质中痕量组分的分离和前处理，将，,,作为理化测定技术的样本净化手段，避免了免疫分析直接测定样本的诸多不足，，,,的高选择性和高效性无疑使样本前处理大大简化，通常一次层析即可使待测物得到高度净化和富集，并提供了待测物的定性信息;使用多种抗体制备的，,,柱(,，,,)使免疫分析实际具备了处理多残留组分的能力。,,,,, ,,,,,,,等口,利用制备的氨苄青霉素单克隆抗体偶联,,,,活化的,,,,,,,,, ,,制备，,,柱，其对氨苄青霉素和苯唑西林的相对柱容量是,(,,,(,腿,,,，阿莫西林、氨苄青霉素、苯唑西林、双氯西林、青霉素,和氯唑西林的回收率在,,，,一,,,,。 ，,,的最显著优点在于其对待测物的高效、高选择性保留能力，特别适用于复杂样品中痕量组分的净化与富集。其前处理操作简单，快速简便，非常适合于复杂基质中痕量组分的分离、检测，而且，,,技术作为兽药残留分析的检测手段能使分析过程，特别是前处理步骤大大简化，可以作为相对独立的快速检测方法。 本实验制备的，,,柱具有青霉素类族特异性，即对青霉素类特别是第二代青霉素类药物(以,,,,,为母核结构)具有净化及富集作用，可对青霉素类药物多药物残留同时快速处理检测，对残留分析的快速推广具有很重要的意义。,(,其他样品前处理方法,(,(,液一液萃取(,,？,,, ,,？,,, ,,,,,;,,,,，,,,),一, 液一液萃取常用于样品中被测物质与基质的分离，在两种不相容液体或相之间通过分配对样品进行分离而达到被测物质纯化和消除干扰物质的目的。在大部分情况下，遵循“相似相溶”原理。在水和有机相中，亲水化合物的亲水性越强，憎水性化合物将进入有机相中的程度就越大。 在兽药残留分析中，液一液萃取通常作为提取手段与固相萃取(,,,)、免疫亲和色谱 (，,,)等其他净化技术结合应用。在兽药残留分析中，液一液萃取还经常作为一种净化手段，用来脱去组织提取物中的脂肪。一般组织样品经乙腈或甲醇等有机溶剂提取后，使用正己烷对提取溶剂进行脱脂哺,。 ,(,(,固相萃取(,,,,, ,,,,, ,,,,,;,,,,，,,,),。,们 固相萃取(,,,)是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱达到分离和富集目标化合物的目的。与液一液萃取相比固相萃取具有回收率高，分离效果好、操作简单、省时、省力等优点，同时所需费用也有所减少。并且,,,既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取、又可用于净化、浓缩或富集，是目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术。,,,,,,等曾使用,,,,,,, ,,,柱净化苄青霉素和苯氧甲基青霉素提取液。,,,,,,等用,,,, ,,,, ,,,柱替代了,,,,,,等所用的,,,(,,, ,,,柱，在研究中发现，,,,,,,, ,,,柱填料的碳含量,,,,，而,,,, ,,,,,,,柱的碳含量为,,,。试验表明，为了从萃取柱中得到,,,,的回收率，,,,柱填料的含碳量至少为,,,。故在使用,,,净化时要使药物的损失最小，必须考虑,,,柱的碳含量。,(,(,基质固相分散技术(,,,,,, ,,,,,—,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,,),卜,,, 基质固相分散技术是一种用于固态样品的制备技术，集提取净化富集于一体的前处理方法。,,,,是一种在,,,的基础上改进后的样品处理方法。与,,,比较其优点在于:它依靠机械剪切力、,,,键合相的去垢效应和巨大的表面积使样品结构破碎并且在填料表面均匀分散，浓缩了传统的样品前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免了样品匀化、转溶、乳化、浓缩造成的待测物损失，而且固定相处理样品的比容量大，提取净化的效率较高，可大大节约试剂、时间和人力，且不需要特殊仪器设备。,,,,处理样品耗时短(样品处理时间缩短达,,,)、节省溶剂(溶剂消耗可节约约,,,)、样品用量少(通常少于,,)，引起兽药残留分析界的广泛关注，在,,,,,,等,,,提出,,,,，并成功地应用于分析牛肉中的苄青霉素、氨苄青霉素和头孢匹林后的数年间，该方法已被用 ,于近,,种的兽药残留分析。,(,(,分子印迹技术(,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,,,,,，,，,) 分子印迹技术是使用分子印迹聚合物(,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,,)作为固定相，代替免疫亲和色谱中使用的抗体。,，,,又称“塑料抗体”，是以待测物作为模板分子，利用高分子合成手段制备的、能选择性吸附待测物的功能高分子材料。,,,,(,(,等,副制备了以硅胶键合的嗯唑酮的,，,作为固相萃取剂，成功识别.