临床医学论文-孕妇血浆中胎儿游离DNA及抗DNA抗体与子痫前期的相关性研究

临床医学论文-孕妇血浆中胎儿游离DNA及抗DNA抗体与子痫前期的相关性研究 临床医学论文-孕妇血浆中胎儿游离DNA及抗DNA抗体与子 痫前期的相关性研究 作者:朱鸣 李武 吕火祥 金卫东 【摘要】 目的 探讨孕妇血浆中胎儿游离DNA及抗DNA抗体与子痫前期的 相关性。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 以Y染色体上性别决定基因:SRY基因:为基因标志, 采用荧光 定量PCR技术 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 分娩后证实为男婴的34例子痫前期孕妇:观察组:和42例正 常孕妇:对照组:血浆中胎儿游离DNA:fDNA:水平,采用ELISA法检测抗ss-DNA 及抗ds-DNA抗体水平。 结果 观察组fDNA水平为:233.69?125.49:,对照组 为:67.83?43.70:,两组比较,差异有统计学意义:P<0.01:。观察组抗ss-DNA 抗体水平为:0.110?0.141:,对照组为:0.067?0.074:,两组比较,差异有统 计学意义:P<0.05:。观察组抗ds-DNA抗体水平为:0.0267?0.0105:,对照组 为:0.0230?0.0102:,两组比较,无统计学意义:P>0.05:。fDNA与抗ss-DNA 抗体无相关性:r=0.1275,P>0.05:,与抗ds-DNA抗体无相关性:r=0.245,P>0.05:。 结论 监测孕妇血浆fDNA变化可作为预测子痫前期及诊断病情程度的一个指标。 fDNA升高并非由抗DNA抗体所致。 【关键词】 DNA 抗DNA抗体 子痫前期 【Abstract】 Objective To explore the relationship of fDNA and antiDNA antibody in pregnant women with preeclampsia. Methods SRY gene is used as gene marker. Thirty-four cases of pregnant women with preeclampsia and forty-two cases normal pregnant women were selected. Both groups delivered male babies. The fDNA level in the plasma of the women were quantitated by PCR. Antibody levels of ss-DNA and ds-DNA were detected by ELISA. Result Mean fDNA level in test groups (233.69? 125.49)was significantly higher than that (67.83?43.70)in control group (p<0.01); Plasma level of antiss-DNA antibody levels in test group (0.110?0.141) was significantly higher than that (0.067?0.074) in control group (p<0.05); however, plasma level of antids-DNA antibody had no significant difference (P>0.05). No correralation was found between fetal DNA levels and antiss-DNA antibody or antids-DNA antibody in preelampsia group (r=0.1275,P>0.05). Conclusion Detection of the variation of fDNA in the plasma of the pregnant women may help to forecast and diagnose preeclampsia, the rise of fDNA is not caused by antiDNA antibody. 【Key words】DNA AntiDNA antibody Preeclampsia 妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病,是导致孕妇和围生儿死亡的主要原 因,目前其病因及发病机制仍未明确。近年来研究发现孕妇血浆中存在着胎儿游 离DNA,妊娠合并子痫前期妇女血浆中胎儿游离DNA含量明显增高,且与疾病的 严重程度相关。本研究采用荧光定量聚合酶链反应:PCR:方法对不同程度妊娠 期高血压疾病患者外周血浆进行SRY基因检测,以探讨孕妇血浆中胎儿游离DNA 与妊娠期高血压疾病的关系,现将结果报道如下。 1 临床资料 1.1 一般资料 2005年5月至2006年11月在本院妇产科行产前检查并分娩后证实为男婴的孕妇共1359例,选取子痫前期34例为观察组,平均年龄:29.23?5.49:岁,平均孕周:36.09?3.73:周,正常妊娠42例为对照组,平均年龄:27.21?3.52:岁,平均孕周:38.95?1.55:周。两组患者既往无心、肺、肝、肾等疾病史,无高血压病史,无免疫系统疾病。子痫前期的诊断及分类 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 以《妇产科学》:第6版:为准。 1.2 方法 (1)标本采集:在分娩前,入院当天用抗凝管采取两组孕妇外周静脉血各3ml,血样本3000r/min离心,离心后血浆移入无菌管中,-80?保存,待分娩后证实为男婴集中检测。(2)DNA提取:DNA提取采用TaKaRa Blood Genme DNA Extractoin Kit(宝生生物工程有限公司,中国)提供的DNA提取试剂,从血浆中提取胎儿DNA,操作步骤按 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 书进行。(3)性别决定基因:SRY:PCR引物设计:使用Y染色体上的SRY位点对男性胎儿DNA进行定量,正向引物5,-GCGACCATGAACGCATT-3’,反向引物5,-GCCATCTTGCGCCTCTGAT-3’,一个双标Taq Man-MGB 荧光探针为5’-:FAM:ATCGTGTGGGTCTGAT:TAMRA:-3’:以上物质均由基康公司合成:。(4)FQ-PCR定量胎儿DNA:PCR扩增反应体系采用Tag Man PCR 有Core Reagent Kit。反应体系总体积18μl,Taq Man PCR Mix:9μl,探针:10μm::0.45μl,正向引物:20μm::0.81μl,反向引物:20μl::0.81μl,去离子水:0.93μl。制备SRY基因DNA标准管5.0×10、5.0×102、5.0×103、5.0×104copies/ml,取样本及标准管各6μl加入到已加有反应液的扩增管加盖,2000rpm离心20s使混 匀。在Light Cycler扩增仪上按以下程序进行扩增及计算样本中DNA的量:50? 3min;95? 10min:(95? 10s,60? 30s)循环45次,37?5s。在60?时收集荧光信号,方式为“Single”,通道为F1。本试验最低检测限为10copies/ml。(5)抗ss-DNA抗体及抗ds-DNA抗体定量:抗ss-DNA及抗ds-DNA抗体的定量均采用德国欧蒙ELISASHA试剂盒,在BIO-RAD酶标仪上进行吸光度检测,检测波长为450nm,严格按照实际 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 操作。 1.3 统计学方法 原始数据用SAS 8.1统计软件处理,数据呈正态分布时比较用t检验,非正态分布时采用Wilcoxon符号秩和检验。 2 结果 2.1 两组孕妇外周血中胎儿游离DNA水平比较 观察组孕妇外周血中胎儿游离DNA水平明显高于对照组,有统计学意义:P<0.01:,不同程度子痫前期患者孕妇血中胎儿游离DNA水平分别与对照组比较有统计学意义:P<0.01:。见表,。 2.2 两组孕妇抗ss-DNA及抗ds-DNA抗体比较 子痫前期组孕妇血浆抗ss-DNA抗体与对照组比较有统计学意义:P<0.05:。观察组孕妇血浆抗ds-DNA抗体与对照组比较,无统计学意义:P>0.05:。见表,。表1 各组孕妇血浆中胎儿游离DNA水平和抗ss-DNA及抗ds-DNA抗体水平比较:略: 2.3 孕妇血浆中胎儿游离DNA与抗ss-DNA及抗ds-DNA抗体的相关性 观察组孕母血浆中胎儿游离DNA与抗ss-DNA抗体无明显相关性:r=0.1275,P>0.05:,与抗ds-DNA抗体也无显著相关性:r=0.245,p>0.05:。抗ss-DNA与抗ds-DNA抗体呈正相关关系:r=0.5983,P<0.05:。 2.4 母血中胎儿游离DNA与胎儿体重的相关性 观察组孕母血中胎儿游离DNA与胎儿体重无明显相关性:R=-0.06618,P>0.05:,对照组孕母血中胎儿游离DNA与胎儿体重亦无相关性:R=0.07694,P>0.05:。观察组孕母血中抗ss-DNA抗体与胎儿体重无相关性:R=0.12010,P>0.05:,对照组孕母血中抗ss-DNA抗体与胎儿体重亦无相关性:R=-0.03790,P>0.05:。观察组孕母血中抗ds-DNA抗体与胎儿体重无相关性:R=-0.05610,P>0.05:,对照组孕母血中抗ds-DNA抗体与胎儿体重亦无相关性:R=-0.11638,P>0.05:。 3 讨论 3.1 胎儿游离DNA与妊娠期高血压疾病的关系 孕妇血浆中胎儿游离DNA被认为主要有3种组织来源:(1)胎儿造血细胞:进入母体的胎儿有核细胞发生凋亡释放出游离DNA。但Hristokova等观察到只是少部分游离DNA来源于这些有核细胞,,,。:,:胎儿DNA直接转移:有研究表明在母体脑脊液、尿和羊水中可发现胎儿游离DNA,,,。胎儿DNA分子可直接穿越胎盘屏障进入母体血循环也已得到证实,但此来源的游离DNA含量可能 也较少。(3)胎盘。Guibert等研究发现怀双胎的孕妇在胚胎移植后18d,而单胎22d起血浆即测到男性胎儿的SRY基因。胎儿胎盘循环在受孕后28,30d才建立,提示胎儿游离DNA主要组织来源不是造血细胞,而可能是滋养细胞,,,。 许多研究显示,发生子痫前期和最终发展为子痫的孕妇血浆血清标本中胎儿游离DNA的量均增加,,,。Zhong等,,,发现妊娠合并先兆子痫妇女血浆中胎儿DNA的定量均为正常妊娠妇女的10倍,同时先兆子痫妇女血浆总DNA定量较正常妊娠妇女也增高了10倍,而这种增高是与疾病的严重程度相关。Lo等,,,发现先兆子痫孕妇血浆胎儿游离DNA比正常孕妇增加5倍,当出现HELLP综合征时游离胎儿DNA比先兆子痫再增加4.3倍。本研究结果显示:子痫前期和子痫患者血浆中胎儿游离DNA水平明显高于正常妊娠妇女4倍,且随着病情的加重DNA水平逐渐升高,本组结果与国外的研究结果相一致,均证明了胎儿游离DNA与子痫前期的发病及病情程度有关。 子痫前期患者由于胎母界面的滋养细胞受到母体免疫损伤,胎盘滋养细胞凋亡增加而引起更多的胎儿游离DNA释放入血,,,,,,随着病情的进展,由于氧化应激反应,使毒性物质释放,血管内皮细胞受损或激活,引起全身病理变化,肝、肾等器管受损,使DNA的清除率下降,从而使母血中胎儿游离DNA进一步增加。Lau等,,,发现子痫前期妇女血浆中胎儿游离DNA的半衰期为114min,而对照组为28min。Levine等,,,,报告先兆子痫胎儿游离DNA浓度的升高发生在妊娠的两个阶段,17,28W和29,41W。反应了第一阶段胎盘的坏死和凋亡及第二阶段DNA的清除障碍。研究表明早在妊娠17周胎儿游离DNA水平在患病组 就显著高于对照组,在症状出现前3周患病胎儿游离DNA出现第二阶段的升高。因此通过胎儿游离DNA测定不仅可筛查子痫前期,也可预示病情的发展程度。 3.2 母血中胎儿游离DNA与抗ss,DNA抗体及抗ds,DNA抗体的相关性 妊娠是一种成功的半同种移植现象,其成功有赖于母体妊娠免疫耐受。大量的研究发现子痫患者的螺旋小动脉可见急性粥样硬化和纤维素样环死,血管壁上可见明显的免球蛋白(IgM)和补体(C3)沉积,,,,,血液循环中自然杀伤:NK:细胞,中性粒细胞以及白细胞介素:IL:2、6、12及肿瘤坏死因子等均增加,Th1/Th2平衡失调,Th1介导的细胞免疫增强。这均表明在母—胎界面存着免疫失平衡、免疫损伤现象。本研究发现在子痫前期患者中血中抗ss-DNA抗体含量较正常组明显增加,有显著性差异:P<0.01:,表明抗ss-DNA抗体与子痫前期有关。抗ds-DNA抗体与正常对照组无显著性差异:P>0.05:,表明抗ds-DNA抗体与子痫前期无关。但本研究发现抗ss-DNA抗体与胎儿游离DNA之间无明显的相关性:P>0.05:,本结果揭示子痫前期患者中胎儿DNA水平升高并非由母体血中的抗DNA抗体引起胎盘释放DNA增多所致,这与Hristoskova等的观点相一致,12,。有研究证实外源性的DNA能诱导小鼠产生抗DNA抗体,并检测到IgG、补体C3在肾脏局部的沉积,,,,,证明外源性DNA能够诱导宿主免疫系统异常,产生高滴度的抗DNA抗体。胎儿游离DNA作为一种同种异体抗源,也能诱导母体产生相应的抗体。因此作者认为,子痫前期患者母体血中抗ss-DNA抗体的升高可能是由于循环血中胎儿游离DNA增高刺激母体产生相应的抗体,而胎儿游离DNA增高可能与上述病理所揭示的胎母免疫平衡和免疫耐受失调,胎盘浅着床, 滋养细胞凋亡增加和DNA清除率下降有关。孕妇血中游离胎儿DNA与免疫因素的 相关性有待于进一步研究与探讨。 【参考文献】 1 Zhong XY, Holzgreve W, Hahn S. 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