孕妇外周血中胎儿DNA及瘦素含量与子痫前期发病的关系

孕妇外周血中胎儿DNA及瘦素含量与子痫前期发病的关系 孕妇外周血中胎儿DNA及瘦素含量与子痫 前期发病的关系 第43卷第4期 2007年8月 青岛大学医学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAEQINGDAOUNIVERSITATIS VoI.43,No.4 August2007 孕妇外周血中胎儿DNA及瘦素含量与子痫前期 发病的关系 于进.陶红.纪向虹,王雪梅 (青岛市市立医院产科,山东青岛266071) [摘要]目的探讨孕妇外周血中胎儿DNA及瘦素含量与子痫前期发病的关系.方法选择3O例子痫前 期孕妇为子痫前期组(其中轻度18例,重度12例),B超确定所妊娠的胎儿为男性,于孕2O周前,发病时,分娩后 6h抽取外周血;另选3O例正常孕妇为对照组,B超确定所妊娠的胎儿为男性,对应子痫前期组时间取血液标本. 采用荧光定量PCR及放射免疫方法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 孕妇外周血胎儿DNA浓度及瘦素水平.结果孕2O周及发病时胎儿 DNA浓度,轻度子痫前期较对照组明显升高,重度子痫前期较轻度者 明显升高(F一84.80,96.79,q—l1.37, 17.30,P<0.05);分娩后6h胎儿DNA浓度,子痫前期组较对照组明 显升高(,一18.65,P<0.05).子痫前期发病 时瘦素值,轻度子痫前期较对照组明显升高,重度子痫前期较轻度子 痫前期明显升高(F一26.46,q一19.23,21.24, P<0.05).子痫前期病人血液中胎儿DNA与瘦素水平呈正相关关 系(r一0.997,P<0.05).结论孕妇外周血 胎儿DNA及瘦素水平与子痫前期发病具有相关性. [关键词]子痫;DNA;瘦素 [中图分类号]R714.2[文献标识码]A[文章编 号]1672—4488(2007)04—0339—04 THEC0’l’ETOFFETALDNAANDLEl’ININMA’l’ERNALBLOOD:ITSRELATIONSHIPWITHPREECLAMPSIAyU JJN,TAOHoNG,JIXIANG-HONG,etal(DepartmentofObstetrics,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266071, China) [ABSTRACT]ObjectiveTostudytheconcentrationoffetalDNAandleptininmaternalbloodandtheirrelationshipwith preeclampsia.MethodsThirtygravidawithpreeclampsia,mild18andsevere12,wereenrolledinthisstudy.Thebloodwas takenataround20weeksofgestation,attheonset,andsixhoursafterparturitio n.And30normalgravidaservedascontrols, theirbloodwastakenaccordingly.AllofthistwogroupswereconfirmeduItrasonographicaIlytohaveamalefetus.FetalDNAand leptininallthepregnantwomenplasmaweremeasuredbyfluorescentquantitativepolymerasechainreaction(FQ-PCR)andradio— immunoassay(RIA).ResultsThefetalDNAlevelofthemildpatientsatabout20一weekgestationandatonsetwasremarkably higherthanthatthenormalcontrol,andthatofthesevereoneswashigherthanthatofthemildones(F=84.8O,96.79;口一 11.37—17.30;P<0.05).Atsixhoursafterdilivery,thefetalDNAlevelofthepatientswassignificantlyhigherthanthatofthe controlgroup(t:18.65,P<0.05).Duringtheattackofpreeclampsia,theleptinconcentrationwassignificantlyhigherthanthat ofthenormalcontrol,andthatoftheseverecaseswashigherthanthatofthemildones(F=26.46々=19.23,21.24;P<0.05).A positivecorrelativitywasobservedbetweenthefetalDNAandleptinconcentrationinthepatients(r=0.997,P<0.05).Con- clusionTheconcentrationoffetalDNAandleptininmaternalbloodcloselycorrelateswithpreeclampsia. LKEYWORDS~eclampsia;DNA;leptin 妊娠高血压综合症是妊娠期特有疾病,但其病 因至今尚未明确,而且对它的预测没有明确的指标. 子痫前期的主要病理学因素可能是由于滋养层不能 有效地侵入蜕膜和动脉管壁,导致胎盘缺陷,着床较 浅,致滋养细胞缺血低氧L】].而有研究 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 胎盘低 氧是胎盘瘦素合成增加的重要因素之一【2],因此子 痫前期孕妇外周血中瘦素水平可能增加.同时有研 究发现,子痫前期由于胎母界面的滋养层细胞受到 [收稿日期]2007—01—11;[修订日期]2007—03—10 [作者简介]于进(1975一),女,青岛大学医学院在读硕士研究 生,主治医师. 低氧的损害及母体免疫损伤,胎盘滋养细胞凋亡增 加而引起更多的胎儿游离DNA释放入血”].另 一 方面,负责清除母体血循环中胎儿DNA的主要 器官肝,肾等功能受损而清除减少],故有学者认为 子痫前期母血循环中胎儿DNA会有异常增高.本 研究旨在通过测定子痫前期病人发病前,发病时,分 娩后外周血中胎儿游离DNA及瘦素水平,探讨胎 儿DNA及瘦素含量与子痫前期发病的相关性. 1对象与方法 1.1对象 青岛大学医学院43卷 2003年9月,2004年9月,本院行围生期检查 的初次妊娠孕妇1963例,均于妊娠20周左右进行 平均动脉压测定,其中平均动脉压?11.3kPa者 338例,跟踪后发现有66例发展成为子痫前期,子 痫前期的诊断符合文献[1] 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 .选择B超确定所 妊娠胎儿为男性的孕妇30例为子痫前期组,其中轻 度子痫前期18例,重度子痫前期12例;年龄25, 35岁,平均28.3岁;分娩孕周27,41周,平均32 周.另选择B超确定所妊娠胎儿为男性的初次妊 娠正常孕妇30例作为对照组,年龄25,36岁,平均 27.8岁;分娩孕周28,4O周,平均32周.两组分 娩孕周,年龄差异无显着性. 1.2方法 1.2.1样本的准备在妊娠20周时,发病时,分娩 后6h,分别用抗凝管抽取孕妇外周血各3mL, 3000r/min离心10rain,吸取血浆置于灭菌的离 C,IJ,管中,于一80?保存待检.对照组于子痫前期 组相同时间抽取血标本. 1.2.2胎儿DNA提取采用德国Qiagen公司提 供的DNA提取试剂盒,按说明逐步操作. 1.2.3SRY基因的PCR引物使用Y染色体上 SRY位点对男性胎儿DNA进行定量,片段大小为 139bp,上游引物:5CGAAGATGCCGAAGAAT一3; 下游引物:5f_GGCGGTAAGTGGCCTAGCT一3. 1.2.4荧光定量一PCR检测用iCycler—IQ荧光定 量PCR仪检测.探针为5(FAM)CAGTTTC— CCGCAGATCCCG(TAMRA)一3.PCR试剂盒由中 山大学达安公司提供.PCR扩增条件:5×定量PCR buffer10L,上游引物F1L,下游引物R1L,dNTP 1L,荧光探针1L,Tag酶1L,DNA 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 5L, ddH2O30L,总体积50L.PCR循环条件为:93? 预变性2min,93?变性45s,60?退火60S,10个循环 后,93?变性30S,60?退火45S,30个循环.用已知 浓度的男性基因组DNA作为标准曲线,推算出所测样 本的浓度,即每毫升样本中的拷贝数. 1.2.5瘦素的检测瘦素测定采用放射免疫法,操 作按照试剂盒说明书,所用仪器为中国科技大学开 发研究院提供的GC-911全自动7计数器. 1.2.6统计学处理数据均采用SPSS10.0系统 软件进行处理.应用方差分析进行比较,数据分布 不符合方差齐性的要求,用t检验进行比较. 2结果 2.1两组孕妇不同时期外周血中胎儿游离DNA 水平的变化 孕20周及发病时胎儿DNA浓度,轻度子痫前 期组较对照组,重度子痫前期组较轻度子痫前期组 明显升高(F一84.80,96.79,q一11.37,17.30,P< 0.05);分娩后6h胎儿DNA浓度,子痫前期组较对 照组明显升高(,一18.65,P<0.05).见表1. 2.2子痫前期病人外周血瘦素水平与正常孕妇的 比较 子痫前期发病时外周血瘦素值,轻度子痫前期 组较对照组明显升高,重度子痫前期组较轻度子痫 前期组明显升高(F一26.46,q一19.23,21.24,P< 0.05).见表1. 表1子瘸前期组病人血中胎儿游离DNA及瘦素浓度 与正常孕妇的比较(r士) 分组 对照组30165.11士43.12319.22?98.8014.92--4-6.02 子病前期组3O52.1士15.3 轻度18265.85i78.63757.66士357.13 重度12396.32?90.511284.93?572.89 19.25?2.O1 26.12士2.25 2.3子痫前期病人外周血胎儿游离DNA浓度与 瘦素的相关性 子痫前期病人发病时外周血中胎儿游离DNA 与瘦素浓度呈正相关关系(rz0.997,P<0.05). 3讨论 3.1外周血胎儿游离DNA与子痫前期的关系 1979年,HERZENBERG利用流式细胞仪在母 体外周血中检测到胎儿细胞,并利用其进行产前诊 断.后又有学者利用免疫磁珠细胞分离系统和三度 梯度离心技术检测母血胎儿细胞,但由于母血中胎 儿细胞少,分离纯度不高,实验难度大及费用昂贵等 因素,故未能在临床推广.而有学者认为,在免疫学 上胚胎对于母体类似于肿瘤对于机体,将胎盘的部 分行为称为伪恶性,那么在母血中就可能存在胎儿 DNA.1997年,LO等首次证明孕妇外周血中存 在胎儿游离DNA. 目前认为孕妇外周血胎儿游离DNA存在有以 下几种可能的机制.?胎儿有核细胞通过胎盘屏障 渗透到母体血液中,被母体的免疫系统识别为异物, 并受到免疫攻击,致使细胞核膜溶解,DNA释放入 母血循环中_6].?胎儿组织在发育过程中自然凋 4期于进,陶红,纪向虹,等.孕妇外周血中胎儿DNA及瘦素含量与子 痈前期发病的关系341 亡,释放出的DNA经母体一胎儿界面进入母血循环 中.有证据表明循环胎儿DNA具有凋亡DNA片 段的一些特征,胎盘的细胞凋亡已经得到证实. ?胎儿DNA直接从胎儿组织中释放,经母体一胎儿 界面进入母血中. 近年来,许多学者对孕妇外周血胎儿DNA进 行了研究,发现子痫前期病人外周血胎儿DNA含 量明显高于同时期的正常妊娠妇女[3”],而且子痫 前期孕妇在有l临床症状和体征之前,外周血胎儿 DNA含量已经出现异常增高.本文研究结果也 显示,在妊娠2O周和发病时,轻度子痫前期病人外 周血胎儿DNA含量均较对照组明显升高,重度子 痫前期病人均较轻度者明显升高.说明子痫前期病 人,在出现临床症状和体征之前,外周血中胎儿 DNA含量已经出现变化,而且随着病情的加重而增 加.因此,外周血胎儿游离DNA含量的变化,对子 痫前期的预测和诊断具有临床应用价值. 胎儿游离DNA在子痫前期孕妇体内增加的现 象,可以使人们对子痫前期的发病机制有更深刻的 理解,由于胎母界面的滋养层细胞受到母体免疫损 伤,胎盘滋养细胞凋亡增加而引起更多的胎儿游离 DNA释放人血[3’],是胎盘发生异常改变的标志, 因此认为,胎盘异常很可能导致较多胎儿DNA释 放到母血中.而子痫前期孕妇肝,肾功能异常导致 胎儿DNA在母血中清除紊乱,也可造成母血中胎 儿DNA的量增多.因此,母体外周血中游离胎儿 DNA浓度可以用来预测子痫前期的发生及预后. 3.2外周血瘦素与子痫前期的关系 瘦素是一种由脂肪组织分泌的激素,它通过下 丘脑的受体而发挥减少人体对食物的摄人,使体质 量下降的作用,另外,瘦素也可以由子宫内膜,胎盘 及卵巢等外周组织合成分泌及发挥作用,妊娠妇女 血液中的瘦素可来自脂肪和胎盘[1,随着妊娠的进 展其血清水平逐渐下降至一定水平,产后恢复正常. 近年来关于子痫前期病人外周血中瘦素水平升 高的报道已很多.胎盘低氧是胎盘瘦素合成增加的 重要因素之一.由于胎盘合成瘦素增多,从而使子 痫病人外周血中瘦素水平明显增加,这与本研究结 果一致.产后瘦素水平的下降不仅是因为胎盘排 除,也因为促进脂肪细胞产生瘦素的激素及细胞因 子水平的下降,从而导致脂肪细胞产生瘦素减少. 但是LINNEMANN等[1通过一种体外双闭环灌 流胎盘的方法证明,胎盘产生的瘦素只占血浆瘦素 的14,并指出单独胎盘和脂肪或两者合并都不能 完全解释妊娠期血浆瘦素的明显升高及产后的急剧 下降.因此,关于正常妊娠孕妇及子痫前期病人外 周血瘦素的来源还需要进一步的研究. 3.3母体外周血中胎儿游离DNA含量与瘦素的 相关性 本研究显示,子痫前期病人血液中的胎儿DNA 含量和瘦素浓度均明显高于对照组,子痫前期胎儿 游离DNA升高与胎盘滋养层细胞功能失调有关, 同时由于胎盘低氧,功能失调,又使瘦素水平升高, 两者浓度升高均与胎盘功能异常有关,而且子痫前 期病人外周血中胎儿游离DNA含量与瘦素浓度呈 正相关关系.而瘦素与胎儿游离DNA在分子生物 学水平上是否有相互作用,还有待于进一步研究. [参考文献] [1]乐杰.妇产科学[M].第6版.北京:人民卫生出版社,2004: 97—1O6. 1,23GROSFELDA,ANDREJ,MOUZONSH,eta1.Transcrip— tionaleffectofhypoxiaonplacentalleptin[J].FEBSLett, 2002,277(45):42953-42957 [3]ISHIHARAN,MATSUOH,MURAKOSHIH,eta1.In— creasedapoptoslsinthesyncytiotrophoblastinhumanternpla centascomplicatedbyeitherpreeclampsiaorintrauterine growthretardation1’J].AmJObstetGynecol,2002,186(1): 158—166. E4]SEKIZAWAA,JIMBOM,SAITOH,eta1.Apoptosisinfe— talnucleatederythrocytescirculatinginmaternalblood[J]. 484. PrenatDiagn,2003,188(2):480— 1-53LAuTw,LEUNGTN.CHANLY.eta1.FetalDNA clearancefrommaternalplasmaisimpairedinpreeclampsia I-J].ClinChem,2002,48(12):2141—2146. [63LOYMD,CORBETTAN,CHAMBERIAINPF,eta1. PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum1’J].Lan cet,1997,350:485—487. 1,73SMITHSC,BAKERPN,SYMONDSEM.Placentalapop tosisinnormalhumanpregnancyI-J].AmJObstetGynecol, 1997,177:5765. 1,83BIANCHIDW.FetalDNAinmaternalplasma:theplot thickensandtheplacentalbarrierthina[J].AmJHumGenet, 1998,62:763—764. 1-9]SIMDM,VASSALLOA,LAGONAF,eta1.Quantitativea nalysisoffetalDNAinmaternalplasmainpathologicalcondi— tionsassociatedwithplacentalabnormalities1’J].AnnNyacad Sci,2001,945:132—137. [1O]FARINAA,SEKIZAWAA,SUGITOY,eta1.FetalDNA inmaternalplasmaasascreeningvariableforpreeclampsia1’J~. Pr口tDi口gH,2004,24(2):83—86.(下转第344页) 青岛大学医学院43卷 但HHK在桥接PN神经缺损后对机体免疫影响, 尚缺乏完整的动物实验依据,限制了其进一步应用 到临床修复PN缺损. 3.2本实验设计的科学性和可靠性 本实验用人发角蛋白人工神经桥接大白鼠胫神 经缺损,进行免疫学研究,并与自体神经和异体神经 相对照, 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 其组织相容性.机体全身免疫分为体 液免疫和细胞免疫,免疫球蛋白IgA,IgM,IgG和补 体c.,c在血液中含量较高,在机体的体液免疫中 起着重要作用.CD[代表T辅助细胞,CDs+代表 T抑制细胞,CD+/CD~-比值的变化可以判断细胞 免疫功能,反映免疫调节功能变化.T细胞转化试 验主要用于体外检测T细胞的生物学功能,反映机 体的细胞免疫水平. 坐骨神经是建立PN损伤与修复的良好实验模 型,常用的方法是切断坐骨神经主干.以往实验中 发现,切断坐骨神经主干后,同时切断了前往其所支 配的组织器官的神经纤维,远端的大部分肢体失去 了神经营养和皮肤感觉.术后远端肢体陆续出现皮 肤溃疡,部分用来实验的大白鼠甚至自食或相互咬 掉实验侧肢体,使实验失败.而且经久不愈的肢体 溃疡也严重影响实验材料检测的准确性,尤其对体 液免疫和细胞免疫指标检测会产生偏差,影响实验 数据的准确性.本实验显示成年大白鼠胫神经由坐 骨神经分出至远端分叉处长度超过15rnm,解剖清 晰,和腓总神经比较形态差别明显,易于辨认,切断 坐骨神经分出的胫神经可以完全阻断腓肠肌的神经 支配,最大限度地保存肢体其他组织的神经营养和 皮肤感觉,尽可能避免大白鼠出现肢体溃疡及撕咬 肢体现象,保证实验模型建立的成功.同时,术后早 期预防性应用一次抗生素,可防止切口感染,提高了 实验数据的准确性. 3.3人发角蛋白人工神经良好的组织相容性 植入物进入机体后,血液免疫球蛋白,C.,C, CD+/CD及T淋巴细胞转化率水平升高,往往提 示发生排斥反应.本实验结果显示,术后2,8,16周 各组大鼠免疫球蛋白IgA,IgM,IgG及补体Cs,C 检测结果比较,A,B两组间差别均无显着意义(P> 0.05),C组与A,B两组的差别均有极显着意义(P< 0.01).各项免疫指标水平A组与B组相近,而C 组各项指标均明显高于A,B两组.A,B两组各项 免疫指标术后2周处于略高水平,这可能与手术损 伤有关,术后8,16周,随着时间延长逐渐下降,而C 组各项免疫指标虽在术后2周或8周后亦有下降趋 势,但一直持续在较高水平.本实验结果表明,人发 角蛋白人工神经桥接大鼠胫神经缺损后,无论体液 免疫指标还是细胞免疫指标,人发角蛋白人工神经 与自体神经移植相似,对大鼠免疫影响小,无明显排 斥反应,明显优于异体神经移植.因此我们认为,人 发角蛋白人工神经对机体抗原性小,具有良好的组 织相容性,是修复PN缺损较为理想的桥接材料,将 有良好的临床应用前景. [参考文献] [1]胡庆柳,朴英杰,邹飞.人发角蛋白导管修复周围神经缺损的 实验研究EJ].第一军医大学,2002,22(9):784787. E23武雷,罗艳芬,刘小静,等.人发角蛋白桥接周围神经缺损后的 组织相容性和降解性的实验研究[J].中华创伤骨科杂志, 2005,7(5):452-455. E3]邹云雯,夏精武,季爱玉,等.人发角蛋白人工腱的I临床应用 EJ].青岛医学院,1997,33(3):197. E4]邹云雯,王志杰,季爱玉,等.人发角蛋白人工肌腱的免疫学研 究及I临床应用的初步结果[J].中华手外科杂志,1999,15(4): 208—21l_ Es]MILLESIH.NervegraftingEJ].ClinPlastSurg,1984,11 113. (1):105— [63FLORESAJ,LAVERNIACJ,OWENSPW.Anatomyand physiologyofperipheralnerveinjuryandrepair[J].AmJOr— thop,2000,29(3):i67. [7]FAwETTJW,KEYNESRJ.Musclebasallamine:anew graftmaterialforperipheralnerverepair[J].JNeurosurg, 1986,65:354-357. (本文编辑马伟平) (上接第341页) [11]TAEN,LEUNG,ZHANGJ,eta1.Increasedmaternalplas, mafetalDNAconcentrationsinwomenwhoeventuallydevelop preeelampsia[J].ClinChen,2001,47(1):137—139. [123SEKIZAWAA,JIMBOM,SAITOH,eta1.Cell—freefetal DNAintheplasmaofpregnantwomenwithseverefetal growthrestriction[J].AmJObstetGynecol,2003,188(2): d80—484 [13]詹瑛,齐卫红,陈维萍,等.早期自然流产病人血清,胎盘绒毛 和蜕膜组织中瘦素水平的测定[J].青岛大学医学院, 2006,42:350—353. [14]LINNEMANNK,MAIEKA,SAGERR,eta1.Physiologi— ealandpathologicalregulationoffeto/placento/maternalleptin expression[J].BiochemSocTrans,2000,85(11):4298— 4301. (本文编辑马伟平)