N-乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用

N-乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用 N-乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保 护作用 第46卷第1期 2010年2月 青岛大学医学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAEQINGDAOUNIVERSITATIS Vo1.46No.1 February2010 doi:10.3969/j.issn.1672—4488.2O10.01.004 N一乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用 张秋贵,韩敏 (1青岛大学医学院附属医院耳鼻咽喉科,lh东 ,张秀秀,李光玲 青岛266003;2青岛市城阳区医院耳鼻咽喉科) [摘要]目的通过建立大鼠耳毒性损伤模型,观察N一乙酰半胱氨酸(NAc)对庆大霉素所致耳蜗损伤的保 护作用.方法健康Wistar大鼠6o只,随机分为正常组,对照组,庆大霉素组,NAC干预一1组,NAC干预一2组. 对照组腹腔注射生理盐水120mg/(kg?d),共14d;庆大霉素组腹腔注射硫酸庆大霉素120mg/(kg?d),共14d; NAC干预1组在上述剂量腹腔注射庆大霉素前1h腹腔注射100g/L的NAC350mg/(kg?d),共14d;NAC干 预2组注射庆大霉素(同庆大霉素组)14d后再腹腔注射NAC3350mg/(kg?d),共14d.所有动物在实验前作 听性脑干反应(ABR)阈值测定,除正常组外其他组动物分别在全部用药结束后24h作ABR阈值测定,处死后取听 泡,苏木精伊红染色法观察耳蜗各部的组织学改变;免疫组织化学法检测耳蜗中核 因子一B(NF—B)及肿瘤坏死因 子(TNF)的表达.结果用药结束后,庆大霉素组ABR阈值与其他组比较差异均有显 着性(F一74.77,q一 3.28,5.29,P<0.05),NAC干预2组与其他组比较差异均有显着性(q一2.24, 3.28,P<0.05).庆大霉素组和 NAC干预2组血管纹,螺旋神经节和Corti器毛细胞NF-B,TNF—a表达增强,与其 他组比较差异均有显着性(F一 27.47,48.81,d一1.34,4.31,P<0.05).结论NFKB和TNF-a可能共同参与了耳 蜗药物性损伤过程,NAC可 能对庆大霉素所致的耳蜗损伤具有保护作用. [关键词]耳蜗;庆大霉素;药物毒性;N乙酰半胱氨酸;大鼠,Wistar [中图分类号]R361.2[文献标志码]A[文章编号]1672—4488(2010)0卜0007—04 THEPROTECTIONOFN— ACETYLCYSTEINEONDAMAGEDCOCHLEACAUSEDBYGENTAMICINZtIAN GQIUGUI, HANMIN,ZHANGXIUXIU,etal(DepartmentofOtolaryngology,TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedical College,Qingdao266003,China) EABSTRACT]ObjectiveToinvestigatetheprotectionofNacetylcysteine(NAC)againstthedamageofcochleacausedby Gentamieinbycreatingaratmodelofototoxicity.MethodsSixtyhealthyWistarratswererandomizedtofivegroups:thenor— ITIa1.contro1.Gentamicinototoxicity(GO),NACintervention一1(NACI一 1)andNACintervention2(NACI2)groups.Tothe c0ntrol,Deritonealinjection(PI)ofnormalsalineEl20mg/(kg?d)]wasgiven;totheGO,PIofGentamicin[12Omg/(kg?d)] wasoffered;totheNACI1,P1ofNAC[350mg/(kg?d)]wasdoneonehourbeforePIofthesatnedosageofOentamicinwasgi— venastt1eformertwogroups.TheCOUrSewas14daysfortheabovethreegroups.TotheNAC I一2,14daysafterPIofGentamicin, sameastheGO,andthenPIofNAC350mg/(kg?d)wascarriedoutforanother14days.AlltheratsunderwentABRleakpoint detectionbeforeexperimentand24hoursafterendingofmedication,exceptthoseinthenormalgroup.Theratswerekilledandthe oticvesiclescollected,whichwerestainedwithhematoxylin— eosin,thehistomorphologyofcochleawasobserved.Theexpressionof NFBandTNFdwasstudiedimmunohistochemically.ResultsUponcompletionofmedication,thedifferenceofABRbetween tbeGOandtheotherfourgroups(F一74.77;口一 3.285.29;P<0.05),andthatofABRbetweentheNACI一2andtheotherfour groupsweresignificant(q一2.24— 3.28,P<0.05).TheexpressionofNFBandTNFdinpsalterialcord,spiralganglionand Cortihairce1lintheGOandNACI,2wasstrongerthanthatintheotherfourgroups(F一 27.47—48.81;q一1.34—4.31;P< 0.05).ConclusionNFKBandTNFdmayinvolveinthecourseofpharmacologicdamageofthecochleacausedbyGentamycin, oHwhichNACprobablyshowsitsprotection [KEYWORDS[]cochlea;gentamicin;drugtoxicity;N—acetylcysteine;rat,Wistar 耳毒性药物损伤是当前临床治疗的一大难题, 众多学者围绕其发病机制及治疗展开了深入的研 究,以期为临床治疗耳毒性药物损伤提供更好的思 路和方法.关于药物性损伤的机制,目前多认为与 自由基损伤,钙离子超载等有关,但其损伤机制 [收稿日期]2009,0622;[修订日期]200909—05 [作者简介]张秋贵(1950),女,教授,硕:i_=生导师. 尚不明确.近年来,药物性损伤中核因子一-cB(NF— fcB)和肿瘤坏死因子一a(TNF一0:)所起作用引起人们 的广泛关注.本研究在建立耳蜗耳毒性药物损伤动 物模型的基础上,通过检测N一乙酰半胱氨酸(NAC) 干预下耳蜗组织形态学及NF一.cB和TNF表达的 变化,以期探讨NAC对庆大霉素耳蜗损伤的保护 作用.现将结果 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下. 青岛大学医学院46卷 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1材料来源 选用耳廓反射灵敏的健康Wistar大鼠6O只, 雌雄不拘,体质量15O,200g.NAC粉剂由北京 拜尔迪生物有限公司提供,鼠抗鼠NFB及兔抗鼠 TNF—a单克隆抗体分别由北京中杉生物有限公司 和武汉博士德生物有限公司提供. 1.2分组及处理 将健康Wistar大鼠随机分为正常组,对照组, 庆大霉素组,NAC干预一1组,NAC干预一2组,各12 只.对照组腹腔注射生理盐水120rag/(kg?d),共 14d.庆大霉素组腹腔注射硫酸庆大霉素120rag/ (kg?d),共14d;NAC干预一1组上述剂量腹腔注 射庆大霉素前1h注射100g/i的NAC350rag/ (kg?d),共14d;NAC干预一2组注射庆大霉素(同 庆大霉素组)14d后再腹腔注射NAC3350rag/ (kg?d),共14d. 1.3听性脑干反应(ABR)测试 动物在实验前及用药结束后24h行ABR阈值 测定.动物经腹腔注射体积分数0.10的水合氯醛 (150mg/kg)麻醉,测试采用Nicoletspirit诱发电 位仪, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 电极置颅顶硬膜下,参考电极置同侧耳 廓,对侧耳廓接地.耳机紧贴刺激耳,声刺激选短音 (升降时间各为1ms),刺激频率为8,4,2,1kHz. 带通滤波150,1500Hz.记录双耳ABR之?波 反应阈值. 1.4免疫组织化学染色及观察 停药并测试完ABR后迅速处死大鼠,断头后 取出听泡,剪开听泡暴露耳蜗,浸人25g/L的戊二 醛固定液中.在解剖显微镜下开放卵圆窗和圆窗, 在蜗顶钻孔缓慢注入25g/L的戊二醛固定液,将标 本于4?下置于固定液中固定24h以上,经PBS冲 洗后放人EDTA中进行脱钙,每隔1d换液1次,约 10d后脱钙完成,按石蜡标本制作程序制作切片, 片厚6m,行免疫组织化学染色.组织切片常规脱 腊至水,TNF—组无需热修复,NF—B组需热修复; 常温下正常血清封闭20rain,甩干后加一抗(NF—fcB 1:50,TNF—a1:50),常温下放置2h,滴加生物 素化二抗液,室温孵育20min.苏木精复染,显微 镜下观察. 1.5结果判断 光镜下TNF—a及NF一B表达阳性的细胞呈棕 黄色,阴性对照不着色. 1.6NF—JcB和TNF-u平均灰度值的测定 采用Moticimageadvance图像分析仪,分别测 量各组大鼠耳蜗组织不同部位NF一.cB和TNF—a平 均灰度值. 1.7统计学分析 实验数据以?5表示,采用SPSS11.0及 PPMS1.5r3统计软件进行统计学分析,多个样本均 数差异的显着性检验应用方差分析. 2结果 2.1ABR测试 正常组ABR阈值和对照组用药后比较差异无 显着性(P>0.05);用药后庆大霉素组ABR阈值与 其他组比较差异均有显着性(F一74.77,g一3.28, 5.29,P%0.05);NAC干预一2组ABR阈值与其他 组比较差异均有显着意义(q一2.24,3.28,P< 0.05).见表1. 2.2组织学观察 正常组,对照组大鼠耳蜗Corti器毛细胞无损 伤,血管纹清晰.庆大霉素组,NAC干预一1,2组大 鼠耳蜗Corti器毛细胞变形,崩解破坏,散在缺失, 螺旋神经节神经元数目减少,血管纹变薄,其中以庆 大霉素组损伤最严重;NAC干预一1组毛细胞轻微损 伤,血管纹尚清晰;NAC干预一2组见毛细胞变形,破 坏,血管纹变薄. 2.3各组大鼠耳蜗各部位NF—IcB和TNF—a表达 正常组血管纹,螺旋神经节,Corti器NF—JcB, TNF—a表达与对照组比较,差异无显着意义(P> 0.05);庆大霉素组和NAC干预一2组血管纹,螺旋 神经节和Corti器NF—KB,TNF,a表达与其他组比 较差异均有显着性(F一27.47,48.81,g一1.34, 4.31,P<0.05);NAC干预一1组与正常组和对照组 比较差异无显着性(P>0.05).见表2,3. 3讨论 在长期应用氨基糖甙类抗生素(AmAn)的治疗 过程中,耳毒性发生率可高达800A.AmAn的耳毒 性靶细胞主要是耳蜗和前庭毛细胞,其损伤可引起 不可逆的听力丧失和前庭功能障碍.本实验结果显 示,庆大霉素组的ABR阈值与正常组比较有显着 性差异. NF一B主要分布在螺旋韧带的I一型纤维细胞 1期张秋贵,韩敏,张秀秀,等.N乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用 表1各组ABR测试结果(L./dBNHL,士S) 表2各组大鼠耳蜗各部位NF-KB表达灰度值及其比 较(n=12,士) 表3各组大鼠耳蜗各部位TNF—a表达灰度值及其比 较(,l=12.士s) 和根细胞的胞浆内,螺旋缘的齿状细胞和螺旋器的 支持细胞也有一定的表达.WANG等研究结果 表明,作为内耳免疫应答主要部位的内淋巴囊及其 周围组织是NF—KB表达的另一重要区域,可以推测 螺旋韧带和内淋巴囊是调控内耳炎性反应的主要部 位,有助于阐明NF一,cB在内耳炎性损伤中的作用. 本研究结果显示,正常组,对照组大鼠耳蜗Corti器 毛细胞无损伤,血管纹清晰.庆大霉素组,NAC干 预1,2组大鼠耳蜗见Corti器外毛细胞变形,崩解 破坏,散在缺失,螺旋神经节神经元数目减少,血管 纹变薄,其中以庆大霉素组损伤最严重;NAC干预 1组毛细胞轻微损伤,血管纹尚清晰;NAC干预一2 组见毛细胞变形,破坏,血管纹变薄.这与以往的研 究结果基本吻合.提示NAC干预可能对庆大霉素 引起的耳毒性损伤具有保护作用.本文的研究结果 还显示,庆大霉素组TNF的表达与其余组比较差 异有显着性,提示TNF可能参与耳毒后耳蜗组织 损伤. 研究表明,NAC为抗氧化剂,是还原型谷胱甘 肽(GSH)的前体,具有阻断氧自由基介导的许多刺 激因子激活NF一B的活化过程,从而减轻内耳组织 的炎症反应和细胞损伤,改善大鼠的听阈].USA— MI等已发现抗氧化剂如谷胱甘肽存在于血管纹, 纤维细胞,毛细血管内皮细胞,螺旋韧带及前庭等部 位.另外,OHINATA等报道,低蛋白饮食的动 物,由于内生性谷胱甘肽水平很低,故对耳毒性药物 有更强的敏感性,同时也发现内生性谷胱甘肽可使 耳毒性药物敏感性减低.本实验中,用药后ABR 阈值,庆大霉素组与NAC干预1组,NAC干预2组 比较差异有显着性(P<0.05),NAC干预1组与 NAC干预2组差异有显着性(P%0.05),表明NAC 能干预庆大霉素引起的听力损害,并且在应用庆大 霉素之前预先给予NAC,其听力保护效果明显优于 在庆大霉素造成耳损伤后给药.NAC减轻庆大霉 素耳损伤的可能机制为:?NAC促进还原型谷胱甘 肽(GSH)的合成,与胞内酯类过氧化物反应,从而 达到清除酯类过氧化物的目的.此外,GSH对稳定 细胞膜及细胞器膜,稳定细胞内酶和蛋白质的功能 具有重要作用;?NAC可阻止耳毒性损伤后耳蜗组 织中性粒细胞氧自由基的瞬间爆发.同时,NAC可 直接作用于过氧化氢(H.O.)生成H()和O,还可 清除超氧阴离子,羟自由基ll8】.NAC可能通过其细 胞保护和抗氧化作用,阻断导致NF—tcB磷酸化的上 游信号而抑制NF—B,从而减轻内耳组织的炎症反 应和细胞损伤];?NAC可直接或者问接地影响胞 内Ca的平衡,减少Ca内聚,降低胞内Ca计超 载,防止因细胞内钙的上升而导致的毛细胞凋亡,从 而起到保护内耳损伤的作用. 本实验中正常组及对照组Corti器毛细胞无损 伤,血管纹清晰;药物性损伤各组均可见内外毛细胞 变形,Corti器内外毛细胞缺损,血管纹变薄.NAC 干预组较相对应的庆大霉素组细胞变形,缺损均减 轻,血管纹厚度略增加.表明NAC干预能明显抑 制NF—KB和TNF—a在血管纹,螺旋神经节和Corti 器的上调表达.从而对内耳功能起到保护作用,并且 在应用耳毒性药物之前使用NAC其效果明显优于 耳毒性损伤之后用药,因此在临床应用中也体现了 预防用药的重要性. [参考文献] r1]IKEDAK,SUNOSEH,TAKASAKAT.Effectsoffreerad—icalsontheintracellularcalciumconcentrationintheisolated outerhaircelloftheguineapigcochlear[J].ActaOtolaryn一 (下转第12页) 12青岛大学医学院46卷 密切相关,是判断肿瘤生物学行为及预后因素的重 要标志_6].E—Cad是钙黏附蛋白分子家族中跨膜 蛋白亚型的一种,主要存在于人和动物的上皮细胞, 对维护上皮细胞的形态和结构完整性起着重要作 用.E—Cad主要介导同型细胞的黏附功能,当其表 达下降或缺失时,同种细胞无法相互粘连,进一步使 细胞易于分散而向外周浸润,可导致肿瘤细胞侵袭 性生长与转移,这已在许多恶性肿瘤的研究中得到 证实.本研究结果显示,在CCV组织中SLeX 不表达,CD44v6仅表达于基底细胞和(或)内基底 细胞,阳性表达率为25.0;E—Cad均呈不同程度 阳性表达.在ICC组织中SLeX和CD44v6阳性表 达率均显着高于CCV,E—Cad阳性表达率则显着低 于CCV.随着ICC分化程度减低和淋巴结转移, SLeX和CD44v6阳性表达率显着增高,而ECad阳 性表达率则显着降低.表明SIeX和CD44v6表达 的上调和E-Cad表达的下调与ICC的发生密切相 关,并在ICC的细胞分化和转移过程中起重要的作 用.检测三者基因蛋白表达,不仅是研究ICC发生 发展的较可靠的重要标志物,而且对宫颈良恶性病 变辅助诊断,判断肿瘤恶性程度,生物学行为及病人 预后也是一个较可靠的,具有较大价值的参考指标. 本研究结果还显示,ICC组织中SIeX,CD44v6 和E—Cad表达之间有关.提示SLeX,CD44v6和E— Cad表达在ICC的发生,细胞增殖,分化和转移的病 理过程中具有相互诱导的调节或负调节的协同作 用.因此,深入探讨它们之间的作用及机制,将对阐 明或阻断肿瘤侵袭转移具有重要意义. [1] [2] [3] E43 [5] [6] [7] E8] [9] [参考文献] YAMAGUCHIA,GOIA,SEKIK.eta1.Clinicalsignifi— canceofcombinedimmunohistochemicaldetectionofCD44v andsialylLeXexpressionforcoloectalcancerpatientsunder— goingcurativeresection[J].Onclolgy,1998,55(5):400—403. DENBOERML,PIETERSR,KAZEMIERKM,eta1.Dif- ferentexpressionofglutathioneS—transferasealpha,muandpi inchildhoodacutelymphoblasticandmyeloidleukaemia[J]. BrJHaematol,1999,104(2):321327. 谷化平,尚培中,倪灿荣.SialylLewisX,CD44v6和E—cadhe— rin表达与肝细胞癌转移和预后的关系[J].中华普通外科杂 志,2003,18(1):109l】1. 谷化平,尚培中.CD44v6和PTEN蛋白表达与大肠癌浸澜转 移的关系[J].青岛大学医学院,2008,44(1):3-5. 柳盛,吕洪,丛书英.原发性肝细胞癌组织VEGF—C和CD44v6 表达及意义口].齐鲁医学杂志,2009,24(1):1-3. JOOM,LEEHK,KANGYK.ExpressionofE—cadherin, betacatenin,CD44sandCD44v6ingastricadenocarcinoma:re— lationshipwithlymphnodemetastasis[J].AnticancerRes, 2003,2(2B):1581—1589. KoKSAIT,OZCONF,KILICASLANI,eta1.Expression .fE—cadherininprostatecancerinforrnalin—fixed.paraffin-em— beddedtissues:correlationwithpocthologicalfeatures[J]. 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