PCR和PCR产物斑点杂交技术检测成人咽喉病变中人乳头状瘤病毒感染

PCR和PCR产物斑点杂交技术检测成人咽喉病变中人乳头状瘤病毒感染 产物斑点杂交技术检测成人咽喉病变中和 PCR PCR 人乳头状瘤病毒感染 33 33 33 3 陈波蓓包其郁张洪勤吴淑珍 () 摘 要 目的: 研究成人咽喉部良、恶性病变与人乳头状瘤病毒 感染的关系。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 : 应用聚合 H PV () 酶 链反应 PCR 和斑点杂交技术, 对 55 例咽喉不 同 病 变 的 新 鲜 组 织 标 本 进 行 H PV 共 5 型 6, 11, 16, 18, 33 ( ) ( 2感染的检测。 结果: 在咽乳头状瘤组 感染率为 60% 6ƒ10, 喉乳头状瘤组为 70% 7ƒH PV DN A H PV ) () ( ) ( ) 10 , 喉鳞状上皮非典型增生组为 20% 15, 声带息肉组为 20% 15, 喉癌组为 20% 15, 声带小结 ƒƒƒ ()组为 0 010。2型别分布在咽喉良性病变中以 型为主, 喉癌中以 为主。 结论:ƒH PV DN A H PV 6, 11 H PV 16 本地区成人咽喉良、恶性病变的发生与 感染密切相关。 结合核酸斑点杂交法检测 具有 , H PV PCR H PV 灵敏性高、特异性强的优点, 值得推广应用。 ( ) () 关 键 词 乳头状瘤病毒 喉疾病 脱氧核糖核酸, 肿瘤P ap illom av iru se sL a ryngea l d isea se s (), DN A neop la sm -D e term ina t ion of HPVD NA in adults pa t ien ts w ith pharyn gea l an d laryn gea l d isea se s , , ,C h en B obe iB a o Q iy u Z h a n g H on g q in W u S h u z h en ( ) 6, 11, 16, 18 33 A BSTRACT T h e H PV h um an p ap illom a v iru se san d DN A w e re () de te rm in ed b y m e tho d s o f po lym e ra se ch an reac t io n PCR an d do t b lo t h yb r id iza t io n in 55 . 10 ,sp ec im en s o f p h a ryn gea l an d la ryn gea l d isea se sT h e re w e re p h a ryn gea l p ap illom a 10 , 5 , 15 , 10 la ryn gea l p ap illom aa typ ica l ep ith e lia l h yp e rp la siavo ca l co rd s po lyp svo ca l 5 , . co rd s no du le an d la ryn gea l ca rc inom aw h ich a ll w e re d iagno sed b y p a tho lo gyR e su lt s () 210% 610,60ƒshow ed th a t th e po sit ive ra te o f H PV DN A w a s in p h a ryn gea l p ap illom a ( ) ( )2010% 15 ƒ10% 35 , , 20ƒin vo ca l co rd s po lyp sin a typ ica l ep ith e lia l h yp e rp la sia ( ) 010% 0ƒ10. ( )2010% 15 in la ryn gea l ca rc inom a an d in vo ca l co rd s no du leT h e to ta l ƒ () 217% 18ƒ5555 . 6 32po sit ive ra te o f H PV DN A w a s in sp ec im en sIt s fo u n d th a t th e H PV 11 , 16 an d H PV DN A w e re p repo n de ran ce in la ryn gea l b en ign le sio n san d H PV DN A . w e re p repo n de ran ce in la ryn gea l ca rc inom aT h e re la t io n sh ip b e tw een th e in fec t io n o f , .H PV typ e s an d p h a ryn gea lla ryn gea l d isea se s w e re d iscu ssed in th is p ap e r () [C h in e se A rch O to la ryn go l H ead N eck Su rg, 2000; 7 4: 238, 241 , F rom th e D ep a r tm en t o f O to la ryn go lo gy Seco n d A ff ilia ted H o sp ita lW en zho u M ed ica l () ,325027 . ]Co llegeW en zho u D rC h en Bo b e i 1 ( 人 乳 头 状 瘤 病 毒 , 。 本研究目的是采用聚合酶临床上有重要意义h um an p ap illom av iru s () ) 是具有严格宿主范围和组织特异性的一 链反应 结合核酸斑点杂交技术, 对成人咽 H PV PCR 类 病毒, 它只能感染人的皮肤和粘膜, 导喉 不 同 病 变 组 织 进 行 2检 测, DN A H PV DN A 致组织异常增生而产生各种病变。近年来研究表 3 325027 温州医学院附属第二医院耳鼻咽喉科 感染有密切关 明, 人类多种肿瘤的发生与 H PV 温州医学院分子生物学研究室 3 3 系。在已发现的 100 多型中 H PV 6, 11, 16, 31, 33 等型在 着 重 对 H PV 6, 11, 16, 18, 33 5 个 型 别 检 测, 以 探 讨 感染与咽喉病变发生的相关性, 并 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 各 H PV 型别 H PV 在不同咽喉病变中的表达率。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 标本来源: 本院咽喉手术及门诊活检标本共 55 例。 全部病例分为咽乳头状瘤 10 例, 喉乳头 () 状瘤 10 例 均无恶变, 喉鳞状上皮非典型增生 (5 例, 声带息肉 15 例 均取自男性较大广基息肉 ) (组织, 喉鳞癌 5 例, 声带小结 10 例 均取自女性 ) 患者, 上述病例均经组织病理学证实。标本取材 后立即置入- 70?冰箱存放。 标本处理: 所取标本组织用磷酸盐缓冲液洗 扩增 2检测结果。为 分 图 1 PCR H PV DN A A DN A 涤, 组织匀浆后常规蛋白酶 消化, 苯酚氯仿 ƒK ( ) 子 量 标 准: 5 × 174DN A H ae ? m a rk e r k b ;ƒ抽提, 乙醇沉淀后溶于 。T E 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, ( ) 扩增: 引物 扩增 280序列为PCR H PV 6 bp 118, 72。、为阴性对照; 、为 阳性; BC DE H PV 6 、为 阳性。FG H PV 11 ′ 55′TA GT GGGCC TA T GGC T C GT C 3′和 ′; 引 3T CCA T TA GCC T CCA C GGGT GH PV 11 ′; 为 5′23- GA TA H PV 16 D igGCA A A CCA CC TA () 物 扩增 360序列为 5′-bp GGA A TA CA T TA GGGGA A CA C T GGGGCA 3′; H PV 18 为 5′ 3′和 5′-GC GCCA T GT GGC GA GCA GA C GT 22 D igT GGT T CA GGC T GGA T T GC GT C GC () ′; 引物 扩增 152序列 3H PV 16 bp CC GT CC T C G ′; 为 5′23-A A GCCCA H PV 33 D igCA A A T G为 5′T GC TA GT GC T TA T GCA GCA A 3′和 5′ ′, 由3CA A GGCA CA GA C T C TA GA T GGCCA T A T T T C T GCA A CA T T GGTA C 3′; H PV 18 引 物 上海生物工程公司合成。 试剂盒用贝灵曼公司 () 扩增 216序列为 5′-bp A A GGA T GC T G( ) ( 产 品 BOEH R IN GER M A N N H E IM D IG 3′和 5′2CA CC GGC T GA CA C GCA CA C GC T T , . .DN A L ab e lin g an d D e tec t io n K itC a tN o ( ) ′; 引物 扩增 455序列为3GGCA GGT H PV 33 bp ) 1093657, 按说明书操作。 主要步骤: ? 乳头状 瘤组织 提取物经 扩增, 产物经变性 DN A PCR 5′2 5′A T GA TA GA T GA T GTA A C GCC 3′和 G 后点样 于 经 10 ×溶 液 浸 湿 的 硝 酸 纤 维 膜 SSC CA CA C T CCA T GC GTA T CA G3′, 由 中 国 科 学 上, 80?烘烤 2 小时; ? 预杂交 30 分钟; ? 37? 院上海细胞生物学研究室合成。 试剂用量为每( 杂 交过夜 5 ×阻断试剂, 011% 十二烷 , 1% SSC 50反应体系中, 含分型 引 物 50ƒ四 种, Λl Λm o lL 基肌酸钠, 0102% , 50% 甲酰胺, 标记的 SD SD ig ) 寡核苷酸探针 10ƒ? 2×11% ; , 0聚 合 n g m lSSC SD S 脱氧三 磷 酸 核 苷 各 200ƒ, Λm o lL T aqDN A 洗 膜 2 次, 011 × 11% , 68?洗 膜 2 , 0SSC SD S酶 115 单位, 模板用量 5Λl, 反应步骤为 92? 30 次; ? 抗 抗体2碱性磷酸复合物作用 30 分 D ig 秒变性, 55? 30 秒复性, 72? 60 秒引物延伸, 钟; ? 和 显色, 阳性标本可见紫色或 BC IP N B T 共进行 35 个循环。 扩增产物经 2% 琼脂糖凝胶 ()蓝色斑点出现 图 2。 电泳, 溴乙锭染色, 在紫外光下观察结果并照相 2 结果 ()记录 图 1。 () 斑点杂交: 地高辛 标记的寡核苷酸探 D ig 针序列: 为 5′22H PV 6 D igCA T TA A C GCA GGG 2. 1 PCR 扩增结合核酸斑点杂交检测各组咽 ′; 11 为 5′23CC GCC T GA A A T T GT GCC H PV D ig喉病变组织 2发生率及各型别比较见 H PV DN A 2C GCC T CCA CCA A A T GGTA CA C T GGA G 表 1。 结果提示: 55 例标本中, 总感染率为H PV 表 1 55 例病人 2检测结果 H PV DN A H PV H PV H PV H PV H PV H PV 6 11 6+ 11 16 18 33 计 病变ƒ型别 例数 阳性 % 阳性 % 阳性 % 阳性 % 阳性 % 阳性 % 阳性 % 咽乳头状瘤 6 — — — 0 — 0 — 10 6010 60 0 0 0 6 — — — 7010 5 50 1 1 0 0 0 10 7 喉乳头状瘤 10 10 喉上皮非 0 — 1 20 0 — 0 — 0 — 0 — 5 1 2010 典型增生 — — — — 10 20声带息肉3 20 — 0 0 0 0 0 15 3 — — — — — 20 喉 癌 2010 0 0 0 1 0 0 5 1 — — — — — — 声带小结 0 0 0 0 0 0 10 0 010 计 14 2 1 1 0 0 55 18 3217 2. 2 PCR 扩增法和 PCR 扩增产物斑点杂交 法检测 H PV 6 型敏感性比较见表 2。 表 2 两种检测方法 H PV 敏感性的比较 6 扩增产物 合计 PCR 结果 + - 14 0 14 PCR 阳性 阴性PCR 8 33 41 合计 22 33 55 3 讨论 本实验结果显示成人咽喉病变与 感 H PV 图 2 斑点杂交检测 2结果。×1, ×4, H PV DN A A A 检测的阳性率 , H PV 染有关。 喉病变性质不同×7 分别为 阳性对照; ×2, × A H PV 6, 11, 16 A A 阳性例数 和各亚型结果也不同。 本组中 H PV 5, ×8 分别为 阴性对照。 1, 3 中 A H PV 6, 11, 16 ( ) 为咽乳头状瘤 6 例 6ƒ10, 60% , 喉乳头状瘤 7 其余各项为 的 产物; 4, 6 中其余 H PV 6 PCR 各项为 的 产物; 7, 9 中其余各项 H PV 11 PCR () 例 710, 70% , 喉鳞状上皮非典型性增生和鳞 ƒ 为 的 产物。 杂交结果有紫色斑点 H PV 16 PCR ( ) 癌各 1 例 1ƒ5, 1ƒ5, 10 例喉乳头状瘤患者中 为阳性, 无色为阴性。 均为首次发病 例 , 其中, 单侧声带 6 , 双侧声带 ( ) ( ) 5ƒ10 , 型 阳 性 率 为 10% 1ƒ10 , H PV 11 ( ) 型 10% 1ƒ10; ? 咽乳 头 状 瘤: H PV 6+ 11 H PV 发病 4 例。 表明成人单发性喉乳头状瘤也存在 () 阳性率为 60% 610均为 型; ? 喉上皮ƒH PV 6 H PV 感染。在 H PV 感染亚型中, 喉良性病变特 感 染 以 别 是 咽 喉 乳 头 状 瘤 组 织 中 H PV ( ) 阳 性 率 为 20% 15 为 ƒ非 典 型 增 生, H PV H PV 6, 11 为 主。 喉 鳞 癌 组 织 检 测 为 H PV 16 , 而 ( 型; ? 声带息肉 阳性率为 20% 3ƒ H PV 11 H PV H PV 6 和 H PV 11 型为阴性, 提示 H PV 16 型感染 ) 15均为 型; ? 喉癌 阳性率为 20%H PV 6 H PV 与 恶 性 肿 瘤 的 关 系 更 密 切, 与 文 献 报 告 相 一 ( ) 1ƒ5为 型感染; ? 声带小结 10 例组织 H PV 16 2 致 。 许多资料表明, 某些类型的 H PV 感染有 标本 2阴性; ? 各组均为阴H PV DN A H PV 18, 33 性。不是致癌的唯一因子, 环境 致癌作用, 但 H PV 感染及致癌中可能起 的检测及其它病原的检测 因素和遗传因素在 H PV 此, 该方法在 H PV 与周围化学和物理因素 中都具有一定的推广价值。 协同和启动作用, H PV 参考文献的关系, 尚有待于进一步研究。鉴于本组例数较 1 陈波蓓, 包其郁, 张丽芳, 等. 小儿咽喉乳头瘤组织 少, 感染相关性有待深入研究。H PV 人类乳头状瘤病毒检测及型别分析. 温州医学院学 和核酸斑点杂交均具有敏感性高的 PCR 报, 2000; 30: 39, 11 4 吴 正 虎, 陈 怀 芳, 张 世 俊, 等. 上 呼 吸 道 乳 头 状 瘤 优 点, 但 却 难 以 检 出 基 因 拷 贝 低 于 10病 2 3, 42的 检 测. 耳 鼻 咽 喉2头 颈 外 科, 1996; 3:H PV DN A 原, Sh ib a te 在 对 石 腊 切 片 标 本 进 行 的 141, 143H PV 16 和 H PV 18 的检测中发现, 使用 PCR 扩增 林万明主编. 临床基因探针诊断实验技术. 上海: 上 后的杂交检测, 能使检测敏感性达到可检出 20海科学技术出版社, 1992: 7, 10 3 个病毒基因拷贝的水帄, 使敏感性提高近一千 林万明主编. 技术操作和应用指南. 北京: 人民 PCR 5 4 倍。考虑到两者的优点具有互补性, 我们将两 军医出版社, 1993: 7, 8 , , . Sh iba te D K A rnh e im N M a r t in W JD e tec t io n o f 者结合应用, 结果证实两种方法检测结果完全 5 h um an p ap illom a v iru s in p a raff in em bedded t issue ( ) 一 致者为 8515% 4755, 不一致者为 1416% ƒ . ,u sing th e po lym e ra se ch a in reac t io nJ E xp e r M ed ( )) (855以 型检测为例。扩增产物 ƒH PV 6 PCR 1988; 167: 225, 230 () 斑点杂交法检出率 2515% , 1455明显高于单 ƒ ( ) ( ) 101, 虽 0纯 扩增法 1415% , 855P < ƒPCR () 收稿 2000- 03- 21, 回修 2000- 05- 07 , 但其特异性强, 敏感性 然核酸杂交法较为繁锁 更高, 避免了 法可能出现的假阳性和假阴 PCR 注: 本 课 题 为 温 州 市 科 技 发 展 计 划 基 金 资 助 项 目 性结果, 同时使 扩增结果得到了验证。 因PCR ()990306SA ()中线恶性网织细胞增生症的诊断和治疗—附 14 例 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 摘要 333 陈登巨陈明章刘收厚 (中 线 恶 性 网 织 细 胞 增 生 症 1 例; 发热伴头 咽部粘膜弥漫性增生、糜烂伴局部坏死 m id line m a lignan t 痛 3 例。 全身情况可, 颈部及颌下未触及肿大淋巴结, ) ,简称中线恶网。 既往称恶性肉芽肿,re t icu lo sisM M R 心肺腹部检查未发现异常。 活检 37 次, 帄均 2164 次ƒ 特发性致死性恶性肉芽肿, 中线致死性溃疡性肉芽肿。 1873 年, 首先报道 1 例鼻面部溃疡形成而迅 M cB r ide 例。1 例患者活检 5 次。正确诊断 4 次, 诊为慢性炎症, 速致死病例以来, 国内外文献相继有病例报道。因其病 坏死组织 28 次, 误诊为鳞癌, 未分化癌等 5 次; 3 次患 变主要发生在面中线、鼻腔、鼻窦、鼻咽、喉等部位, 早 者经外院会诊而确诊。 60 期临床症状无特异性, 病理检查多表现为炎性非特异 结果。 14 例患者均行放射治疗, 照射剂量是Co 性肉芽组织, 常延误诊断治疗。报告本科自 1988, 1998 () 50, 65, 5 例放疗同时 口 服 环 已 亚 硝 脲 , 3GyCCN U 年间临床资料完整的诊治 14 例中线恶网患者并就其 例放疗后使用 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 化疗。随访 2, 10 年, 1 例失 COM P 诊断治疗进行讨论。 () () 访 按死亡统计, 3 年生存率 7619% 10ƒ13, 5 年生存 临床资料。患者 14 例, 男 10 例, 女 4 例, 年龄 26, 74 岁, 帄均 4015 岁。40 岁以下 7 例。病程 1 月, 2 年, () 率 6617% 69, 7 例患者死亡, 3 例死于局部复发和远 ƒ6 个月以内者 9 例。 主要临床表现, 鼻塞 9 例, 涕血 5 处转移, 2 例死于其他疾病, 2 例死因不明。 例, 鼻出血 4 例, 粘脓涕 2 例, 吞咽疼痛 1 例。 鼻腔粘膜 () 收稿 1999- 05- 17糜烂坏死, 结痂 5 例; 鼻腔结节、肉芽、新生物 3 例; 下鼻 甲增生破溃坏死 3 例; 鼻中隔、软腭穿孔 2 例; 鼻腔、鼻 3 223300 江苏省淮阳市第一人民医院耳鼻咽喉科