中药丹参和蒲黄的药代动力学研究

中药丹参和蒲黄的药代动力学研究 西北大学 硕士学位论文中药丹参和蒲黄的药代动力学研究 姓名:杨燕 申请学位级别:硕士 专业:分析化学 指导教师:卫引茂 20080522 西北火学硕:,:学位论文 中药丹参和蒲黄的药代动力学研究 摘要 药物代谢研究在药物研究与开发上占举足轻重的地位，中药活性成分的代谢研究近几年也越来越引起人们的重视。本文采用,,和,,,,分析手段研究了中药丹参和蒲黄的药代动力学，取得了如下成果: 一、建立兔血浆中丹参素的,,,,分析 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。采用高氯酸沉淀蛋白，乙酸乙酯萃取兔血浆中的丹参素，在,,,,优化条件下，对样品进行分析。该方法的线性范围为,(,,,,肛,,,,，,,,为,(,, ,,,,,，精密度的,,,为,(,，,,(,,，平均回收率为,,(,,—,,,(,,,。结果表明，所建立的,,,,方法线性范围宽，灵敏度高，准确性好，适合于丹参素的药代动力学研究。 二、以丹参水提液给兔灌胃，采用,,,,方法研究丹参素在兔体内的药代动力学。药时曲线和药代动力学参数表明:血中丹参素浓度的经时变化符合二室开放模型，兔灌胃丹参水提液后,,(, ,,,达到最大血药浓度，,,加为,,(, ,,,，,,脚为,,(,,,,。 三、建立了兔血浆中槲皮素、山奈素和异鼠李素的，冲(,,,,同时分析法。以三氯乙酸为蛋白沉淀剂，水饱和正丁醇与乙酸乙酯的混和溶剂为最佳萃取剂。采用的色谱柱为,,,(,(, ,，,,,,,,, ,,，,岬)，流动相为,(,,磷酸水溶液:乙腈,,,:,,。槲皮素、山奈素和异鼠李素的线性范围均为,(,,,,(, ,眦;,,,分别为,(,, ,,,,,、,(,, ,,，,,和,(,,“,,,,;精密度和准确度均在?,,,以内。该分析方法灵敏、准确，适合于蒲黄中黄酮类化合物的药代动力学研究。 四、健康新西兰大白兔单剂量灌胃蒲黄的醇提水解液，以,,(,,,,法同时测定给药后不同时间点槲皮素、山奈素和异鼠李素的血药浓度，用,,,程序计算药动学参数。结果表明:三个指标成分的药动学过程均符合二室开放模型。槲皮素、山奈素和异鼠李素的,,双分别为,,(,，,,(,和,,(, ,,,;,,,,,分别为,,(,,，,,(,,和,,(,, ,证;,,伊分别为,,(,,，,(,,和,,(,, ,瓜,。 五、针对蒲黄中槲皮素、山奈素和异鼠李素三种黄酮类成分生物利用度低、 西北大学硕上学位论文 ，,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,;,垴,,,,;, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,,鼬加缸朋访勋，，觑咖,,,助耽堡罐喜冀墓 躞翼霎寒蓁薹鐾挛,囊蠢薹季霎,蓁孽篓睦安:,?妻羹,蜊嗲,(,鎏茎,囊萋羞篓,兰,鐾蓁龙耋荔冀羔蚕,薹鼬莲辇垂量,,砾?萎鬟: 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全,,解西:,匕大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保桁口汇编本学位论文。同时授权中国科学技术蓓息研究所等机构将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名:本豪燕 指导教师签名: 乙卯,年乡月,,,,日产,《烽,月?阳 西北大学学位论文独创性声明 本人声明:所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位 或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:杨垫 ?昭年岁月,,日 西北大学硕士学位论文 弟一早三百,匕 第一章绪论,(,药代动力学概述 随着药物化学的发展及人类健康水平的不断提高，对药物的药代动力学性质的要求越来越高:判断一个药物的应用前景特别是市场前景，不单是疗效强，毒副作用小，更要具备良好的药代动力学性质。药代动力学是应用动力学原理与数学处理方法，定量地描述药物在体内的动态变化规律，其吸收(,,,,,,,,,,)、分布(,,,仃,,谢,,)、代谢(,,,,,,,,,,)和排泄(,,;,,,,,,)，即,,,,过程，并且探讨药物在体内发生的代谢或者生物转化途径，进一步确证代谢产物的结构，研究代谢产物的药效或者毒性，使其结果为新药的定向合成、结果改造和筛选服务。,(,(,药代动力学参数 药物体内过程的药代动力学参数主要从以下几个方面描述:(,)吸收 评价吸收过程的参数主要有:?溶出度:药物分子在消化道中溶解的程度;?生物利用度:药物吸收的程度;?绝对生物利用度; 达峰时间。(,)分布 评价分布过程的参数主要有:?表观分?最大血药浓度:? 布体积(印,,,,,, ,,,唧, ,,,,,,,,,,,,,,，,,,):表征药物在体内被组织摄取的能力，表观容积大的药物体内存留时间较长:?药物浓度(时间曲线下面积;?分布半衰期(,,忍,)。(,)消除 药物按其在血浆消除的速率分成一室模型或二室模型。一室模型:药物进入血液迅速分布全身，并不断被清除;二室模型:药物进入体内后，首先快速分布于组织中，然后进入较慢的消除过程。评价消除过程的参数主要有:?消除速率常数(,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,):反映药物在体内消失的快慢，不完全反映药物的作用时间(代谢物也有活性);?半衰期(,,岔):药物浓度或药量降低,,,所需的时间，是衡量一种药物从体内消除快慢的指标;?消除半衰期(,,脚，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,);?清除率(;,,,,,,;,)或肾清除率(,,，,,, ;,,,,,，,;,):指单位时间从体内消 西北大学硕士学位论文除的含药血浆体积或者单位时间从体内消除的药物表观分布容积，常用,,，又称体内总清除率。,(,(,药代动力学与新药研发 新药研发是一个快速发展的领域，随着组合化学等高技术和天然药物分离制各技术的发展，加快了候选药物的出现。在这些候选药物中，不仅需要对其药效学进行评价，药物代谢和动力学性质也是非常重要的新药筛选指标。理想的药物需要具有持久的药物作用时间和良好的生物利用度。因此，在新药的设计、筛选过程中应该考虑候选药物可能出现的代谢特征以及药代参数特点，以获得更为有效的药物。优化药代动力学性质，是药物设计的重要内容之一。通过结构改造或分子设计优化药物的吸收与分布，能够突破国外专利保护药。一般来说，对药代动力学性质的优化，不涉及药物的基本结构，因此，成功的几率较高，有可能以最小的成本，获得具有自主知识产权的药物。根据代谢研究的结果，进行结构优化，实现药代性质的可预测性或可控性，减少个体差异和药物相互作用。,(,中药药代动力学，,(,(,中药药代动力学研究的目的及意义 中医药是中华民族的传统瑰宝，许多西医药无法医治的顽症可用中医药攻克。然而，由于中药化学成分的复杂性，我们始终无法像西药那样阐明其在体内发挥疗效的药效物质基础和作用机理。这严重制约了中药走向国际医药市场的步伐，并成为实现中药现代化的主要瓶颈。中药药代动力学可在一定程度上解决 以上问题，中药药代动力学是指在中医药理论的指导下，利用药代动力学的原理与数学处理方法，定量描述中药有效成分、有效部位以及单昧中药和中药复方进入机体后的吸收、分布、代谢、排泄等过程的动态变化规律，即研究给药后体内中药的位置、数量、疗效与时间的关系，并提出解释这些关系所需要的数学关系式的科学。 中药药代动力学的研究目的:阐明中药在体内发挥疗效的药效物质基础和作用机理;同时，为临床应用选择合适的剂型和制定合理剂量提供科学依据;此外，为发现新药提供一条新的途径。近年来国内外学者在中药药动学研究方面进行了 , 西北大学硕十学位论文大量的实践，内容涉及生物利用度、毒代动力学、透皮吸收药动学、群体药动学、时辰药动学、证治药动学、活性成分在肠道的代谢处置和在体液中浓度的测定等。中药药动学的研究对阐明和揭示中草药作用机制及其科学内涵，设计及优选给药方案，促进中药新药开发和剂型改进及提高质量水平，推动中医药走向世界，并最终实现中药现代化具有重要意义。,(,(,研究方法 中药药动学的研究方法可分为两大类:一类为化学测定法，主要用于化学结构明确且能用定量分析方法测定其在体内浓度的中药活性成分;另,类为生物测定法，主要用于有效成分复杂或有明确的中药组分和中药单、复方以及化学结构明确但缺乏足够灵敏、特异的体液药物浓度化学测定方法的中药活性成分。 研究方法主要有:血药浓度法【,捌，药理效应法【,，,,，药物累积法【,,和微生物指标法【,】。血药浓度法是药动学研究的经典方法，本文着重介绍血药浓度法。血药浓度法主要适用于有效成分明确或具有指标成分的中药及方剂。该法与化学药物动力学的研究方法相同，即测定给药后一定时间时，血、尿或其他体液、组织中的药物浓度，根据药物浓度(时间的曲线计算药动学参数。血药浓度法又分为两种:直接血药浓度法和中药效应成分血药浓度法。直接血药浓度法与通常的化学药物药代动力学研究方法完全相同，适用于已分离提纯的中药活性成分。该法所得到的参数较准确，这对于开发新药、阐明中药作用机制及临床合理用药有着重要意义。但是，通过该法所获得的资料只能说明活性成分本身的药代动力学特点，未必能反映含有这种成分的中药及其方剂的药代动力学特点。中药效应成分血药浓度法是研究单味中药或复方中药制剂给药后的吸收、分布、代谢和排泄等特点，与直接血药浓度法比较，其结果更接近于中药的临床实际情况。本法属于近年提出的血清药理学范畴。血清药理学认为，中药给药后产生作用时血清中必定含有真正的活性成分，此时所收集血清可认为含有真正活性成分的粗制药物(;,,,,, ,,,,)而可用于药理研究，并能从中找出其有效成分。日本学者称这种分离测定为血清药物化学(,,,, ,,,玎,,;,;,,,, ,,姆)。应用这种分析方法，国内顾宜等【,】利用,,,,研究了中药五灵胶囊五味子乙索在家兔体内浓度，并观察其经时变化过程;杨丽莉等【,】用,,(,,法测定了冰片和川芎嗪在家兔和人体内的血药浓 西北大学硕士学位论文度;张惠等【,】用,,,,(,,,法测定了犬血清中的黄藤素含量。 ?,(,(,仪器分析方法 由于这些体液或组织中药物浓度较低甚至是微量的，因此所应用的分析方法要有很高的灵敏度。现代分析技术的发展为中药药动学的深入研究提供了先进的手段，这些技术包括:(,)分光光度法 包括可见分光光度法?，,)，红外分光光度法(，,)和紫外分光光度法(,,)，是指在一定波长下，被测溶液对辐射光的吸收程度与溶液中组分的浓度之间存在定量关系，可进行该组分的含量测定。此方法灵敏度低、专一性差，但由于仪器简单，操作方便，仍有一 定应用。张普庆等【,,用丹皮酚花生油溶液对健康家兔肌肉注射给药，用紫外分光光度法测定给药后一定时间内血浆丹皮酚的浓度，结果表明，肌肉注射给药,, ,,,,后，丹皮酚吸收入血，,(, ,达吸收峰，, ,后血浆丹皮酚基本消失。(,)原子吸收光谱法(,,,) 处于基态的待测原子蒸气对从光源所发出共振线的吸收，从而进行元素分析。这种方法主要用于研究中药中金属元素的代谢过程，,,,具有灵敏度高，选择性好，测定快速，操作简便的优点。张欣怡吲应用原子吸收分光光度法测定口服甘草锌的血锌浓度并研究其在人体内药代动力学。(,)薄层扫描法(,,,) ,,,为色谱法的经典技术。样品经薄层分离后，在薄层板上直接测定或经适当处理产生荧光，在特定条件下，用光度计测其吸光度或荧光强度。,,,主要用于混合物中各组分的分离和分析，具有快速、灵敏、高选择性、显色方便等特点，在含量高的单一指标性成分的动力学研究中有很多应用。郭琦等【嘲建立薄层扫描法测定灌胃后兔血浆中西沙必利浓度，并绘制了药时曲线。何秀玲等【,,】建立了,,;测定大鼠血清中牛磺酸鹅去氧胆酸的浓度及其药代动力学参数。贺浪冲等【,,,利用固相萃取一薄层扫描法研究青藤碱在家兔体内的药代动力学，所建立的方法具有较高的灵敏度和准确度。(,)荧光法 , 西北大学硕士学位论文 荧光法用于能够产生荧光或能够淬灭荧光试剂的物质。以荧光 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 器代替紫外,可见检测，大大提高了分析的灵敏度，使分光光度法得到更广泛的应用。路丽华等【,,】采用液(液萃取法处理样品，建立了异丙酚血药浓度的荧光检测方法，结果表明异丙酚在人体代谢过程中符合药代动力学三室开放模型。胶束荧光法则是利用胶束溶液对荧光物试鋈堋?雒糇饔茫 晌 舛ㄎ?俊?哿坑 馕镏实囊恢至 劭焖俜治龇椒ā,又竟Φ取荆保础坎捎媒菏 夥ǘ圆构侵 睾鸵觳构侵 卦谕锰迥诘难 ?ǘ冉 校玻?,检测，并求出了系列药动学参数。该课题组在【,,】研究免血浆中延胡索乙素的药代动力学时发现对于血液中存在的痕量延胡索乙素应用直接荧光法难以测出，而使用胶囊荧光法最低检测限达,(,×,,,,咖,。(,)高效液相法(,,,,) ,,,,是目前应用最广泛的定量方法，它由经典液相色谱法发展而来。肿,,应用高压输液泵进行洗脱，并配有紫外检测器等，组成了自动输液、自动检测的液相色谱仪。此法不受样品挥发性、热不稳定的限制，只要能制成溶液的样品皆可用四,,法进行测定。本法分析速度快、分离效能高、检测灵敏度高，能在图谱中同时反映原药及其代谢物的情况。,, ,,,等【, ,】采用,,,,(,,方法研究他斯平碱溶液和他斯平碱脂质体经静脉注射后在大鼠体内的药代动力学过程及组织分布。结果表明，与它斯平碱溶液相比，他斯平碱脂质体在体循环时间长，脾和肝组织浓度大，心和脑组织的浓度小。顾世芬等【,,】采用乙醚萃取，稀硫酸回提的血样处理方法，建立人血浆中卡维地洛的,,,,(荧光法检测方法，并应用其研究了卡维地洛片的药代动力学。王晓强等,,,】采用,,,,法研究黄连与生地黄不同比例配伍对小檗碱在大鼠体内药动学的影响，探寻二者最佳配伍比例。结果表明，黄连与生地黄,:,时,,戤，,,,,(,，,,,,。最大，黄连配伍大剂量的生地黄，可显著提高黄连中有效成分小檗碱的生物利用度。从目前研究看，,,,,法结合不同性能检测器依然是中药代谢研究中的主要手段。(,)液相色谱(质谱联用技术(,,(,,) ,,(,,是,,世纪,,年代发展起来的将液相色谱(,,)分离技术与质谱(,,)检测手段结合，集,,的高分离能力和,,的高灵敏度、极强的定性专属性子一体的分析技术， 已成为药物代谢研究中不能替代的一种强有力的分离分析工具。在中药代谢物结构鉴定时，用,,(,,“技术可对有关成分进行在线分析检测并可给出 西北大学硕士学位论文丰富的化合物结构信息，因其选择性强，碎片离子重现性好等特点，对推测未知代谢物结构有重要意义。,, ,(,(等【, ,】采用,,,,,,,眦,方法，同时测定丹参水提液中的六种酚类成分在人血浆的浓度。经方法确认，此方法适合药代动力学研究。,, ,,等【,,】建立了测定小鼠血浆中灯盏乙素的,,,(,,,,,法，血浆样品经,,,固相小柱处理后，进样分析，线性范围为,,,,,舭，最低检测限可达, ,酌,,，显示了,,(,,在分析血浆中痕量药物的应用前景非常广阔。(,)气相色谱法(,,) ,,以气体为流动相的柱色谱法，适用于挥发性成分的动力学研究。但该方法仍存在一些缺陷，如对某些高沸点，极性大或挥发性和热稳定性差的样品，在分离前要用化学方法预处理，使其定量地转化成相应的适于色谱分析的化合物，分析操作复杂化，另外，对于非挥发性成分则不适用。魏立平等四采用气相色谱法研够细辛醚及石菖蒲挥发油中伊细辛醚的药物代谢动力学，兔全血中最低检测浓度为:,(,, ,,,,，伊细辛醚灌胃后，’在兔体内符合一级吸收二室模型，,,胁为,(,幽，,,兑墨为,,(, ，,,,。家兔灌胃石菖蒲挥发油后，伊细辛醚在体内的药时过程为线性动力学过程，同样符合一级吸收二室模型，,,胁为,,(,,证，,,脚为,,,(,,,，,。,,,【,“, ,,,,,,,等【冽采用毛细管气相色谱法检测兔血浆中的哌替啶，并研究其药代动力学。 与,,(,,类似，,,也可以与,,联用，并在中药的代谢研究中获得越来越多的应用。贺丰等【,,】建立用于同时测定麻黄碱、伪麻黄碱血药浓度的气相色谱(质谱法(,,(,,)，并探讨二者在人体内的药代动力学。沈朝烨等【,,,在碱性环境中提取血浆样品中积雪酸，高氯酸四丁基铵与之形成离子对缔合物，经固相萃取、净化、衍生，采用内标法进行大鼠血浆积雪甙代谢产物积雪酸的气相色谱(质谱(,,,,,)检测。(,)高效毛细管电泳法(,,,,) ,,是一种新型的分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快、操作费用低等优点，已在药物质量控制、手性对映体拆分及体内药物分析等方面获得了成功的应用，特别是胶束毛细管电泳法，即可以分析带电物质，又可以分析中性物质，因此比较适用于中草药的分析。李多璐等,,,】采用,,,,法对左氧氟沙星(,,,,)和多索茶碱(,,,)合用在大鼠体内的药代动力学进行研究。结果表明在大 , 西北大学硕士学位论文鼠体内,,,,对,,,的药代动力学无显著影响，单用和合用,,,均符合二房室模型。陈莲珍等【,,】采用,,,,研究犬脑脊液(,,,)中头孢曲松钠测定和单剂量静脉给药后脑脊液中头孢曲松钠药动学，以硼酸盐缓冲体系，完整测得单剂量静脉给药后脑脊液中头孢曲松钠的药时浓度，结果表明其符合一室模型，头孢曲松钠的给药方式应选静注，且给药间隔为,, ,，而不是通常的,, ,。这些研究显示了,,在药动学研究中的应用潜力，但是，,,重现性差的问题至今尚未很好的解决。因此其应用受到了限制。,(,(,生物样品预处理方法 生物样品的预处理是体内药物分析之前必须进行的一个重要步骤，也是整个分离分析过程中最烦琐的一个环节。生物样品中含有大量的内源性物质，不仅能与药物及其代谢物结合，而且常干扰测定。因此，生物样品中的药物必须经过分离、纯化、富集，必要时还需对待测组分进行化学改性处理，从而为最后的测定创造良好的条件。(,)样品均匀化 对于生物样品，应 在测定前混合均匀，以免造成测定误差。生物样品可置涡流混合器上混匀，血浆样品往复振摇亦可达到均匀化的目的。对粪便、肌肉和组织等含有不溶性组分的固体样品，须将样品进行匀浆处理，以保证样品的均匀性。(,)去蛋白处理 生物样品如血浆、血清等含有大量的蛋白质，它们能结合药物，因此对于药物的测定，必须先将与蛋白结合的药物游离之后再作进一步处理。通常去蛋白过程是将蛋白质变性处理后，把与蛋白结合的药物解离出来，离心分离以除去蛋白。通常除蛋白的方法是在含蛋白样品中加入适当的沉淀剂或变性剂(如有机溶剂、中性盐)，使蛋白质脱水而沉淀，有的是由于蛋白质形成不溶性盐而析出(如高氯酸)，离心后取上清液用于分析。甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂:中性盐可用氯化铵、,,;,等，它们沉淀蛋白是可逆的，即将蛋白稀释后仍具有生理活性，而有机溶剂和酸类沉淀的蛋白是不可逆的。另外，也可用透析法与超滤法除去样品中蛋白。(,)被测组分的提取 西北大学硕士学位论文 生物样品中被测组分一般需提取后才能进行色谱分析，这一步骤包含了样品的净化与浓缩。提取方法和提取条件的选择是分析方法研究的重要内容之一，它与分析方法的选择性、精密度和准确度紧密相关。?液(液萃取 液(液萃取是经典的样品提取方法之一，它基于被测组分在不相混溶的两种溶剂中的分配可用于水为基质的样品中非极性或弱极性组分的提取。在提取过程中，水相的,,是重要的参数;一般弱酸性药物可加入一定量的酸，弱碱性药物可加入一定量的碱，使药物以分子状态存在，有利于有机溶剂的提取效果。在液(质联用中，必须使用可挥发性的酸和碱，如盐酸、甲酸、乙酸、氨水等。有时加入一些强离子的无机盐(如氯化钠)，利用盐析作用，能促进组分进入有机相。通过选择不同的有机溶剂可提高选择性。一般可选用乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、正己烷、甲基叔丁基醚、甲醇、乙腈等有机溶剂及其不同比例的混合物进行提取。液(液提取有机相可用氮气吹干，残渣可用与色谱方法相适应的溶剂溶解后进样。两性药物或水溶性很强的药物不能用一般的溶剂萃取法将它们自体液介质中萃取出来，通常可用离子对萃取法。针对呈解离状态的药物，可以加入反离子来形成离子对络合物，再用有机溶剂萃取出来。一般碱性药物用十二烷基磺酸类限,,,,)作为反离子，其它有戊烷磺酸、己烷磺酸、庚烷磺酸、辛烷磺酸等;酸性药物可用烷基季铵类化合物(, ,,哎)作为反离子，如四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵等。形成离子对后可用相应有机溶剂提取。?固相萃取 固相萃取又称为固相提取柱法，自上世纪,,年代诞生以来，以其高效、高选择性、高度自动化的特点，被广泛应用于各种生物样品的分离和纯化。固相萃取技术以选择性吸附与选择性洗.