石斑木化学成分研究

石斑木化学成分研究 黄英君 (Raphiolepis indica(Linn.)Lindl()为蔷薇科(Rosaceac),石斑木属石斑木 (RaPhiolepis)植物，为常绿灌木或小乔木，生长于l300m以下的山坡、溪边疏林下、灌丛中，在我国的浙江、福建、江西、安徽、湖南、广东、海南、广西、贵 [1][2]州、云南、台湾等省均有分布，日本、老挝、越南、柬埔寨等国也有。石斑木高1.5,4m，幼枝初被褐色绒毛，后脱落。叶互生，叶片薄革质，卵形或长圆形，长4,8cm，宽1.5,4cm，先端短尖至渐尖，基部渐狭下延至叶柄，边缘具细锯齿，上面亮绿色，下面淡绿色，叶脉稍隆起，细脉明显;叶柄长5,18mm。圆锥花序或总状花序顶生。总梗及花梗被锈色绒毛;苞片狭披针形;萼筒管状，疏被柔毛，萼片5枚，三角状披针形或线形;花瓣白色至淡红色，倒卵状披针;雄蕊15花瓣近等长;花柱2,3枚，基部合生球形，直径5mm，熟时紫黑色，果 [3]皮稍肉质，味甜可食。花期4,5月,果期7,8月,种子繁殖。石斑木花序大型艳丽，叶、花、果都有较高的观赏价值，适宜于园林中栽培观赏。根、叶可入药， [4-5]去腐消炎，用于治疗溃疡红肿、刀伤、跌打损伤和骨髓炎。 广东省地势大体北高南低，境内山川纵横交错，中等山地、丘陵广布，山地、丘陵约占62%，台地、平原约占38%。全省处于低纬度地区，北回归线穿省而过，属热带、亚热带季风性湿润气候，境内动植物资源丰富。由于广东地处中国的南端，其南面滨临南海，而北部有山岭屏障，交通不便，从古至今，岭南的许多医家和民间在治疗疾病方面，善于运用生长于岭南本地的草药或药材，并积累了大量的临床用药经验，尤其在中草药的应用上，形成了其特殊的一面，为保障岭南人民的健康做出了贡献。广东省内广泛分布的各低山和丘陵为石斑木提供了良好的生长环境，省内潮州、梅州、河源、汕头、汕尾、清远、韶关、肇庆、江门、阳江、茂名等地均有分布，有石斑木、柳叶石斑木、细叶石斑木和锈叶石斑木，其中细叶石斑木和锈叶石斑木是我国的特有物种。 我国的天然植物资源极其丰富，迄今已经发现3万多种高等植物，其数量仅次于巴西和哥伦比亚，居世界第3位，其中50%以上是特有品种。我国药用植物及中药材种类繁多，达11145种以上，但是在全世界中药市场份额中，我国产品只占4%，其余96%为日、德等亚欧国家所占有(日本约占70%)。不但我国中 [6]药产品出口滞销，反而“洋中药”涌入我国。因此，我们应该充分利用资源优势和我国源远流长的中草药知识，积极开展中药现代化研究，振兴中药事业。对 1 石斑木这种中草药的药用成分及药理作用研究目前在我国仍然是一个空白，未见有相关的报导。本实验对石斑木化学成分进行了初步提取，并结合药敏实验对其药用性能进行了探索性的研究，目的在于开发中草药品种新的药用功能，填补国内空白，充实祖国中草药宝库。 1 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1 实验材料 石斑木采自广东省佛冈县的低山，药敏实验用大肠杆菌及金黄色葡萄球菌由湛江师范学院微生物实验室提供。 1.2 仪器与试剂 1.2.1 仪器: 旋转蒸发仪(RE52CS-2型，上海亚荣生化仪器厂) 循环水多用真空泵(SHB-3型，郑州杜甫仪器厂) 电子天平(CES-3KH型，长沙湘平科技发展有限公司) 分析天平(AUY120型，岛津国际贸易(上海)有限公司) 真空干燥箱(DZF-6050型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂) 数显电热培养箱(HPX-9052MBE型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂) 水浴恒温振荡器(SHZ-B型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂) 索氏提取器(湖南省祁阳县上字玻璃有限公司) 1.2.2 试剂 无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯化钠、氢氧化钠均为分析纯，干琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨为生化试剂。 1.3 方 法 1.3.1 水提取法 1.3.1.1 煎煮法 称取石斑木根茎粉末20g，加100mL蒸馏水煮沸1h，过滤，滤渣加蒸馏水50mL煮沸0.5h，过滤，滤渣再加蒸馏水50mL煮沸0.5h，过滤，合并滤液，减 [7]压浓缩，干燥备用。 1.3.1.2 索氏提取法 ?、称取石斑木根茎粉末20g，用滤纸包裹成几小包，置索氏提取器中，提取瓶内加入蒸馏水200mL，然后固定在铁架台上，置电热炉上加热，打开冷凝水，提取2,3h至流液无色，取出提取液，弃去药渣，将提取液减压蒸馏，浓缩至20mL。?、称取石斑木根茎粉末20g，利用索氏提取法加蒸馏水200mL提取 2 2,3h至流液无色，取出提取液，弃去药渣，将提取液减压蒸馏，得到浓缩液，加入无水乙醇使终浓度为70%，冷藏，过滤，回收乙醇，浓缩液冷藏4,8h或过夜，过滤除去析出的脂溶性成分，滤液加乙醇至浓度80,85%，冷藏，过滤，置 [8]旋转蒸发仪中减压蒸馏，浓缩回收乙醇，干燥备用。 1.3.2 乙醇提取法 1.3.2.1 冷浸法 称取石斑木根茎粉末50g，加入70%乙醇250mL浸泡12h，过滤，滤渣再加入70%乙醇125mL浸泡6h，过滤，滤渣再加入70%乙醇125mL浸泡6h，过滤，合并提取液，减压浓缩，干燥备用，另称取石斑木根茎粉末50g， 加入70%的乙醇250mL浸泡12h，过滤，滤渣再加入70%的乙醇125mL浸泡6h，过滤，滤渣再加入70%乙醇125mL浸泡6h，过滤，合并提取液，减压浓缩至50mL，将浓缩液先用乙酸乙酯萃取至乙醇层无色，再用等体积的正丁醇萃取，把乙酸乙酯层和正丁醇层分别浓缩干燥，得到萃取物。 1.3.2.2 索氏提取法 称取石斑木根茎粉末20g，用滤纸包裹成几小包，置索氏提取器中，提取瓶内加入蒸馏水200mL，然后固定在铁架台上，置电热炉上加热，同时打开冷凝水，提取2,3h至流液无色，取出提取液，弃去药渣，将提取液经过减压蒸馏,回收乙醇，得到浓缩液，干燥备用。 1.3.3 药敏实验 以石斑木的各种提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行体外抑菌实验，并测定七种提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)。 1.3.3.1 纸片扩散法进行石斑木提取物抑菌实验 首先选用新华一号定性滤纸，用打孔器制作直径为6.00,6.35mm的小圆片，置平皿内高压灭菌(103.4kPa, 20min)，取出后放入盛有经灭菌的含原药材1g/mL的提取物稀释药液的小试剂瓶中浸泡1,2h，然后真空干燥之，备用。然后制作固体培养基即牛肉膏蛋白胨培养基，以干琼脂粉15g、牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、加水1000mL，熬制成液体琼脂，分装在6个250mL的三角烧瓶和2 [9-10]支5mL试管内，121?高压蒸汽灭菌20min，备用。取5mL试管培养基两支做成斜面，编号E和G，冷却后E号管接种一环大肠杆菌，G号管接种一环金黄色葡萄球菌，37?培养24h，之后，制作琼脂平板，将灭菌好的三角烧瓶在水浴中溶化，然后将三角烧瓶中的琼脂倒入已灭菌好的14个平板中，约每个平板15mL，编号:E1、E2、E3、…… E7，G1、G2、G3、…… G7，待冷却后用移液 -2枪向平板中注入0.1mL已配好的10菌液，E组接入大肠杆菌，G组接入金黄色 3 葡萄球菌，均匀涂布在固体琼脂平板上，再用镊子分别挟取浸泡过不同的石斑木提取物溶液的滤纸片，平贴在已接种细菌的琼脂平板上，每个平板上贴6片，纸片中心相距约24mm，纸片距平板边缘约15mm，另做一组滤纸片上不含药液的空白对照，置于37?培养箱中24h后，观察抑菌圈的有无及大小。 1.3.3.2 试管稀释法测定石斑木提取物的抑菌效价 取15mm×100mm有胶塞试管6支，编号排列，每管中加入牛肉膏蛋白胨液体培养基2mL，然后于第一试管中加入含石斑木原药材粉末1g/mL的提取物水稀释液2mL,混匀后取出2mL，移入第2管，依次类推，直到第6管中取出2mL [11]-2弃去，使成1:2、1:4、1:8、…… 1:64等各浓度。取0.1mL浓度为10的大肠杆菌菌液分别加入上述1,6管中，混匀。按以上方法将每种提取物水稀释液都做成浓度梯度培养基，接种上大肠杆菌，另做一组，接种金黄色葡萄球菌。接种 o完后放入37C水浴恒温振荡器中培养24h，取出后用接种环从各管中挑取一环菌液在平版上划线培养，24小时后观察结果，开始有菌生长的即为药物对细菌的最小抑菌浓度(MIC)。 2 结果及分析 2.1 以水为溶剂的提取结果分析 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1 以水为溶剂不同提取方法的得率 名称 煎煮法 索氏提取法索氏提取乙醇去脂 法 质量/g 1(8621(685 1(390 得率/% 9(3108(425 6(950 由表1可以看出，煎煮法得率比索氏提取法得率高，而索氏提取乙醇去脂后的得率又低于索氏提取法，由此可知用索氏提取法提取的杂质较少，但脂类含量仍较多。 2.2 以乙醇为溶剂的提取结果分析 索氏提取法的效果较冷浸法好，提取液中的化学成分在正丁醇中的溶解度比在乙酸乙酯中大，具体见表2。 表2 以乙醇为溶剂不同提取方法得率 索氏提取法 名称 索氏提取法 冷浸法 乙酸乙酯萃正丁醇萃取 取 质量/g 1(931 4(170 0(605 1(563 得率/% 9(657 8(340 1(210 3(127 4 2.3 药敏实验 2.3.1 石斑木萃取物抑菌实验结果 抑菌实验结果见表3,表4。 表3 石斑木水提取物的药敏实验结果 菌名 空白对照 煎煮法 索氏提取索氏提取醇去脂 法 法 大肠杆菌 + - - - 金黄色葡萄球菌 + + - + 注: “+”有菌生长，“-”无菌生长。 表4 石斑木乙醇提取物的药敏实验结果 索氏提取法 名称 空白对照 索氏提取 冷浸法 乙酸乙酯萃 正丁醇萃取 法 取 大肠杆菌 + + - - - 金黄色葡萄球菌+ - - - + 注:“+ +”有菌生长，“+”有少量菌生长，“-”无菌生长。 药敏实验的纸片扩散法(Diffusion method)是按抑菌圈的的直径的大小，将细菌对药物的敏感性分为四个等级:无抑菌圈出现者为耐药，抑菌圈直径(包括孔径)d=7,9mm为低度敏感，抑菌圈直径(包括孔径)10,15mm为中度敏感， [12]抑菌圈直径(包括孔径)16mm以上为高度敏感。 药敏实验结果表明:以水为溶剂的石斑木提取物，在大肠杆菌培养基上，经培养产生不均匀的抑菌圈，且煎煮法的提取物和乙醇去脂后的提取物的d=9mm，呈现低度敏感，索氏提取法提取物的d=10mm，呈现中度敏感;而在金黄色葡萄球菌培养基上，经培养后也产生了抑菌圈，且d=8mm,呈现低度敏感。说明以水为溶剂用不同的方法提取的石斑木提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均有抑制效果。 以乙醇为溶剂的石斑木提取物，在大肠杆菌培养基上，经培养后产生不同大小的抑菌圈，其中索氏提取法的提取物抑菌现象不明显，无抑菌圈，呈现耐药，而冷浸法提取物和乙醇提取乙酸乙酯萃取物均有抑菌圈，且d=9mm，呈现低度敏感，正丁醇萃取物，d=8mm，呈现低度敏感;在金黄色葡萄球菌培养基上，经培养产生不均匀的抑菌圈，其中索氏提取法的提取物的d=9mm，呈现低度敏感，而冷浸法和醇提乙酸乙酯萃取物均有抑菌圈，且d=13mm，呈现中度敏感,正丁醇萃 5 取物抑菌现象不明显，无抑菌圈，呈现耐药。说明乙醇的冷浸物及乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑制效果，且对金黄色葡萄球菌的抑制效果较对大肠杆菌的好。 实验结果还表明，以乙醇为溶剂的提取物中，经过乙酸乙酯和正丁醇萃取后，起抑菌作用的化学成分主要分布在乙酸乙酯层，可以推测石斑木发挥抑菌作用的药用成分为中等极性的化学成分。 .2 石斑木抑菌效价实验结果 2.3 (1)石斑木水煎煮物对大肠杆菌的抑菌效价不明显，而对金黄色葡萄球菌的抑菌效价是1:8，结果见表5。 表5 石斑木水煎煮物的效价 试管编号 12 3 4 5 6 稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:321:64 大肠杆菌+ + ++ ++ ++ ++ 金黄色葡萄球菌 - - - + + + 注:“++”表示有菌生长，“+”表示有少量菌生长，“-”表示无菌生长。 (2)石斑木乙醇冷浸物对大肠杆菌的抑菌效价是1:2，对金黄色葡萄球菌的抑菌效价很明显，为1:16，结果见表6。 表6 石斑木乙醇冷浸物的效价 试管编号 1 2 34 56 稀释倍数 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 大肠杆菌 -+ + + + + 金黄色葡萄球菌 - - - - + + 注:“++”表示有菌生长，“+”表示有少量菌生长，“-”表示无菌生长。 (3)石斑木乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌的抑菌效价是1:2，对金黄色葡萄球菌的抑菌效价是1:16，结果见表7。 表7 石斑木乙酸乙酯萃取物的效价 试管编号 1 2 34 5 6 稀释倍数 1:2 1:41:8 1:16 1:321:64 大肠杆菌- -+ + +++ 金黄色葡萄球菌- - - - +++ 注:“++”表示有菌生长，“+”表示有少量菌生长，“-”表示无菌生长。 总体来看,以水为溶剂的石斑木提取物和以乙醇为溶剂的石斑木提取物对大肠杆菌的抑菌效价均低于对金黄色葡萄球菌的抑菌效价，表明石斑木根茎中的 6 化学成分对革兰氏阳性菌的抑制效果低于对革兰氏阴性菌的抑制效果，结果见表8和表9。 表8 石斑木对大肠杆菌的最小抑菌浓度 试管编号 12 3 45 6 稀释倍数 1:21:4 1:8 1:16 1:32 1:64 水煎煮法+ + ++++ ++ ++ 水索氏提取法+ + + ++ ++++ 水索氏提取醇去脂-- + + ++ ++ 物 乙醇索氏提取法 - ++ ++ ++ 乙醇冷浸物 - + + + + + 乙酸乙酯萃取物 - -+ + + ++ 正丁醇萃取物 - + ++ ++ 注:“++”表示有菌生长，“+”表示有少量菌生长，“-”表示无菌生长。 表9 石斑木对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度 试管编号1 2 3 45 6 稀释倍数 1:2 1:41:8 1:16 1:321:64 水煎煮法 - - -+ + + 水索氏提取法- - - -+ + 水索氏提取醇去- - -- ++ ++ 脂物 乙醇索氏提取法 - - - -- + 乙醇冷浸物 - -- - + + 乙酸乙酯萃取物- -- - + ++ 正丁醇萃取物 - - -+ + + 注:“++”表示有菌生长，“+”表示有少量菌生长，“-”表示无菌生长。 3 讨论 石斑木为蔷薇科植物，蔷薇科植物多含有丹宁、多种三萜和三萜皂甙等具有消炎作用的化学成分。本实验分别用水和乙醇对石斑木根茎粉末用不同的方法进行化学成分的提取与分离，并通过药敏实验确定了石斑木几种不同的粗提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。 3.1 以水作溶剂的提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌效果;以 7 乙醇作为溶剂的提取物也有明显的抑菌效果，但对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比对大肠杆菌的抑菌效果好。 3.2 乙醇冷浸物及乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效果，对大肠杆菌，乙酸乙酯萃取物(MIC=250μg/mL)比正丁醇萃取物 /mL)的抑菌效价高，说明石斑木抑菌的有效化学成分主要分布在乙(MIC=500μg 酸乙酯层。可以推测其有效成分中等极性的化学成分。 3.3 几种不同的提取方法中，乙醇索氏提取法所得的化学成分对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好(MIC=31.25μg/mL)。 由于本实验所用的方法及试剂有限，有关石斑木起作用的化学成分、作用方式及作用机制还有待于进一步深入研究。 参考文献: [1] 俞德浚.中国植物志[M].北京:科科学出版社. 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