【doc】根尖周肉芽肿内厌氧菌的间接免疫荧光检测研究

【doc】根尖周肉芽肿内厌氧菌的间接免疫荧光 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 研究 根尖周肉芽肿内厌氧菌的间接免疫荧光检 测研究 卫-2{--, A 圊 e* 济 aU 医 nl 科 vM 太 ed 宇 T 宇 ong 掇 ji19.!!!!!:!!! 根尖周肉芽肿内厌氧菌的间接免疫 荧光检测研究 兰里王燕秩邓惠妹 一r/, 摘要本文收集36例根尖周内芽肿标本,用兔抗厌氧消化链球菌,齿龈类杆菌,中间 型类杆菌和 小韦永球菌的多克隆抗血清,对其进行间接免疫荧光组织化学检测}同时对照HE 染色和Gram染色 观察.结果36例标本中有2o例(55.6)检出厌氧捎化链球菌抗原,有22例(61.1)检出 齿龈类杆 菌和中间型类杆菌抗原.而小韦永球菌仅发现2例I上述抗原定位于根尖周内芽肿 的渗出区,坏死区 及根尖面.并与巨噬细胞有关 关键词根尖周内芽肿}细菌/厌氧f荧光抗体技术 ———— ———, 中圉法分类号R781344.R378,R392—33 本文采用间接免疫荧光检测的方法结 合对照Gram染色,对根尖周肉芽肿内有无 厌氧菌及其抗原存在,以及存在的部位进行 了观察分析,从而为研究根尖周病的发病机 理提供了一定的参考. 1材料与方法 1.1标本的收集与处理选择过去6十月内未经任 何治疗,x线检查根尖周有透射影的,临床诊断为牙 髓源性根尖周病的患牙,局麻下常规拔除,锐分离根 尖病变组织,按近根尖和远离根尖的方向置于盛有 救甲基纤维紊的小盒内一7ou保存. 1.2兔抗庚氧菌多克隆抗血清的制备取厌氧消 化链球菌,齿龈类杆菌ATCC33277,中间型类杆菌 ATCC25611和小韦永球菌,用等渗盐水清洗,CPS— iA型超声粉碎仪粉碎,分光光度计分别测其悬液的 蛋白含量.按3mg/ml稀释并通过伤寒杆菌标准管 比色后将完整的厌氧菌分别以(10~12)亿十/ml的 悬涟备用. 4l其雄性太耳白兔分别于耳中央动脉采血5ml, 取血清备用.于第1天和第14天分别在兔背部皮下注 射上述加等量檑氏完全佐剂的粉碎细菌悬涟1Tn1f 第7天和第2l天兔腹腔分别注射同种完整细菌悬涟} 第28天分别于兔耳中央动脉采血5m】,其血清与免 同济医科大学附属同济匿院口腔科,武汉4300.~0 华西医科大学口腔医学院,成都610041 如 疫前血清做对流免疫电泳试验f第3D天免心脏采血 的血清置56"C温箱30n后分装保存I用ELEsA 法测免疫后免血清的抗体滴度,并用双向免疫扩散 法将抗血清与多种不同属细菌进行交叉反应试验 1.3冰冻切片殛组用AO型恒玲式切片机,连 续切片,厚5m.分6组.组I(L,7,13…)用于检 测厌氧消化链球菌I组I(2,8,l4…)用于检测齿 龈类杆菌I组I(3l9,15…)用于检测中间型类杆 菌}组?(4,10,16…)用于检测小韦永球菌;组 V(5,ll,17…)分为组V和组V:.前者作阴性 对照,后者用于免疫阻断实验组啊(6,12,18 … )分为组?和组?:}分别进行HE和Gram染色. 6组切片均经丙酮禳固定,一30?保存. 1.4HE,Gram殛问接免疫萤光法检测组?和 组?常规HE和Gram染色.同时与相邻切片的问 接免疫荧光检测结果对比观察组l,I,I和?分 别用PBS浸洗后滴加适当稀释度的相应抗血清,湿 盘内37?,30rain.再浸洗后溥加羊抗兔IgG荧光抗 体,湿盘内37?,30min.浸洗.封片,Nikon荧光 显擞镜镜柱和拍照'组V授洗后直接溥加羊抗兔 IgG荧光抗体再取上述4种厌氧菌抗原2Omg加^2 ml丰苜应的兔抗血清中,37?置?rain.4?过夜,离 心后在组V!切片上重复组】,?实验. 2结果. 2.1抗体滴度和交叉反应. 免疫后4只兔血清中分别产生抗厌氧消 曹颖光等.根失周内芽肿内厌氧菌的间接免疫黄光检测研究 化链球菌,齿龈类杆菌,中间型类杆菌和小 韦永球菌的抗体,抗体滴度分别为1:4096, 1:2048,1:2048和1:1024;其抗血清经多次 试验分别以1:20,l10,1;1O和不稀释的浓 度检测效果最佳.交叉反应试验均为阴性. 2.2HE和Gram染色 HE染色诊断为根尖肉芽肿,按病理变 化大致分为渗出区,肉芽肿区和纤维化区… Gram染色镜检,ll例存在Gram阳性或 (和)阴性细菌集落,多见于渗出区,少见于 肉芽肿组织区的细胞间隙内(图1). 2.3荧光显微镜镜检 结果见附 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf .24例发现阳性荧光,除2例 外皆有两种以上厌氧菌抗原的阳性荧光;12 例未发现,且荧光背景很弱或无荧光背景.对 照组切片上均未发现阳性荧光.发现阳性荧 光的切片与相邻HE染色切片对比观察,阳 性荧光多位于渗出区.在肉芽肿组织区,根 尖面,少数标本的增生上皮组织附近也发现 阳性荧光,还发现阳性荧光位于有多个巨噬 细胞聚集的区域.(图2,4) 附表间接免疫荧光检测和Gram染色结果 3讨论 3J关于根尖周内芽肿内的厌氧菌 尽管在根管治疗过程中采用严格的根管 扩挫,清洗,消毒以及严密充填等治疗原则, 仍有一些根尖周病不能治愈或再次复发,因 此,根尖周病变组织内有无细菌的问题受到 人们的关注.有文献报道根尖肉芽肿内无细 菌存在j;而另一些学者则认为根尖周肉芽 肿内的细菌是其发生的病因之一l', 本文36例标本经间接免疫荧光检测,发 现24例有厌氧菌抗原的阳性荧光.其中】1例 标本的Gram染色结果显示有Gram阳性或 (和)阴性的细菌集落存在,说明根尖肉芽肿 内有厌氧菌存在,这与Tronstad和松岛?洁 对根尖肉芽肿细菌的厌氧培养结果一致,分 析单纯Gram染色检出率低的原因,可能是 细菌以集落的形式少量存在于根尖肉芽肿内 的一定区域,若非连续切片,难免有漏检的 可能. 多年来对根尖周病细菌学研究,主要采 用细菌培养的方法,但对根尖周病的厌氧培 养中仍存在取材污染和培养基选择等问题, 而本文采用的方法则具有迅速和灵敏的优 点.本文结果表明,根尖肉芽肿内存在多种 厌氧菌抗原.消化链球菌属及类杆菌属占一 定的优势,这与多数学者通过感染根管内取 材和对根尖肉芽肿的厌氧培养结果相吻 合因此,根尖肉芽肿内的厌氧菌可能来自 感染根管,根尖肉芽肿形成及变他过程中也 不能排除厌氧菌及其碎片,分解产物和毒素 等抗原成分的作用 3.2厌氧茁抗原存在的部位 对于根尖肉芽肿内的抗原,抗体和抗原 抗体复合物等存在的部位,目前报道尚不多 见.本文采用将间接免疫荧光检测结果阳性 的切片与其相邻的HE染色的切片对比观察 的方法,推测其存在的部位.结果发现,阳性 荧光出现的部位多位于与相邻HE染色切片 上的渗出区相对应的区域,少数位于肉芽肿 区和近根尖区另外,在与渗出区内有多个巨 噬细胞聚集处相对应的部位也发现阳性荧 光,参照该处较弱的荧光背景推测其可能位 于巨噬细胞膜上以及炎性细胞内.由此可见: 厌氧菌抗原成分可能参与上述部位的免疫反 应,影响肉芽肿的病理变化其中位于渗出区 的抗原可能直接引起炎症反应,巨噬细胞在 细胞免疫过程中有一定作用,但对于增生上 皮组织附近的厌氧菌抗原是否参与肉芽肿向 囊肿转变,尚需进一步探讨. (本文图1,4见第296页) 同济医科大学1993J22(4).252 参考文献 lYanagisawaS.Pathologicstudyofperiapicalle- sionsJOralPathol,1980}9I288 2BlokReta1.Ahistopathologic,histobacteri— ologicandradiographicstudyo{35pathapica] endodonficsurgica]speclmentOralSurg, l976}42:658 3McCrackenAW.Ciinicalandora】microbio]o— gYNewYork:McCraw—HillBookCompany. 1983:63—65 4WinklerTFeto2.RevJewofthe】iteraturea histologicstudyotbacteriainperiapicalp~tho- sis.PharmacalTberDent,1975}2:157 5TronstadLet.Anaerobicinoeriapieallesions ofhumaDteeth.JEndod,1986I12(3)l113 6松岛洁等.齿根内芽肿I=扫c于6细菌学检索.日 齿保志,1989}32(1):153 7PanteraEAetO2.Indirect forthedetectionofbacteroidesspeciesinhuman dentslpulp.JEndodon.1988I14(5)218 8YoshidaMeta1.Correlationbetweenc]inical symptomsandmicroorganismsisolatedfrom rootcanalofteethwithperiapiealpathosis.J Endodon,1987I13(1)j24 (1992-11—02收稿) DetectionofAnaerobiainHumanPeriapicalGranulomas UsingIndirectlmmunofluorescence CsoYingguang,WangYenqiu,DengHuishu DepartmentofStomatology,Hoslntal,TongjiMedicalUniversity,Wuh?n430030 SchoolofStomatology,WestChinaUniversityo,MedicalSciences,Chengdu610044 AbstractSerialeryostatsectionsof36odontoge~icperiaplcalgranulomasofhuman toothwerepreparedfordemonstrationofanaerobicbacteriabyusingindirectimmuun0fluo— rescencetechnique.TherabbitwereagainstPeptostreptoeocausanerobius(P. a),Becteroides gingivalis(B.g),Becteroidesintermedius(B.i)andVeillonellaparvula(V.p)wereusedfor identificationofthebaeteroidesinthisstudy.Thesectionsofpositiveimmun6fluorescence werecomparedwiththeHE—stainedandGram— stainedsectionsofthesamesample.There- suhswereasfollows:Therewere20(556)antigensofP.s,22(61.1)antigens0fB. gandantigensofB.i,andonly2(5.6)antigensofV.Phavebeenfoundin36samp1es. Theanaerobicbacteriawiththeirantigensasmentionedabovewerefoundintheexudative zone'neerdticzoneandgranulomasadjacenttotheroot—apex,andwerealsorelatedto maerophage. KeywordsperiapieaIgranuloma;bacteria,anaerobic;fluorescentantibodvteehnic