门冬氨酸钾镁3种注射剂补充钾镁效率和对抗内毒素损伤的比较

中国新药与临床杂志（Chin J New Drugs Clin Rem），2010年 9月，第 29卷 第 9期 [收稿日期] 2010－03－16 [接受日期] 2010－07－20 [作者简介] 李丽娟 （1972—）， 女， 贵州毕节人， 副教授， 博士， 主要从事心血管疾病的研究。 E－mail： fdhllj＠sohu．com [通讯作者] 王树人。 Phn： 86－28－8550－1268。 E－mail： wangshuren1945＠yahoo．com．cn ［文章编号］1007－7669（2010）09－0675－04 门冬氨酸钾镁 3种注射剂补充钾镁效率和对抗内毒素损伤的比较 李丽娟1， 韦丽华2， 焦玉蓉2， 谢 静3， 王树人2 （1． 遵义医学院 病理生理教研室， 贵州 遵义 563003； 2． 四川大学华西基础与法医学院 病 理生理教研室， 四川 成都 610041； 3． 成都市第四人民医院， 四川 成都 610041） ［关键词］ 钾镁天冬氨酸； 钾； 镁； 尿素； Na（＋）K（＋）交换 ATP 酶； 电感耦合等离子体原子发射光谱仪； 肝细胞 L02 株 ［摘要］ 目的 比较 3 种不同门冬氨酸钾镁注射剂补充细胞内钾 （K＋）、 镁 （Mg2＋） 的效率及其对抗内毒 素 （LPS） 肝细胞损伤的差异。 方法 常规培养肝细胞 L02 株， 分为空白对照组、 A 组、 B 组和 C 组。 除 空白对照组外， 各组细胞培养液中分别加入 A、 B、 C 三种门冬氨酸钾镁注射剂 （均含 K＋ 5．3 mmol·L－1及 Mg2＋ 2．8 mmol·L－1）， 继续培养细胞 1、 2、 3、 5 h 后， 测定细胞内 K＋和 Mg2＋的含量。 对抗内毒素 （LPS） 损 伤实验中将肝细胞 L02 株分为 LPS 组、 LPS＋A 组、 LPS＋B 组、 LPS＋C 组， 各组均经终浓度为 0．1 mg·L－1 LPS 和 20 mmol·L－1的 NH4Cl 处理， 同时将 3 种门冬氨酸钾镁注射剂分别加入各组， 培养 2 h 后测定细胞 培养液中尿素氮浓度和细胞膜 Na＋-K＋-ATP 酶的活性。 结果 与空白对照组比较， 各门冬氨酸钾镁注射剂 组 K＋、 Mg2＋进入细胞内的量均增多， 2 h 时 A组的 K＋、 Mg2＋浓度明显高于 B 组和 C 组 （P ＜ 0．05）。 在对抗 LPS 损伤实验中， 与 LPS 组比较， 各门冬氨酸钾镁注射剂均可促进氨的清除， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现为尿素生成明显增多， 以 LPS＋A 组的效果最为显著 （P ＜ 0．05）； 但 3 种门冬氨酸钾镁对内毒素损伤肝细胞膜 Na＋-K＋-ATP 酶活性 的效应均不显著 （P ＞ 0．05）。 结论 3 种门冬氨酸钾镁注射剂的生物学效应有一定差异， A 组能较快地促 进 K＋、 Mg2＋进入细胞， 且显示出较好地拮抗 LPS损伤肝细胞的作用。 ［中图分类号］ R965 ［文献标志码］ A Effects of three potassium aspartate and magnesium aspartate injections on concentration of potassium and magnesium in L02 cells and its protection against LPS damage LI Li-juan1， WEI Li-hua2， JIAO Yu-rong2， XIE Jing3， WANG Shu-ren2 （1． Department of Pathophysiology， Zunyi Medical College， Zunyi GUIZHOU 563003， China； 2． Department of Pathophysiology， West China School of Preclinical Medical Sciences ＆ Forensic Medicine， Sichuan University， Chengdu SICHUAN 610041， China； 3． Fourth People＇s Hospital of Chengdu， Chengdu SICHUAN 610041， China） ［KEY WORDS］ potassium magnesium aspartate； potassium； magnesium； urea； Na（＋）-K（＋）-exchanging ATPase； inductively coupled plasma atomic emission spectrometers； L02 cell， hepatocytes ［ABSTRACT］ AIM To investigate the effects of three different potassium aspartate and magnesium aspartate 675· · 中国新药与临床杂志（Chin J New Drugs Clin Rem），2010年 9月，第 29卷 第 9期 门 冬 氨 酸 钾 镁 （ potassium aspartate and magnesium aspartate）， 是门冬氨酸钾盐和镁盐组成 的混合复盐 ， 通常用作钾 （potassium， K＋）、 镁 （magnesium， Mg2＋） 的电解质补充溶液。 20 世纪 60 年代国外应用于治疗各型肝炎、 肝硬化和高氨 血症发现有一定的疗效； 70 年代末国内应用门冬 氨酸钾镁治疗心律失常， 心功能不全， 急、 慢性 肝炎和高胆红素血症等亦取得较好的效果[1]。 门冬氨酸对细胞有较强的亲和力， 作为 K＋、 Mg2＋载体， 使 K＋、 Mg2＋更易于进入细胞内， 从而促 进细胞的离子平衡、 代谢及各项功能。 本课题组 前期的研究亦证实 [2]， 门冬氨酸钾镁促进 K＋、 Mg2＋ 进入细胞的速度远大于同等剂量的氯化钾和硫酸 镁， 这是在临床上门冬氨酸钾镁取代氯化钾和硫 酸镁补充细胞内 K＋、 Mg2＋的主要理论基础。 本实 验选用国内常用 3 种的门冬氨酸钾镁注射剂， 所 使用的门冬氨酸有 DL 消旋型和 L 型 。 由于门冬 氨酸在立体化学构型上 （DL 或 L） 及配比的差异， 本研究探索 3 种不同的门冬氨酸钾镁注射剂在功 效上的差异， 以便为临床制剂的选择提供参考。 材料与方法 1 仪器、 试剂与药品 751-GW 分光光度计 （惠 普上海分析仪器有限公司）， 电感耦合等离子体原 子发射光谱仪 （IRIS ADVANCE， 美国热电仪器公 司）， 全自动生化分析仪 （BS-200 美国）； RPMI- 1640 细胞培养基 （Gibco 公司）， 小牛血清 （杭州 四季青生物工程材料研究所）， 内毒素 （LPS， 北 京中国药品生物制品检定所）， 细胞膜 Na＋-K＋-ATP 酶活性测定试剂盒 （南京建成生物技术研究所）； A （潘南金注射液， 匈牙利吉端大药厂）， B （门冬 氨酸钾镁注射液 ， 山东瑞阳制药有限公司 ）、 C （欣美佳粉针剂， 山西普德药业有限公司）。 2 肝细胞株 L02 的培养 人肝细胞株 L02 （四川 大学华西医院卫生部移植工程和移植免疫重点实 验室赠送） 以 RPMI-1640 培养基， 含有 10％的小 牛血清及 5 mmol·L－1 HEPES 缓冲液 ， 于 37 ℃、 5％CO2 的培养箱中培养。 L02 细胞长滿瓶底 80％ 后， 以 1 比 2 传代继续培养， 采用培养的 L02 细 胞进行后续实验。 3 实验分组及处理 3．1 L02 细胞内 K＋、 Mg2＋浓度测定 将 L02 细胞 分为空白对照组、 A 组、 B 组和 C 组。 细胞长至 80％融合时， 除空白对照组加入生理盐水外， 细胞 培养液中分别加入 3 种门冬氨酸钾镁 （终浓度为 K＋ 5．3 mmol·L－1 及 Mg2＋ 2．8 mmol·L－1）， 继续培养 细胞 1、 2、 3、 5 h， 收集细胞并计数， 参照张淑 华等[3]的方法处理细胞标本， 器材均经过严格的去 离子处理， 将收集的细胞用蒸馏水 0．5 mL 稀释后 置于 25 mL 三角烧瓶内 ， （HNO3 ∶ H2O2 ＝ 2 ∶ 1， V ／ V） 混合液浸泡 15 ～ 20 min， 将三角烧瓶置于 电热板上 （恒温 ， 40 ～ 45 ℃） ， 再加入混合酸 （HNO3 ∶ HClO4 ∶ H2O2＝2 ∶ 2 ∶ 1， V ／ V ／ V） 5 ～ 7 mL injections on the concentration of potassium （K＋） and magnesium （Mg2＋ ） in L02 cells and the protections against LPS damage to L02 cells． METHODS Cultured L02 cells were divided into four groups： control group， group A， group B and group C． Three different injections （containing 5．3 mmol·L－1 K＋ and 2．8 mmol·L－1 Mg2＋） were incubated into group A， B and C respectively． At 1， 2， 3 and 5 h after treatment， the content of K＋ and Mg2＋ in L02 cells were measured by inductively coupled plasma atomic emission spectrometers． To observe the protections against LPS damage， L02 cells were divided into four groups： LPS group， LPS ＋ group A， LPS ＋ group B and LPS ＋ group C． LPS （0．1 mg·L－1） and NH4＋Cl （20 mmol·L－1） were contained in culture media of all groups． After LPS treatment， three different injections were also incubated into group A， B and C， respectively． At 2 h， the activity of Na ＋-K ＋-ATPase and the concentration of urea in culture solution were measured． RESULTS The content of K ＋ and Mg2＋ of L02 cells in three groups with potassium aspartate and magnesium aspartate injections were increased compare with the control group． Concentrations of K＋ and Mg2＋ in L02 cells of Group A was significantly higher than group B and C at 2 h （P ＜ 0．05） ． Compared with the LPS group， the NH3 was cleaned quickly by three potassium aspartate and magnesium aspartate injections． LPS ＋ group A was significantly different with the other groups （P ＜ 0．05） ． However， there were no difference of the activity of Na＋-K＋-ATPase in all groups （P ＞ 0．05） ． CONCLUSION Three potassium aspartate and magnesium aspartate injections do have some different actions． Group A could improve the concentration of K＋ and Mg2＋ in L02 cells quickly， and protect L02 cells against LPS damage． 676· · 中国新药与临床杂志（Chin J New Drugs Clin Rem），2010年 9月，第 29卷 第 9期 进行消化。 反应平缓进行， 至混悬状态消失。 此 时提高温度 （50 ～ 55 ℃） 至刚有少量 NO2气体冒 出继续进行消化， 至溶液呈无色或淡黄色。 提高 温度 （60 ～ 65 ℃） 赶酸， 杯底出现白色粉末或无 色。 同时以不加细胞样本 （其余步骤同前） 的三 角烧瓶作为空白对照。 经过以上处理的标本用 5％ 稀硝酸溶液溶解后转移至 10 mL 容量瓶以备检测。 将 K＋和 Mg2＋的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品贮备原液 （浓度为 1 g·L－1） 逐级稀释制备标准溶液， 采用电感耦合等离子体 光谱法制定标准曲线及测定样品 K＋和 Mg2＋的含量。 3．2 尿素氮浓度和细胞膜 Na＋-K＋-ATP 酶活性测 定 将 L02 细胞分为 LPS 组、 LPS ＋ A 组、 LPS ＋ B 组、 LPS ＋ C 组， 细胞长至 80％融合时， 各组分 别经终浓度为 0．1 mg·L－1 LPS 和 20 mmol·L－1 的 NH4Cl 处理， 在经过上述处理后， 与 3．1 操作相 同， 将不同门冬氨酸钾镁分别加入各组， 继续培 养 2 h， 收集细胞培养液测定尿素氮浓度； 收集细 胞， 超声粉碎仪裂解， 制备细胞混悬液， 测定细 胞膜 Na＋-K＋-ATP酶的活性。 4 统计学方法 采用 SPSS 13．0 统计软件进行数 据的统计分析。 所有数据均用x ± s表示， 采用单 因素方差分析进行多个样本均数的两两比较， P ＜ 0．05为显著差异。 结果 1 不同门冬氨酸钾镁注射剂携带 K＋、 Mg2＋进入细 胞效率的比较 表 1、 2 显示， 加入不同门冬氨酸 钾镁注射剂配制成的溶液后， L02 细胞内的 K＋和 Mg2＋浓度均较空白对照组增加， 以 A 组促进 K＋、 Mg2＋进入细胞的速度为快。 2 h 时， A 组的 K＋和 Mg2＋浓度明显高于 B 组和 C 组 （P ＜ 0．05， n ＝ 4）。 B组和 C 组在 3、 5 h 才显示较明显的效果。 提示A 组促进 K＋和 Mg2＋进入细胞的速度快于 B组和 C 组。 2 3 种不同门冬氨酸钾镁注射剂拮抗 LPS 损伤 L02 细胞作用的差异 2．1 细胞膜上 Na＋-K＋-ATP 酶活性 加入门冬氨酸 钾镁溶液后， LPS ＋ A、 LPS ＋ B、 LPS ＋ C 组与 LPS 组对 LPS 损伤后 L02 细胞膜 Na＋-K＋-ATP 酶活 性作用均无显著差异 （P ＞ 0．05）。 见图 1。 2．2 NH4＋向尿素的转换效率 LPS ＋ A、 LPS ＋ B 和 LPS ＋ C 组细胞培养液内尿素氮的浓度明显增 加， 以 LPS ＋ A 组促进 NH4＋向尿素的转换作用更 为显著 （P ＜ 0．05）。 讨论 本研究显示， A 组的潘南金能较快地促进 K＋、 Mg2＋进入肝细胞， 2 h 内， 细胞内 K＋、 Mg2＋浓 度显著高于 B 组和 C 组。 2 h 后， B 组和 C 组的效 果逐渐显现， 该 2 组间比较无显著差异。 这表明， 潘南金促进 K＋、 Mg2＋进入细胞内的速度快于其他 2 种制剂。 677· · 中国新药与临床杂志（Chin J New Drugs Clin Rem），2010年 9月，第 29卷 第 9期 人体的氨基酸皆为 L 型， 因此， 正常人体的 氨基酸转运系统基本上只转运 L 型氨基酸。 门冬 氨酸钾镁快速进入细胞的机制被认为与钠离子依 赖的谷氨酸转运系统 （XAG－） 有关。 XAG－在人体的 分布非常广泛， 是一种高亲和力的氨基酸转运体， 对门冬氨酸盐的 Km为 10 μmol·L－1[4]。 如在前列腺 上皮细胞， 经由 XAG－转运体， 可使细胞内的门冬氨 酸达到血浆浓度 40 倍以上 [6]。 因此， 当 K＋、 Mg2＋ 与门冬氨酸结合时， 可通过 XAG－转运体快速进入细 胞。 另外， 由于 XAG－的立体结构特点， 其还具有适 合 D 型门冬氨酸的结构域， 可同等转运 D 和 L 型 门冬氨酸盐 [5]。 在本研究中， 我们采用的潘南金同 时含 D 和 L 两型门冬氨酸钾镁， 而其他 2 种门冬 氨酸钾镁注射剂仅含 L 型。 因此， 我们推测， 潘 南金充分利用了 XAG－转运 D 和 L 两型门冬氨酸盐 的立体化学结构， 故而显示出对 K＋、 Mg2＋更强的 转运效率。 以往的研究表明 [7]， 由于门冬氨酸钾镁 针剂的不同组分， 甚至制剂质量都会对 K＋、 Mg2＋ 细胞内转运效率造成不同影响。 因此， 我们认为 A 组在本实验中的作用可能是多因素的。 另外， 门冬氨酸作为中间代谢环节参与鸟氨 酸循环， 能促进氨的代谢， 使之生成尿素， 降低 血中氨含量。 在本研究中， 门冬氨酸钾镁显示出 一定的 LPS 拮抗效应， 在 LPS 作用于肝细胞 2 h 后， 3种门冬氨酸钾镁制剂皆可促进 NH4＋向尿素的 转换， 表明门冬氨酸钾镁对肝细胞的鸟氨酸循环 （尿素循环） 有保护作用， 这显然支持临床上将门 冬氨酸钾镁应用于高氨血症， 3组间比较亦以 A 组 潘南金效果最好。 对于细胞膜上的 Na＋-K＋-ATP 酶， 3种制剂的门冬氨酸钾镁皆未显示出拮抗 LPS 的保 护效应， 推测该酶可能不是门冬氨酸钾镁促进 K＋ 较快进入细胞内的主要通路。 综上所述， 3 种门冬氨酸钾镁注射剂显示了不 同的 K＋、 Mg2＋转运效应和拮抗 LPS 损害肝细胞的 作用， 其中潘南金疗效较为突出。 ［参考文献］ ［1］ 陈新谦， 金有豫． 新编药物学[M]． 15版． 北京： 人民卫生出版 社， 2003： 417． ［2］ 彭克军， 王秋林， 吴琛珩， 等． 门冬氨酸钾镁对肝细胞代谢的 影响[J]． 中国新药与临床杂志， 2005， 24（3）： 215－219． ［3］ 张淑华， 郭爱民， 王 晖， 等． 动物内脏微量元素测定预处理 方法的改进[J]． 首都医科大学学报， 2002， 23（1）： 77－78． ［4］ MCGIVAN JD， PASTOR-ANGLADA M． Regulatory and molecular aspects of mammalian amino acid transport[J]． Biochem J， 1994， 299 （ Pt 2）： 321－334． ［5］ DALL＇ASTA V， GAZZOLA GC， FRANCHI-GAZZOLA R， et al． Pathways of L-glutamic acid transport in cultured human fibroblasts[J]． J Biol Chem， 1983， 258（10）： 6371－6379． ［6］ FRANKLIN RB， ZOU J， YU Z， et al． EAAC1 is expressed in rat and human prostate epithelial cells； functions as a high- affinity L-aspartate transporter； and is regulated by prolactin and testosterone[J]． BMC Biochem， 2006， 7： 10． ［7］ 陈 斌， 郁颖佳， 段昊天， 等． 市售门冬氨酸钾镁注射剂的质 量 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 [J]． 中国医药导刊， 2008， 10（9）： 1431－ 1433． 《辽宁中医药大学学报》 2011 年征订启事 《辽宁中医药大学学报》， 月刊， 入选 2008 年中国科技论文统计源期刊 CSTPCD （中国科技核心期刊）， 为辽宁省一级期刊。 坚持以中医中药为主体， 以教学科研为先导， 以基层实用为根本， 及时 报道新理论、 新技术、 新思路、 新成果。 重点为中医药高、 中等院校教师、 学生及医药人员服务。 主要栏目： 论著聚焦、 基 础医学研究、 临床医学研究、 博士风采、 硕士论坛、 名医经验、 临床报道、 医药社区、 中西医结合、 推拿按摩、 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