实验十四DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析(1)
实验十四 DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 [原理]二甲氨基萘磺酰氯(1-Dimethylaminonaphtalene -5-sulfonyl
chloride,DNS-Cl),可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸,反应过程如下:
形成的DNS-氨基酸在紫外线(260nm或365nm)照射下发出强烈的黄色荧光,因此可用荧光检测DNS-氨基酸的存在。
聚酰胺薄膜对不同的DNS-氨基酸吸附力不同,用此薄膜在一定的溶剂系统中可将混合DNS-氨基酸进行层析分离。但是有些氨基酸的结构很近似,如只采用一种溶剂系统进行单向层析,难以达到完全分离氨基酸的目的,这时可选用另一种溶剂系统进行第二向层析,使在第一向层析中不能分离清楚的DNS-氨基酸得到完全分离,这样的层析
方法
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称为双向层析。
聚酰胺是一类高分子化合物含有大量的酰胺基团。这些酰胺基团上的氨基与氨基酸中的羰基形成氢键;而酰胺基团上的羰基又可与氨基酸中的羟基、酚羟基形成氢键。由于不同的氨基酸和聚酰胺形成氢键的能力不同,所以选择适当的溶剂系统对氨基酸混合液进行展层时,不同的氨基酸在溶剂与聚酰胺
表
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面之间的分配系统就呈现差异,这一差异使各种氨基酸在层析过程中分布在不同的位置,得到分离。
[器材与试剂]
主要器材:
毛细玻管
层析缸
40?温箱
紫外灯
电吹风
聚酰胺薄膜(5cm×5cm)
试剂:
DNS-Cl丙酮液:每毫升丙酮液中含DNS-Cl 2.5 mg。
展开剂:
第一相 苯:冰乙酸 = 9:1.7(v/v)
第二相 85%甲酸:水 = 1.5:100(v/v)
1mol/L HCl
1mol/L NaOH
0.2 mol/L NaHCO 溶液(用去离子水配制并用1 mol/L NaOH 调至pH 9.8) 3
水饱和乙酸乙酯
[操作]:
正常人血清处理:
取0.5ml正常人血清于离心管中加入无水乙醇1.5ml(一滴一滴地加入并摇匀)沉淀蛋白质,置4?冰箱2小时,离心取上清液于具塞试管中80,90?蒸干备用。 正常人血清中氨基酸的DNS化:
在有塞试管中(内有经预处理的血清)加pH9.8的 0.2 mol/L NaHCO 0.2ml、3DNS-Cl丙酮液0.2ml充分摇匀,放入40?恒温箱保温30分钟,去塞后再保温15分钟,取出后用1 mol/L HCl酸化至pH 2,3(注意用最小体积,从一滴加起。若酸化过份pH , 2,3,可用1 mol/L NaOH校回)。再加水饱和的乙酸乙酯1ml,摇匀待分层,吸取上层乙酸乙酯液于另一干净试管中。原管再加乙酸乙酯1ml,同样摇匀分层收上层液于同一试管中,80,90?水浴蒸干残渣加无水乙醇50μl溶解,摇匀后点样。
3.正常血清DNS-氨基酸的双向层析:
取一张5cm×5cm聚酰胺薄膜,经左下角距两边各0.5cm处点上血清DNS-氨基酸。点样时用毛细玻管吸取DNS-氨基酸乙醇液,点样直径控制在2mm,3mm之间,可重复几次以提高浓度,点样量以紫外灯下能见一明亮的荧光点为佳。点样后将膜卷拢放在苯-冰乙酸溶剂系统中进行第一向层析(点样处在下),待溶剂前沿到达离顶端约3mm处取出用电吹风冷风吹干至无冰乙酸味为止。在紫外灯下
观察层析情况然后将膜调转90?与第一向垂直在85%甲酸-水溶剂系统中进行第二向层析。层析后,用电吹风热、冷风交替吹去除残存溶剂。在紫外灯下观察结果,并用铅笔轻轻描写出各荧光点位置,对照标准图谱可确定各荧光点的DNS-氨基酸种类。