【doc】SHH对体外培养的小鼠牙乳头间充质细胞增殖的影响

【doc】SHH对体外培养的小鼠牙乳头间充质细胞增殖的影响 SHH对体外培养的小鼠牙乳头间充质细胞 增殖的影响 ? 中国新医药?ChinaNewMedicine?2004年第3卷第3期? 第一手资料,通过对大规模病例的研究及使用专科的颌 面创伤评分软件,能向政府提供了创伤防治战略方面的 决策依据,有助于卫生行政当局从宏观角度组织安排急 救和医疗的战略部署,并对劳动保护,交通管理,治安管 理,保险赔付都有借鉴作用. 参考文献 [1]ChampionHCopesWS,SaccowJ,etaLThemajor traumaoutcomestudy:Establishingnationalnormsfortrauma care.JTrauma,1990,30:1356-1365 [2]OwenJr-,BolenbaucherRM’MooreMLTrauma regis臼ydatabasegacomparisonofdataabstraction,interpretation, andentryattwolevelItraun~centerxJTrauma,199~46(6): 11O-4 [3]中国人创伤数据库结构和管理系统 设计方案 关于薪酬设计方案通用技术作品设计方案停车场设计方案多媒体教室设计方案农贸市场设计方案 ,中国人创伤 数据库建设专家联席会议制定,2000.7.http’V/www.tranmachin~ org/base_ struct1.pdf [4]AssociationfortheAdvancementofAutomotive MedicincTheAbbreviatedInjuryScale1990Rev城onUpdate 98,DesPlaines,IL6001&USA [5]CannellHPatersonALoukotaMaxilloficialmjuries inmultiplyi玎juredpadenmBrJOralMaxillofacSurg1996;34 (4)’303-308 [6~JonesJM,RedmondAD.andTempletonJUsesand abusesofstatisticalmode~forevaluatingtraumaca豫JTrauma. 1995~1):89--93 [7]石照辉,封兴华,周树夏,颌面创伤严重度定量评分的研究, 口腔颌面外科杂志,2003,13(1):44-46 注:本课题系军队”十五”指令性课题资助项目(01LJD75) (作者单位:1第四军医大学口腔医学院710032 2西安电子科技大学710071) SHH对体外培养的小鼠牙乳头问充质细胞增殖的影响 TheeffectofSHHongrowthofculturedmouse dentalpapillaectomesenchymalcells 林媛吴补领陆群孙强韩骅 [文献标识码】A[文章编号】1726_9393(2004)03--0016-02 摘要目的观察SonicHedgehog对体外培养小鼠牙乳头阃克质细胞增 殖的影响.方法构建Shh真桉 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达栽体pCDNA3-Shh,脂 质体法转染COS7细胞,收集培养上清波.实验组加入转染 pCDNA3-Shh的培养上清液,对照组加入转染空栽体pCDNA3的培养 上清液, 培养72}l,MTT法检测Shh对体外培养的小鼠牙乳头间充质细胞增 殖的影响.结果Shh能促进体外培养的小鼠牙孔头间充质细胞增殖.结 论Shh促进牙孔头细胞增殖,参与牙胚发育. 关键词Shh小鼠牙乳头间充质细胞细胞增殖 AbstractAIMToobservetheeffectofShhongrowthofculturedmousedentalpapillaectomesenchymala[)P日cellinvinD. MethodsTwogroupsweredivide~themediumtransfectedbyplasmidpCDNA3-Shhasexperimentalgroups;themediumtransfected byplasmidpCDNA3ascontro1.TheeffeCtofS}ll1ongrowthofculturedDPEcellswereexaminedbyMTT.ResultsTheresults showedthatShhregulatesDPEcellsproliferationConclusionShhmayplayaroleintoothdevelopment. KeywordsSonicHedgehogmousedentalpapillaectomesenchymalcellscellgrowth Shh是Hedgehog(Hh)信号蛋白家族成员,在多器官 系统的正常发育过程中起关键作用,如底板,神经管的形 成,体节和肢体的极化等田.Shh信号途径在进化上高度 保守目,由Shh,2个跨膜受体Patched(Ptc)和Smoothed Smo且成的受体复合物,蛋白激酶A以及下游转录因子 Gli家族(Glil,Gli2,G1B)等组成.信号传导时,Shh和Ptc 结合,Ptc-Smo复合物解离,Smo进入胞内,激活下游的 转录因子Gli家族.Shh信号的靶基因可能包括:Ptc, Wnt,Bmp,Msx等.Shh可以调控上皮和间充质细胞的增 殖,作为上皮信号参与牙胚的发育.本文利用体外培养的 小鼠牙乳头问充质细胞观察Shh对其增殖的影响,以进 16 一 步探讨其在牙胚发育中的可能作用机制. 1材料和方法 1.1主要试剂和仪器:DMEM培养液(Gibco,美国), 胎牛血清(Hyclone,美国)’脂质体lipofectamine2000 (Gibco,美国),M11=1c华美生物工程公司),胰蛋白酶(华美生 物工程公司),限制性内切酶(TaKaRa),质粒小量提取 试剂盒,凝胶回收试剂盒(上海华舜公司). 1.2方弦 1.21构建Shh真核表达载体:克隆载体pMD18一 T_Sh取酶切后琼脂糖凝胶电泳,胶回收获得Shh全长, 与表达载体pCDNA3连接16~C2h,转化大肠杆菌XI,-l0 中国新医药?ChinaNewMedicine?2004年第3卷第3期? Go1随机挑取4个克隆,37?振荡培养,质粒小量提取 试剂盒提取质粒,用Bgln和BamH1分别进行酶切鉴 定,重组质粒命名为pCDNA3_slll1. l22实验分组:重组质粒pCDNA3--Shh,空载体 pCDNA3分别以脂质体法转染COS’/细胞,48ll收集培 养上清液,经SDs-PAGE和Westernblot检测S}Ill在 C0S7中表达.实验组加入转染pCDNA3-Shh的培养上 清液.对照组加人转染空载体pCDNA3的培养上清液. 1.2.3MTT法检测细胞增殖:取第4代小鼠牙乳头 细胞,以|xlOS/ml接种96孔板.每孔100,每组1O孔. lOOml/L胎牛血清的DMEM培养24}l后,换20ml/L胎 牛血清的DMEM培养24h,吸弃培养液分别加入实验组 和对照组的培养液,培养7PA,每孔加5mg/mlMTr 20,继续培养4h,弃去培养液,每孔加15qDMSO振 荡10min,酶联仪波长490nra测各孔A值,统计学处理. 2结果 2l重组质粒的鉴定:重组质粒pCDNA3-Shh用 BgllI和BamH1分别进行酶切鉴定,分析酶切图谱,克 隆2,3为正确克隆,与预期的完全一致(图1). l2345678910 (1-4:Bg11I酶切;5,6:DNAMarker.7-10:BamHI酶切) 图1pcDNAB-Shh重组质牡酶切鉴定 2.2M1rr检测: 如表1所示,实验组细胞增殖活性高于对照组(P< 0.05).即Shh可以促进小鼠牙乳头细胞的增殖. 3讨论 Hedgehog是一类在胚胎发育过程中起关键作用的 信号分子.它有3种不同的类型:Sonic~3hh),Indian(1hh)和 De日eh.1995年Tahin~ig克隆了人Shh编码区,其 编码氨基酸与鼠Shh氨基酸高度同源ez4%),Shh表达 于胎肝,肺,肾和小肠,而在成体组织未检测到其表达.陈 智等观察了Slll】及其受体Ptc在鼠帽状期磨牙的基因 表达.Shh在口腔上皮,内,外釉上皮,星网层阳性表达; 受体Ptel在内,外釉上皮,星网层以及牙乳头阳性表达, 认为Shh可能经自分泌或旁分泌途径作用于釉结以外 的上皮和间充质促进其增殖.本实验将重组表达的Shh 作用于体外培养的小鼠牙乳头间充质细胞.结果表明 Shh促进牙乳头细胞的增殖,提示Shh通过受体Ptcl途 径,促进细胞增殖,参与牙胚发育. 作为形态生成素,Shh参与耳,毛发,肺等多脏器组 织的发育.随着对Shh的深人研究,对其功能的认识不 在局限于胚胎发育.Enomotd~发现表达Shh的皮肤 成纤维细胞可以异位成骨(软骨),同时BMP2可以增强 Shh的促分化作用,而FGF2则抑制其作用.蹲研究 发现shb可以调节成年神经前体细胞的增殖;Artem匠 实Shh诱导神经上皮细胞分化,减少细胞粘附,并且这 一 双重作用包含不同的细胞机制.Sh}耀进造血前体细 胞的增殖.NogginMP4-抑制 pathwayineaAytoothdevdopmentCellMolBioL1999A5567 [3]林提.美朴领.陆群等.人牙胚Shh的基因克隆和序列分折, 牙体牙缱牙甩病学志2O0i3f儿)啦2 [4]MarigoP.obemnLeeS.ctatCloni~expression, andchromosomallocationofS哪andIHH=TwoHurnan HomologucsoftheDrosophilaSegmentPoladtyGene Hedgeho~Genomics,199528:44 [5]陈智.张霉.王忐峰等,Shh厦其受悼PtclPtc2在鼠帽状期 磨牙曲基圈表述.中华口腔医学杂志2003,38.93 [6]EnomotoNakamuraAlkaW~RetatHedgehog proteinssfimulamchondrog~niccelldiffcrentiationandcartilage formatior~JBoneMinerILcs.2000.15:1659 [7]hil,LKasparB,GageFetaI.SonicHedgehogregulates adultneurprogenitorproliferationinvitroandinvjvnN咖 neurosci,2003A~.I [8]ArtemJKev4~P_I.g:o]rla.ELetAdualrolefor Sonichedgehoginregula6ngadhesionanddifferentiationof neuroepithelialcelkDcvBin~003,261520 [9]8h帅jGMurdoch13,WuD,etSonichedgehog inducestheprolife~fionofprimitivehumanhematopoiedccells viaBMPrcgu]afio~Natlmmunol2001:172 (作者单位:1第四军医大学口腔医学院710032 2第四军医大学医学遗传学教研室)