酵母菌综述

第四节 酵母菌 三、酵母菌的繁殖方式与生活史 （一）酵母菌的繁殖方式   酵母菌的繁殖方式有无性繁殖和有性繁殖两类，其中无性繁殖又分为芽殖和裂殖。各种酵母的繁殖方式不尽相同。在发酵工业中常用的酵母以无性繁殖中的芽殖为主。 1.无性繁殖 （1）芽殖 1）酵母菌的出芽过程（图2-72，图2-73）。首先是细胞核邻近的中心体产生一个小的突起点，同时细胞 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面向外突出，逐渐冒出小芽。然后部分已经增大的核、细胞质、细胞器（如线粒体等）进入芽内，最后芽细胞从母细胞得到一套完整的核结构、线粒体、核糖体、液泡等，与母细胞分离并成为独立的细胞。 2）酵母的出芽数。一个酵母能形成的芽数是受到限制的。在酿酒酵母中，若营养不受到限制，产生的芽即人为除去，则每个细胞可产生9～43个芽。然而在正常情况下，在达到平衡期的正常群体中，大多数细胞或没有出芽痕或只有很少的芽（1～6个），仅少量的细胞有12～15个芽，也有的研究者认为常见的是以20个芽为度。在群体中，最老的部分细胞出芽数小于最大值的原因是营养消耗和（或）细胞数量太大（图2-74）。 图2-72　酵母细胞的出芽过程 图2-73　酵母细胞出芽过程的核行为 3）酵母细胞的出芽位点。在双倍体酵母属中，芽的分布或多或少是随机的。在单倍体酵母属中，出芽痕多数以排、环或螺旋状出现。在产生3～4个子细胞后，细胞表面逐渐不规则，在产子囊的尖形酵母中，出芽点都在细胞的两极，出芽痕彼此重叠。由于细胞的极区被一系列环圈占据，因而具有特殊的芽痕特征。红酵母属的种株通常在同一位点重复形成芽，由于在原来细胞壁下面连续地出芽，于是形成厚厚的领圈状。 图2-74　酵母细胞的多个芽痕   一般当芽长到正常大小时，子细胞就与母细胞脱离，以典型的单细胞状态存在。但也有的酵母在芽长到正常大小时仍与母细胞相连，而且还继续产生芽。如此反复进行，最后成为具有发达或不发达分枝的假菌丝（图2-75，图2-76）。实际上假菌丝就是芽殖后的子细胞与母细胞之间极窄的相连面，像一细腰。而真菌丝横隔处两细胞的宽度是一致的。是否形成假菌丝在酵母分类上虽具有重要意义，但由于假菌丝的形态会随培养条件改变，因而它在分类上的参考价值不大。 图2-75　假菌丝的几种类型 图2-76　热带假丝酵母 （Candida tropicalis）的真菌丝、假菌丝和芽孢子 （2）裂殖   在裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）中，当酵母细胞的径间出现横隔之后，就会横向裂开形成两个细胞（图2-77），同时形成芽痕，然后逐渐在原细胞和新长出的细胞间留下一道环状的疤痕。伸长的母细胞和新生长的细胞随后又裂殖，长出新细胞，这种自我重复的过程，使得原细胞上新的痕圈不断叠加。 （3）芽裂繁殖   这是一种界于出芽和横隔形成两者之间的一种裂殖法，这种繁殖法很少见。它首先是在芽基很宽的颈处出芽，然后形成一层横隔将芽与母细胞分开（图2-78）。 这种繁殖可在类酵母属（Saccharomycodes）、拿逊酵母属（Nadsonia）和瓶形酵母属中出现。 图2-77　裂殖酵母的裂殖和新痕圈的不断叠加 图2-78　类酵母的芽裂繁殖 2.有性繁殖   酵母菌以形成子囊孢子的方式进行繁殖的过程，称为有性繁殖。此繁殖过程是：首先由两个具有性亲和性的单倍体酵母细胞各伸出一根管状原生质体突起，然后吻合而成一接合桥，先行质配，继而进行核配，形成一个双倍体。随后在一定的条件下双倍体细胞成为子囊进行减数分裂；进而分裂成不同数的子核，形成子囊孢子，也有未经性细胞结合而形成子囊孢子的。 （1）子囊孢子的形状   不同的酵母形成的子囊孢子形状是不同的，如图2-79、图2-80所示。这是酵母菌分类上的特征之一。 图2-79　子囊孢子的形状 （2）子囊孢子的形成   能形成子囊孢子的酵母形成孢子的条件并不相同，有的在常规条件下即可，有的则需要特殊的条件，其中影响较大的是培养基（表2-13）。 （3）我国一些酿酒酵母的产子囊孢子情况   酿酒酵母的品种不同，产子囊孢子情况差异很大，一些啤酒酿造用酵母产子囊孢子性能则明显退化，但面包酵母产子囊孢子性能极强（表2-14）。 图2-80　几种典型子囊孢子的照片 表2-13　某些酵母菌产生子囊孢子的培养基   酵母菌葡萄糖琼脂 Gorodkowa 琼脂 酵母膏麦芽汁琼脂 玉米粉琼脂 醋酸钠琼脂 马铃薯葡萄糖琼脂 酵母膏 0.5g   0.3g       葡萄糖 5.0g 0.25g 1.0g   0.062g 2.0g 琼脂 2.0g 2.0g 2.0g 2.0g 2.0g 2.0g 肉汁   1.0g         NaCl   0.5g         蛋白胨     0.5g       麦芽汁     0.3g       玉米粉浸       100mL     出汁             膘         0.25g   醋酸三钠         0.5g   马铃薯浸           23 mL 出汁             蒸馏水 100 mL 100 mL 100 mL   100 mL 73 mL 适用菌属 许旺氏酵母属 汉逊德巴利酵母 汉逊酵母属、毕赤氏酵母 类酵母属、内孢霉属 酵母属 某些单倍体的酵母属 表2-14　一些酿酒酵母产子囊孢子的比率（％） 菌  　号 培养时间／h 用  　途 48 88 120 156 14天 2.604 WL-2006 WL-2007 WL-2012 2.109 2.558 WL-2003 WL-2004 WL-2005 WL-2011 WL-2013 WL-2010 WL-2014 <5 0 0 0 0 <10 0 0 0 0 0 30 0 5 0 0 0 1 50 3 3 20 30 <8 98 0 30 8 0 0 2 50 5 30 50 40 10 98 0 55 10 0 0 5 65 10 40 50 40 10 98 0 55 30 0 0 30 85 50 40 50 40 10 99 0 啤酒酿造 啤酒酿造 啤酒酿造 啤酒酿造 白酒酿造 酒精发酵 酒精发酵 酒精发酵 酒精发酵 酒精发酵 酒精发酵 面包酵母 啤酒酿造 （二）酵母菌的生活史   在发酵工业中，酵母属酵母菌是目前最常用酵母，其生活史见酿酒酵母。这种酵母在平时一般以双倍体细胞形式存在，以无性的芽殖进行繁殖，它们在产子囊孢子培养基上会形成1～4个子囊孢子，所以会以单倍体细胞的形式存在。在单倍体细胞接触时，它又能经质配和核配重新产生双倍体细胞活动于自然界，这是一种单、双倍体同时存在的酵母。   以八孢裂殖酵母为例，这是一种以单倍体的细胞形式存在的生活史，其双倍体世代存在时间通常很短，仅在两个单倍体细胞和它们的核接合之后，以接合子形式存在。   路氏类酵母是以双倍体细胞为主要存在形式，子囊孢子在子囊内就成对结合，单倍体的形式存在时间很短。图2-81是三种类型酵母菌的生活史。 图2-81　三种类型酵母菌的生活史 （三）几种典型酵母菌的菌落形态 几种典型酵母菌的菌落形态如图2-82所示。 图2-82　几种典型酵母菌的菌落形态 A深红酵母（Rhodotorula rubra）； B玫红法佛酵母（Phaffia rhodozyma）； C大型罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）； D美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）； E浅红酵母（Rhodotorula pallida）； F酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）； G产朊假丝酵母（Candida utilis）； H出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）；　 I多孢丝孢酵母（Trichosporon cutaneum）； J荚复膜孢酵母（Saccharomycopsis capsularis）； K解脂复膜孢酵母（Saccharomycopsis lipolytica）； L季也蒙有孢汉逊酵母（Hanseniaspora guilliermondii）； M碎囊汉逊酵母（Hansenula capsulata）； N卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis）； O鲁氏酵母（Sarcharomyces rouxii） 四、酵母菌的分类 酵母菌属于真菌门的子囊菌纲和不完全菌纲。酵母菌的分类较复杂，既要根据其形态特征，又要依据其生理生化特征。 （一）酵母菌分类和鉴定的程序 1.营养性繁殖和生长特性 1）营养性繁殖特点。 2）营养细胞生长特点：①在液体和固体培养基上生长的细胞形态；②假菌丝和真菌丝的形成；③无性内生孢子的形成；④厚垣孢子的形成；⑤掷孢子的形成。 3）细胞壁和横隔的结构。 2.有性特征 1）子囊孢子的形成。 2）担孢子的形成。 3.生理生化特征 1）碳源的利用：①碳源的发酵；②碳源的同化；③熊果苷（arbutin）的分解。 2）氮源的同化。 3）无维生素培养基的生长及需要的维生素。 4）在50％葡萄糖-酵母汁琼脂和含5％葡萄糖酵母氮基（yeast nitrogen base）中加入10％NaCl的生长。 5）在37℃和其他温度条件下的生长，致死温度。 6）自葡萄糖产酸的情况。 7）淀粉利用试验。 8）脲酶试验。 9）脂肪的分解。 10）酯的产生。 11）放线菌酮的抗性。 12）在1％醋酸中的忍受力。 13）明胶液化。 14）DBB（重氮蓝B）颜色试验。 15）G＋C的分子百分比。 16）辅酶Q的结构。 17）核的染色。 18）TTC培养。 （二）酵母鉴定工具书 1）Barnrtt JA et al．，Yeast，characteristics and identification，Cambridge University Press，Cambridge，1983。 2）中国科学院微生物研究所常见常用真菌编写组，常见常用真菌，北京：科学出版社，1973。 （三）常见酵母菌的简捷分类 主要通过观察菌落及用显微镜观察细胞进行分类。常见酵母的简捷分类如图2-83所示。 图2-83　常见酵母的简捷分类 （四）酵母菌与细菌异同 酵母菌与细菌的异同如表2-15所示。 表2-15　酵母菌与细菌的异同 特征 酵母菌 细菌 细胞形态 一般为单细胞，呈球形、卵形、椭圆形也有腊肠形等。有的有假菌丝或真菌丝 单细胞，呈球形或杆状 细胞大小 一般细胞直径或宽度为3～6μm，长度为几十微米 一般细胞直径或宽度为0.3～0.6μm，比酵母小得多 菌落形态 一般有奶油状的单细胞集群、有光泽或光滑、黏稠，易挑起 一般为易挑起的单细胞集群，有各种颜色，表面特征各异 繁殖方式 一般为芽殖，少量为裂殖、有的具有性繁殖 一般为裂殖 细胞结构 具有完整的细胞核和线粒体等，细胞壁组成主要为葡萄糖和甘露聚糖等 只含有核质体，细胞壁组成主要为肽聚糖、脂多糖等 生长pH值 偏酸性 中性偏碱 五、发酵工业中常用常见的酵母菌 （一）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 这是发酵工业上最常用的菌种之一（图2-84）。按细胞长与宽的比例可将其分为三组。 1）细胞多为圆形或卵形，长与宽之比为1～2。这类酵母除了用于酿造饮料酒和制作面包外，还用于乙醇发酵。其中德国2号和12号（RasseII和RasseXII）最有名，但因其不能耐高浓度盐类，故只适用于以糖化的淀粉质为原料生产乙醇和白酒。 2）细胞形状以卵形和长卵形为主，也有些圆形或短卵形细胞，长与宽之比通常为2。常形成假菌丝，但不发达也不典型。这类酵母主要用于酿造葡萄酒和果酒，也可用于酿造啤酒、蒸馏酒和酵母生产。葡萄酒酿造业称此为葡萄酒酵母（Sac．ellisoideus）。 3）大部分细胞长宽之比大于2，它以俗名为台湾396号酵母为代表。我国南方常将其用于糖蜜原料生产乙醇。其特点为耐高渗压，可忍受高浓度盐类。该酵母原称魏氏酵母（Sac．willanus）。 图2-84　酿酒酵母   在啤酒酿造中最早采用的酵母是卡尔斯伯啤酒厂的E．C．Hansen（1842～1909年）在1883年分离的卡尔斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis），这是一种底面发酵酵母。酿酒酵母也可用于啤酒酿造，但属上面发酵酵母，这两种酵母发酵的过程和啤酒风味都有所不同。   目前在分类上皆采用酿酒酵母的学名。   底面发酵酵母其细胞为圆形或卵圆形，直径为5～10μm。它与酿酒酵母在外形上的区别是，卡氏酵母部分细胞的细胞壁有一平端。另外，温度对这两类酵母的影响也不同。在高温时，酿酒酵母比卡氏酵母生长得更快，但在低温时卡氏酵母生长较快。酿酒酵母繁殖速度最高时的温度为33℃，而卡氏酵母需在36℃。但在8℃时卡氏酵母较酿酒酵母繁殖速度几乎快一倍。 （二）异常汉逊酵母（Hansenula anomala）   细胞为圆形，直径4～7μm，椭圆形成腊肠形，大小为（2.5～6）μm×（4.5～20）μm，甚至有长达30μm的长细胞，多边芽殖，发酵，液面有白色菌醭，培养液混浊，有菌体沉淀于管底（图2-85）。   生长在麦芽汁琼脂斜面上的菌落平坦，乳白色，无光泽，边缘呈丝状。   在加盖片的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养，能生成发达的树状分枝的假菌芽生孢子圆或椭圆形。菌丝顶端的细胞很长，可达20μm。 图2-85　异常汉逊酵母   子囊是由细胞直接变成的。每个子囊有1～4个（多为2个）帽形孢子，子囊孢子由子囊内放出后常不散开。   从土壤、树枝、树木中流出的汁液、储存的谷物、青储饲料、湖水或溪水、污水和蛀木虫的粪便中，都曾分离到异常汉逊酵母。   由于异常汉逊酵母能产生乙酸乙酯，故它常在调节食品的风味中起到一定作用。如将其用于无盐发酵酱油可增加香味，有的厂还用这种菌参与以薯干为原料的白酒的酿造，采用浸香和串香法可酿造出比一般薯干白酒味道醇和的白酒。它氧化烃类的能力较强，能利用煤油，可以用乙醇和甘油作为碳源，在100mL无机盐合成培养基（以3g硫酸铵为氮源）中，逐步加入6mL乙醇（每次加2mL），经6天培养可得3.9g菌体。不少真菌在培养液中能积累游离氨基酸，其中异常汉逊酵母积累L-色氨酸更为突出。 （三）粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）   细胞呈圆柱形或圆筒形，末端圆钝，也有的呈椭圆形，大小为（3.55～4.02）μm×（7.11～24.9）μm。营养繁殖为裂殖，无真菌丝，无醭，在麦芽汁中能发酵，液体混浊有沉淀（图2-86）。   培养在麦芽汁琼脂斜面上的菌落为乳白色，光亮、平滑、边缘整齐。   在加盖片的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养不生成假菌丝，也无真菌丝。   子囊由两个营养细胞接合后形成，每个子囊有1～4个光面的圆形子囊孢子，大小为3～4μm。 图2-86　粟酒裂殖酵母   该酵母最早是从非洲粟酒中分离出来的，以后不同的人曾多次在甘蔗糖蜜中将它分离出来，在水果上也常能发现它。   有人曾对在用菊芋（鬼子姜）制成的未水解糖液中粟酒裂殖酵母的发酵能力进行研究，结果发现，由此可得到产量很高的乙醇。 （四）黏红酵母黏红变种（Rhodotorula glutinis）   细胞呈卵形到球形，大小为（2.3～5.0）μm×（4.0～10）μm，某些菌株细胞较长，可达12～16μm，其宽度可增到7μm（图2-87）。   在麦芽汁琼脂斜面上培养，细胞较液体麦芽汁中小一些，有时也长一些。在斜面上培养一个月以上，菌苔呈现珊瑚红到橙红色或微带橘红色；表面由光滑到褶皱，有光泽，质地黏稠有时发硬；其横切面扁平，有较宽的凸起部分，边缘由不规则到整齐，顶端常有较原始的假菌丝。   在加盖片的玉米粉琼脂培养基上培养，通常无假菌丝或只是较原始类型的假菌丝，但偶尔也有某些菌株的假菌丝很发达，有时甚至出现真菌丝。   人们曾从空气、水、花、土壤、鳟鱼肠道、泡菜水、腌小虾、榆树叶的液汁、白杨树的黏液中分离出黏红酵母。   这个种能氧化烷烃，是较好的产脂肪菌种。据报道，其脂肪含量可达干物重量的50％～60％，但合成脂肪速度缓慢，如在培养液中添加氮和磷，则可增大合成速度。产1g脂肪约需4.5g葡萄糖，在一定条件下，还可产生L-丙氨酸和L-谷氨酸。其产蛋氨酸的能力很强，蛋氨酸的产量可达干重的1％。 图2-87　黏红酵母 （五）产朊假丝酵母（Candida utilis）   细胞呈圆形、椭圆形或圆柱形（腊肠形），大小为（3.5～4.5）μm×（7～13）μm，无醭，管底有菌体沉淀，能发酵。   培养在麦芽汁琼脂斜面上的菌落为乳白色，平滑，有光泽或无光泽，边缘整齐或呈菌丝状。   在加盖片的玉米粉琼脂培养基上培养，仅能生些原始假菌丝，或不发达的假菌丝，或无假菌丝；不产生真菌丝。   有人曾从酒坊的酵母沉淀、牛的消化道、花、人的唾液中分离出产朊假丝酵母。   在微生物蛋白中，人们研究得最多的是酵母蛋白。其中以产朊假丝酵母和啤酒酵母是最常用的，而产朊假丝酵母的蛋白质含量和维生素B含量均比啤酒酵母高，它能够以尿素和硝酸作为氮源，在培养基中不需要加入任何刺激生长的因子即可生长。特别重要的是，它能利用五碳糖和六碳糖，既能利用造纸工业的亚硫酸废液，也能利用糖蜜、马铃薯淀粉废料、木材水解液等生产出人畜可食的蛋白质。在工业生产酵母时，一般不用淀粉废料，即使需要利用时，也常常要将能分泌淀粉酶的肋状拟内孢霉（Endomycopsis fibuliger）或柯达氏拟内孢霉（Endomycopsis chodati）同时加入培养，这样，产朊假丝酵母便可利用拟内孢霉分解淀粉所产生的糖作为其菌体生长的碳源。 （六）白地霉（Geotrichum candidum）   28～30℃在麦芽汁中培养1天，产生白色醭，呈毛绒状或粉状，韧或易碎。具有真菌丝，有的有两叉分枝，横隔多或少，菌丝宽2.5～9μm，一般为3～7μm，裂殖，节孢子单个或连接成链，呈长筒形、方形，也有椭圆形或圆形，末端圆钝。节孢子绝大多数为（4.9～7.6）μm×（5.4～16.6）μm（图2-88）。   28～30℃在麦芽汁琼脂斜面划线培养3天，菌落白色，呈毛状或粉状，皮膜型或脂泥型。菌丝及节孢子的形状与麦芽汁中的近似。   28～30℃在麦芽汁琼脂上悬滴培养14h，节孢子发芽形成菌丝，有横隔，悬滴边缘处有的菌丝断裂为节孢子；22h后一部分菌丝末端断裂成节孢子。   25～28℃在麦芽汁琼脂上的巨大菌落，经培养3天后，直径为30～40mm，5天达50～70mm；培养5天的菌落为白色，呈绒毛状或粉状。   此菌能水解蛋白，其中多数能液化明胶及胨化牛奶，少数则只能胨化牛奶，但不液化明胶；其生长最高温度为33～37℃。   从动物粪便、有机肥料、烂菜、蔬菜、青菜、树叶、青储饲料、泡菜及土壤垃圾中都可分离到白地霉。其中以烂菜上分布最多，肥料和动物粪便次之。   白地霉的营养价值并不比产朊假丝酵母差，因此可供食用及用作饲料，也可用于提取核酸。白地霉还可合成脂肪，但产量不如红酵母、脂肪酵母等高。 图2-88　白地霉 （七）粉状毕赤酵母（Pichia farinosa）   毕赤酵母属细胞形状多样，多边出芽；能形成假菌丝，常有油滴，表面光滑，发酵或不发酵，不同化硝酸盐，能利用正癸烷及十六烷，可发酵石油以生产单细胞蛋白，在酿酒业中为有害菌，代表种为粉状毕赤酵母（Pichia farinosa）（图2-89）。   粉状毕赤酵母是最近迅速发展的一种基因工程表达宿主，它有许多优点：①含特有的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可以严格地调控其表达；②有完备的发酵方法，可以高密度连续培养，其转化子能够非常稳定地表达外源蛋白质，蛋白产量高；③适应能力强，易于操作，可以在廉价的非选择性培养基中生长；④基因表达产物既可在胞内，又可被分泌到胞外，分泌的异源蛋白质占所有被分泌蛋白的30％以上，利于工业规模的生产；⑤能对要表达的多肽和蛋白质进行翻译后加工处理。利用重组的基因工程毕赤酵母已高效表达植酸酶。   毕赤酵母是一种甲醇酵母，对外源蛋白的糖基化等更接近于哺乳动物细胞，而目前较为广泛使用的酿酒酵母则往往出现过度糖基化，这些都是毕赤酵母日益受到重视的主要原因。其表达系统已经迅速地成为重要的蛋白质表达系统之一，现广泛使用于各类实验室。   用毕赤酵母表达蛋白水平高出酿酒酵母10～100倍，又适用于高密度发酵，因此更适用于工业化生产。 （八）产甘油假丝酵母（Candida glycerinogens）   细胞圆筒形、卵圆形，大小为（2.5～4.4）μm×（4.4～12.0）μm，菌落为干燥、灰白、平薄。芽殖，易形成假菌丝，不产生子囊孢子（图2-90）。线粒体DNA分子量为20kb左右，符合假丝酵母属典型特征。碳源主要是葡萄糖、蔗糖和乙醇，对甘油、柠檬酸微弱且利用缓慢，不能同化肌醇、赤藓醇、阿拉伯醇、甘露醇及硝酸盐，与DBB显色反应为阴性。该菌具有独特的生理生化特征，该菌株厌氧时仅对葡萄糖微发酵，对麦芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖不发酵，同化葡萄糖，但不同化麦芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖，能同化乙醇和烃类，生长不需要外源维生素；在25℃、30℃、37℃及40℃下生长；在含500g/L葡萄糖的培养基及10mL/L醋酸的培养基中良好生长，最低生长水活度为0.890。它具有合成并分泌高浓度甘油的特性，是目前我国用于发酵甘油工业化生产的优良菌株。该菌株甘油产率高，工业化生产也已经达到100～130g/L；耐高渗压，可以在含500g/L葡萄糖的培养基中生长，因而发酵过程很少出现染菌，发酵条件粗犷；耗糖转化率达60％以上。   该菌株与克鲁斯假丝酵母（Candida krusei）多处相似，早期曾定名克鲁斯假丝酵母。 图2-89　粉状毕赤酵母 图2-90　产甘油假丝酵母细胞和假菌丝