冠突散囊菌有性孢子发育基因veAcDNA片段的克隆

冠突散囊菌有性孢子发育基因veAcDNA片段的克隆 () [ 文章编号 ]100123601 2011032014720025203 冠突散囊菌有性孢子发育基因 veA cD NA 片段的克隆 12 2 2 3马 权, 刘永翔, 刘作易 ()1 . 贵州大学 生命科学学院 , 贵州 贵阳 550025 ; 2 . 贵州省农业生物技术重点实验室 , 贵州 贵阳 550006 [ 摘 要 ] 为从冠突散囊菌中克隆到与有性发育相关的 v eA 基因片段 ,根据 ge nba nk 中不同种真菌的 v eA 相关蛋白质序列同源性 ,设计简并引物 ,运用 to uchdo w n PCR 技术 ,研究了从冠突散囊菌总 RN A 中克 隆有性孢子发育基因 v eA cDN A 片段 。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 :克隆得到长度为 558 p b 的 cDN A 片段 。该 cDN A 片段与 棒曲霉 v eA 基因相似性最高 ,为 77 % ;与构巢曲霉 v eA 相似性 67 % 。确定为冠突散囊菌 v eA 基因片段 。 [ 关键词 ] 冠突散囊菌 ; v eA ; to uchdo w n PCR + 文献标识码 ] A[ [ 中图分类号 ] S432 . 4 4 Clo ning of veA cDNA Fra gme nt Relat e d to Se xual Spo re De velop me nt in Eurotium cri st atum 1 2 2 3MA Q ua n, L IU Yo ng2xia ng, L IU Zuo2yi ( 1 . Col le ge o f L i f e Scie nces , Guiz hou U nive rsi t y , Gui y a n g , Guiz hou 550025 ; 2 . Guiz hou Ke y L a bo r a t or y )f o r A g r ic ul t u r a l Bi ot ec h nol og y , Gui ya n g , Guiz hou 550006 , Chi n a Abstract : The v eA cDN A f ra gme nt relat ed to se xual spo re develop me nt i n Euro ti um cri st at u m wa s succe ssf ull y clo ned acco r di ng to t he seque nce ho molo go u s of v eA relative p ro t ei n s i n va rio u s f u ngi f ro m Ge nba nk . The re sult s sho we d t hat t he si mila rit y bet wee n t he clo ned cDN A f ra gme nt wit h 558p b a nd v eA of A s p e r g i l l us cl a v at us a nd A s p e r g i l l us ni d u l a ns reac he d 77 % a nd 67 % re sp ectivel y , w hich i ndicat e s t hat t he clo ned cDN A f ra gme nt wit h 558p b i s t he veA f ra gme nt of E u rot i u m c ris t at u m . Key words : E u rot i u m c ris t at u m ; v eA ; to uchdo w n PCR [ 6 ] , v eA 基因参与了许多细胞活动 级代谢产物的合成与孢子发育具有相关性。预示在真菌细胞中 着 v eA 基因在这两个生物过程中起总调节作用 。 的调节 ,如有性和无性发育的调节 ,次级代谢产物的 ( ) 冠突散囊菌 E u rot i u m c ris t at u m 是茯砖茶加 调控等 。50 多 年 前 , E. Kf e r 首 先 获 得 构 巢 曲 霉 a ( ) 工“发花”过程中的微生物优势菌 ,俗称“金花”。茯A s p e r g i l l us ni d u l a ns 的 v eA 突变株 ,将其突变基 因命名为 v eA 1 。然而 , VeA 蛋 白与 任何 其他 已 知 砖茶加工中的“发花”过程是形成茯砖茶独特品质的 关键工艺 “, 金花”的质量和数量被用来判断茯砖茶 功能的蛋白不具有同源性 ,阻碍对 v eA 基因的深入 [ 7 ] 认识 。直到 1981 年 ,Cha mp e , S. P 等认识到构巢曲 品质优劣 ,作为品质特征的标志。该菌无性型属 ( ) 曲霉属 ,称为小冠曲霉 A s p e r g i l us c ris t atel l us ,为 霉 V eA 蛋白在激活有性发育的同时 ,能够抑制无性 [ 8 ] [ 1 ] 同宗配合菌。有研究表明 ,冠突散囊菌在低渗透 发育。2002 年 , Ki m 和其合作者通过使用构巢曲 压诱导下产生有性孢子 。在高渗透压诱导下产生无 霉 v eA 的缺失突变和过量表达的方法对 v eA 基因 [ 9 ] 性孢子。为使用冠突散囊菌研究孢子发育提供了 在发育中的功能进行了进一步的研究表明 , v eA 的 [ 2 ] 良好的 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 。 Ki m等研究表明 , v eA 基 因 在产 孢 缺失突变体不会产生子囊果 ,即使是在适合于野生 之前开始表达 ,在产孢时丰度最高 。据此 ,为了获得 型产生子囊果的条件下 ,其缺失突变株也不会产生 。 某一时期表达的丰度较高的 RN A ,笔者首先采用液 相反的是 , 当 v eA 基因过量表达时 , 有性结构的产 体培养方法抑制生长的菌丝产孢 ,待其生长到足够 生会增加同时伴随分生孢子产生量的减少 ,进一步 量后固体培养诱导产生子囊果及子囊孢子 ,在诱导 说明在构巢曲霉里 , v eA 基因能正调节有性孢子的[ 2 ] 产孢 16 h 左右开始收集菌丝提取 RN A 。收集足量 ( 发育 , 同 时 抑 制 无 性 孢 子 发 育。在 黄 曲 霉 A s2 的与产孢相关特定时期的 RN A 并开展进一步的研 ) p e r g i l l us f a v us同样也发现 , v eA 基因对有性发育 [ 3 ] [ 4 ] 究 ,对冠突散囊菌甚至曲霉属的有性产孢机理的研 的正调节 作用。然而 , Cal vo 等却 发 现 寄 生 曲 究奠定了一定的基础 。 霉 v eA 基因的突变株的无性孢子产生量减少 。尽 管 v eA 基因在不同种中的调节作用有差异 ,可以肯 材料与方法1 定的是该基因参与了真菌孢子的发育过程 。除此之 材料 外 ,在产真菌毒素和抗生素的真菌中 , v eA 基因还参 1 . 1 [ 325 ] ( 1 . 1 . 1 冠突散囊菌 冠突散囊菌 E u rot i u m c ris2 与了这些次级代谢产物的合成。有研究表明 ,次 211215 ; 2011201216 修回 2010[ 收稿日期 ] ( ) 贵州省农业科学院研究生科研创新基金项目“渗透压诱导的冠突散囊菌产孢相关基因研究”[ 黔农科合 创新基金09001 ] [ 基金项目 ] ( ) 马 权 1984 - ,男 ,在读硕士 ,研究方向 :真菌分子生物学 。E2mail : gzdx mq @163 . co m [ 作者简介 ] ( ) 3 通讯作者 : 刘作易 1959 - ,男 ,教授 ,从事真菌学和抗病毒转基因研究 。E2mail : li uzuo yi @ya hoo . co m. cn ) t at u m ,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心 ,编 号为 6088 。 1 . 1 . 2 试 剂 cDN A 第 一 链 合 成 试 剂 盒 , 购 于 ( ) IB M Rever t Ai d Fi r st St ra nd Cdna Synt he si s Kit ; ( ) RN A 提 取 试 剂 盒 RN Ai so Pl u s 和 p MD182T 载 体 ,购买于大连宝生物公司 ; 胶回收试剂盒 ,购于北 京三博明志生物公司 ;引物合成 ,由上海捷瑞生物工 程有限公司完成 。 1 . 2 方法 冠突散囊菌菌丝培养及诱导产孢 所用培1 . 2 . 1 养基为麦芽浸膏蔗糖培养基 。具体配方 : 麦芽浸膏 20 g ,蔗糖 30 g ,酵母浸膏 5 g 。固体培养基加 12 g 琼 脂粉 。将 孢 子 悬 液 接 种 于 液 体 培 养 基 中 , 220 r/ mi n ,27 ?摇菌培养 5,6 d 。收集菌丝接种于固体培 养基培养 16 h 时左右 ,诱导产孢 。收集菌丝备用 。 1 . 2 . 2 RN A 提取 RN A 提取按照大连宝生物公 司 RN Ai so Pl u s 试剂盒提供的步骤进行 。 cDN A 第一链合成 cDN A 第一链合成按 1 . 2 . 3 μ 照试剂盒进行 : 在 micro t u be 中加入总 RN A 3L 、 μμ( ) Oli go d T18 Pri mer 1L 、D EPC2t ra de wat er 8L 。PCR 仪上 65 ?孵 育 5 mi n 立 即置 冰上 急 冷 。再 在 上 述 micro t ube 中 按 顺 序 加 入 下 列 试 剂 : 5 ×R T B μμuff er 4L 、dN T P Mi x 2L 、RNa se In hi bito r μμ 1L 、Reve r t Ai d M M2R Ta se 1L 。反 应 程 序 : 30 ?,10 mi n ;42 ?,60 mi n ;70 ?,5 mi n ;8 ?保存 。 1 . 2 . 4 冠 突 散 囊 菌 v eA 基 因 保 守 区 克 隆 克 隆 2 . 2 冠突散囊菌 veA 基因 cD NA 片段 RT2PCR 扩 v eA 保守区采用简并引物序列为 : se n se Pri mer : GA 增 ( ) ( ) ( ) ( ) C/ TC GT/ CC GICC I GT T/ CGA T/ C,a nti2 从图 2 看出 ,泳道上方出现了 1 条较亮的特异 ( ) se n se Pri me r : CCIC GIC GTC TCA T G/ A/ C C G ( ) 性条 带 , 大 小 约 550 与 设 计 引 物 时 的 预 测 值 ( ) ( ) ( μ) C/ G/ AA C A/ CT 。反 应 体系 25L : 2 ×Ta g () 560 bp 相符合 , 下方较为模糊的条 带为 非 特异 性 μμPCR Ma st er Mi x 12 . 5L , 引 物 各 1 . 5L 。cDN A 条带 。从整个图像看 ,条带的出现符合 to uc hdo w n μμ 模 L 板 3L , dd HO 6 . 5L 。反 应 程 序 : 94 ?2 PCR 特性 。3 mi n ,94 ?30 s , 67 ?30 s , 67 ?30 s , 72 ?1 mi n 。以 2 . 3 特异性片段的克隆测序后每个循环退火温度降低 1 ?,直到最低退火温度 将特异性片段克隆到 p MD182T 载体 , 转化 大 52 ?。在此温度反应 20 个循环 。α肠杆菌感受态细胞 D H5,经菌落 PCR 检测确认获 1 . 2 . 5 冠突散囊菌 v eA 基因 cDN A 片度 R T2PCR 得重组质粒 。从图 3 看出 ,1 号 、2 号 、4 号 、5 号菌落 扩增 以总 RN A 为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ,按 IB M 公司反转录试剂 检测出与特异条 带 大小 相符 的 条带 。挑取 1 号 、4 盒提供的步骤进行逆转录反应 ,获得 cDN A 。以此 α 号对应的大肠杆菌 D H5摇培养 ,送样测序 。 为模 板 , 用 v eA 基 因 简 并 引 物 , 采 用 to uch do w n PCR 技术扩增特异片段 。将特异性条带胶回收 ,用 于克隆测序 。 1 . 2 . 6 克 隆 测 序 将 PCR 产物胶回收后克隆到 pMD182T 载体后测序 ,测序由北京诺赛生物公司完成 。 2 结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2 . 1 冠突散囊菌总 RNA 提取 从图 1 看出 ,有 3 条完整的条带出现 ,从上到下 分别为 28 S 、18 S 、5 . 8 S 。其中 , 28 S 和 18 S 对应的 条带清晰完整 ,且 28 S 的亮度约为 18 S 的 2 倍 。因 图 3 菌落 PCR 检测结果 Fig. 3 The detectio n result of colo nial PCR 此 ,提取的总 RN A 样品符合后续工作要求 。 注 : 黑色为高度同源 ,灰色为部分同源 。 No t e : Black , highl y ho molo gy ; Gray ,p artial ho molo gy 图 4 部分不同种 veA 片段序列比对 Fig. 4 Sequence co mp a ri so n of veA f ragment s bet ween pa rtial diff erent specie s matio n in A sper gill us nidula ns : co mp etence and o t her 根据测序结果 ,片段长度为 558 bp ,序列相似性 develop ment al p roce sse s [ M ] . The Fungal Spo re : 比对 发 现 , 该 片 段 位 于 其 他 种 v eA 基 因 的 保 守 区 Mo rp ho genetic Co nt rol s. New Yo r k , Academic Pre ss , ( 段 ,与预测结果相符 。其中 ,与棒曲霉 A s p e r g i l l us 1981 . ) cl a v at us v eA 基因相似度最高 ,为 77 % 。与曲霉属 Kim H S , Ha n K Y , Kim K J ,et al . The veA gene ac2 [ 2 ] 的模式种构巢曲霉 v eA 基因相似度为 67 % 。tivates sexual develop ment in A sper gill us nidula ns [J ] . Fungal Genetic s a nd Biolo gy ,2007 ,37 :72280 . 3 讨论 [ 3 ] Dura n R M , Car y J W ,Calvo A M . Pro ductio n of cy2 ) 1根据生物进化的保守性及比较基因组学理 clopiazo nic acid ,af lat rem ,a nd af lato xin by A sper gill us [ 10 ] 论,通过比对同属中不同种真菌 veA 蛋白质 ,找 f lavus i s regulated by veA , a gene necessa r y fo r scle2 出保守区段 ,再根据保守区设计简并引物 ,可以进行 ro tial fo r matio n [J ] . Appl Micro biol Bio technol ,2007 , 相关 基 因 的 克 隆 。 To uchdo w n PCR 技 术 为 一 种 73 :115821168 . PCR 优化方法 ,指每隔一个循环降低 1 ?反应退火 Calvo A M ,Bo k J ,Broo k s W , Keller N P. veA Is Re2 [ 4 ] 温度 ,直至达 到“ To uch do w n”退 火 温 度 , 然 后 以 此 quired fo r To xin a nd Sclero tia A sper gill us pa ra siticus 退火温度进行 10 个左右的循环 。该方法最初出现 [J ] . Applied a nd Enviro nmental Micro biolo gy , 2004 , 是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应 70 :473324739 . 优化过程 。简并引物方法和 to uc hdo w n PCR 结合 , Kato N , Broo k s W , Calvo A M . The Exp re ssio n of [ 5 ] 为未知序列基因的克隆提供了很好途径 。笔者通过 Sterigmatocystin a nd Penicillin Genes in A sper gill us 这两种方法结合使用 ,从冠突散囊菌中克隆出了长 nidulans Is Co nt rolled by veA , a Gene Required fo r 度为 558 p b 的片段 。序列相似性比对发现与 设 计 引物时相应蛋白的基因相似度较高 。其中 ,与棒曲 Sexual Develop ment [ J ] . Eukar yo tic Cell , 2003 , 2 : 霉 v eA 基因相似度最高 ,为 77 % 。与构巢曲霉的相 117821186 . 似度为 67 % 。确定为 v eA 基因的片段 。 Hick s J K , Yu J H , Keller N P , et al . A sper gill us [ 6 ] spo r ulatio n a nd myco to xin p ro ductio n bo t h require ) 2冠突散囊菌在茯砖茶上大量着生 ,对茶叶外 [ 11 ] αinactivatio n of t he FadA Gp ro t ei n2dependent signa2 观和内质都有很大作用。茯砖茶的人工接种需 ling p at hway[J ] . Embo ,1997 ,16 :491624923 . 要大量孢子 ,探索其产生大量孢子的条件和弄清楚 杨抚林 ,邓放明 ,赵玲艳 , 等 . 茯砖茶发花过程中优势 [ 7 ] 其产孢机理 ,有利于茯砖茶的现代化生产 。同时 ,在 () 菌的研究进展 [J ] . 茶叶科学技术 ,2005 1:427 . 真菌界 ,对无性孢子的发育过程和机理研究已较为 齐祖同 . 曲霉属及相关有性型 :第 5 卷 . [ M ] . 北京 : 科[ 8 ] 透彻 ,而有性孢子发育过程和机理的研究要滞后得 学出版社 ,1997 .多 。试验获得 v eA 基因片段为该基因的保守区 ,可 刘作易 ,秦 京 ,李乃亮 . 茯砖茶“金花”菌 ———谢瓦氏 [ 9 ] 以直接通过 RN A 干涉等技术研究 v eA 基因功能 。 曲霉间型 变 种 的 孢 子 产 生 条 件 [ J ] . 西 南 农 业 学 报 , () 1991 ,4 1:73277 . 同时也为该基因全长序列的获 得提 供了 必要 的 条 Sa sa ki T , Sederoff R R. Geno me st udie s and molecu2 [ 10 ] 件 ,对冠突散囊菌甚至曲霉属的有性产孢机理的研 la r genetic s. The rice geno me and co mp arative geno m2 究奠定了一定的基础 。 ic s of higher plant s [J ] . Cur rent Opinio n in Plant Biol2 [ 参 考 文 献 ] o gy ,2003 ,6 :972100 . 刘作易 ,秦 京 .“金花”菌与茯砖茶品质 [ J ] . 贵州农 [ 11 ] () 学院学报 ,1991 ,10 1:79281 . ()责任编辑 : 杨 林 [ 1 ] Cha mp e S P , Kurtz M B , Yager L N ,et al . Spo re fo r2