家兔尿生成的因素及肾缺血再灌注损伤初探

家兔尿生成的因素及肾缺血再灌注损伤初探 (南方医科大学第二临床学院10级临床医学) 摘要: 目的:强化颈动、静脉，输尿管插管技术和家兔肾缺血再灌注损伤模型的复制方法，加深理解尿生成的机理及肾排泄功能的重要意义，熟悉缺血再灌注损伤的机制及其基本实验方法。 方法:21组家兔麻醉后分别行颈静、动脉插管术和输尿管插管术，在静脉补充37?的生理盐水15min后、补充20%的高渗葡萄糖15min后、夹闭左肾动脉15min并再 速尿、生理盐水+高渗葡萄糖按组别分别抢救15min灌注15min后，生理盐水、生理盐水+ 后，分别观测平均动脉压，尿量。并测定再灌注及治疗后尿肌酐、血肌酐浓度及内生肌酐清除率(Ccr);结果:补充生理盐水和高渗葡萄糖后血压，尿生成量均增加，夹闭左肾动脉 速并再灌后各值均降低，生理盐水治疗可使血压回升，尿生成量和Ccr略回升，生理盐水+尿治疗可使各项参数均回升，生理盐水+高渗葡萄糖治疗各项参数均回升但不显著。结论:增加血容量和升高血浆渗透压均可使血压、尿生成量增加，缺血再灌注后血压下降、肾排泄能力降低、内生肌酐清除率降低，速尿治疗后可纠正此变化，生理盐水和高渗葡萄糖仅能纠正血压及部分纠正恢复肾功能。 关键词:肾 尿生成 内生肌酐清除率 缺血再灌注 肾脏是机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行的重要器官。肾功能探究实验一直是各大高校培养医学生过程中的重点实验。其意义在于使医学生通过实际操作，了解各种因素下肾功能的改变及其机制。肾缺血再灌注损伤是指肾组织缺血时和其后恢复血液灌注时器官功能不能恢复正常，甚至发生更为严重的组织损伤或器官功能衰竭。肾脏由于其组织结构和功能的特殊性，是对缺血再灌注损伤敏感的器官之一。肾缺血再灌注损伤是急性肾功能衰 [1]竭的主要原因之一，也是移植排斥反应，尤其是慢性排斥反应的重要原因，探究它的机制对医学生有重要意义。而对内生肌酐清除率(Ccr)的测定可了解肾小球的功能，因此，本实验通过给家兔生理盐水、高渗葡萄糖、制造肾缺血再灌注模型并予以三种不同的抢救等，并对各情况下家兔肾功能情况进行测定，以培养医学生动手能力及对肾功能、缺血再灌注机制和意义的理解。 1 材料与方法 1.1材料: 1.1.1主要试剂与仪器: 20%乌拉坦，0.2%肝素，生理盐水，20%葡萄糖溶液，蒸馏水，速尿剂，肌酐测定试剂(含试剂一、试剂三、试剂四)。 医用计算机 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 系统(PcLab)及计算机，家兔手术台，哺乳动物手术器械，动脉、静脉及输尿管插管，动脉夹，压力换能器，三通管，注射器，兔绳，纱布，剪刀，分光光度计，恒温水浴箱，试管，微量加样枪带枪头，称重称。 1.1.2 实验动物: 家兔，体重约2.2kg，由南方医科大学提供。 1.2 方法:(进行21组实验，每组均按下述方法进行) 1.2.1 前期准备 家兔称重2.2kg，用20%乌拉坦11ml(5ml/kg)耳缘静脉麻醉，麻醉后将家兔仰卧位固定于手术台。家兔颈部、左肾区、耻骨联合上部分别备皮。沿甲状软骨下正中依次剪开皮肤、浅筋膜，钝性分离右侧颈外静脉并插管。沿胸锁乳头肌和胸骨舌骨肌间隙钝性分离，并在气管正中钝性分离颈阔肌，游离左颈动脉并插入肝素充盈的动脉插管，连接压力换能器以记录平均动脉压ABP。家兔耻骨下联合上约三横指处沿前正中线(腹白线)剪开皮肤、浅筋膜，于膀胱左侧输尿管并进行输尿管插管并用有刻度的试管收集尿液。 1.2.2 研究尿生成过程影响因素 静脉推注37?，30ml生理盐水，用有刻度的试管收集尿液并计算注射后每分钟尿量(ml/分钟);一段时间后静脉输入37?，10ml 20%葡萄糖溶液，用有刻度的试管收集尿液并计算注射后每分钟尿量。收集的尿液待测尿肌酐含量。 1.2.3 肾缺血再灌注损伤的实验 于左肾区切开皮肤、浅筋膜，找出左肾并游离左肾动脉，用动脉夹夹闭，夹闭15min后观测平均动脉压和尿量变化。松开动脉夹，再灌注，再次观测平均动脉压和尿量变化。15min后，1~7组采取抢救 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 一(于颈静脉插管输入37?、20ml 生理盐水)，8~14组采取抢救方案二(于颈静脉插管输入37?、19ml 生理盐水及速尿1ml)，14~21组采取抢救方案三(于颈静脉插管输入37?、10ml 生理盐水及20%葡萄糖溶液10ml)分别进行抢救，抢救15min后取尿测定尿肌酐浓度，记录平均动脉压和尿量变化并收集尿液待测尿肌酐含量。 1.2.4尿肌酐测定方法 取尿液10μl与2ml蒸馏水按1:200比例稀释，按下表分别加入样品及不同试剂于各管，37? 10min水浴，以蒸馏水调零， 测510 nm处分光光度值并按以下公式计算尿肌酐。 尿肌酐(mmol/L) = (测定管OD - 空白管OD)/ ( 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 管OD – 空白管OD )x标准品浓 度(10umol/L) x 201倍 内生肌酐清除率Ccr =尿肌酐浓度/血肌酐浓度x 尿量(ml/min) 表1 尿肌酐测定加样量表 试管 标准管 测定管 调零管 空白管 稀释后尿液(ml) 0 1.6 0 0 试剂一(Cr标准品)(ml) 1.6 0 0 0 蒸馏水(ml) 0 0 2.6 1.6 试剂三(ml) 0.5 0.5 0 0.5 试剂四(ml) 0.5 0.5 0 0.5 2 实验结果 2.1标准管及空白管OD值见下表: 表2 标准管及空白管OD值 标准管OD 空白管OD 1 0.075 0.012 2 0.069 0.008 平均值 0.072 0.01 2.2 各治疗方案实验数据如下(以各组实验数据中有效数据记录，其中尿肌酐、血肌酐及内生肌酐清除率为计算值): 正常状态下，家兔平均动脉压75~85mmHG，尿量3~4.5ml，血肌酐156.1~163.2umol/L，尿肌酐6224~9369umol/L，Ccr 11.6~17ml/min。输入生理盐水后各项指标均上升但不明显，输入葡萄糖后尿量增加，但平均动脉压变化不明显，再灌注后除血肌酐升高外，各指标均明显降低。方案一治疗家兔后平均动脉压91mmHG，尿量7.6ml，尿肌酐1458.9 umol/L，血肌酐161.5 umol/L，Ccr 4.6，方案二治疗后家兔平均动脉压83.4mmHG，尿量22.5ml，尿肌酐1231.9umol/L，血肌酐177.4umol/L，Ccr 13.4，方案三治疗后家兔平均动脉压72.7mmHG，尿量13.5ml，尿肌酐2042.4umol/L，血肌酐143.7umol/L，Ccr 12.8(各时间点各指标变化规律详见讨论部分)。 表3 治疗方案一各实验数据 输尿管插输生理输入20%葡再灌注抢救方案一 管后 盐水后 萄糖后 15min后 15min后 平均动脉压76.7 76 70 81 91 (mmHG) 尿量(ml) 4.5 5 6.8 1.2 7.6 尿肌酐(OD值) 0.202 0.051 0.055 血肌酐(OD值) 0.098 0.109 0.101 尿肌酐(umol/L) 6224.5 1329.2 1458.9 血肌酐(umol/L) 156.1 175.6 161.5 内生肌酐清除率0(6 12.0 4.6 (ml/min) 表4 治疗方案二各实验数据 输尿管插输生理盐输入20%葡再灌注抢救方案二 管后 水后 萄糖后 15min后 15min后 平均动脉压84.16 89.3 95.1 80.8 83.4 (mmHG) 尿量(ml) 3 3.4 5.2 1.3 22.5 尿肌酐(OD值) 0.299 0.064 0.048 血肌酐(OD值) 0.101 0.112 0.11 尿肌酐(umol/L) 9369.2 1750.6 1231.9 血肌酐(umol/L) 161.5 181.0 177.4 内生肌酐清除率11.6 0.9 13.4 (ml/min) 表5 治疗方案三各实验数据 输尿管插输生理盐输入20%葡再灌注抢救方案三 管后 水后 萄糖后 15min后 15min后 平均动脉压82.4 100.2 88.6 73.7 72.7 (mmHG) 尿量(ml) 4.5 5.6 8.8 1.5 13.5 尿肌酐(OD值) 0.295 0.071 0.073 血肌酐(OD值) 0.102 0.112 0.091 尿肌酐(umol/L) 9239.5 1977.6 2042.4 血肌酐(umol/L) 181(0 163.2 143.7 内生肌酐清除率17.0 1.1 12.8 (ml/min) 3 讨论: 3.1尿生成的影响因素 尿生成的过程包括肾小球滤过、肾小管和集合管的重吸收和分泌，机体对尿生成的调节就是 [1]通过这三个基本过程而实现的，具体为肾内自身调节以及神经和体液的调节。 肾小球滤过作用主要决定于有效滤过压。 而有效滤过压=(肾小球毛细血管静水压+囊内液胶体渗透压),(血浆胶体渗透压+肾小囊内压)。毛细血管血压主要决定于肾血流量及毛细血管横截面积，肾血流量多而毛细血管横截面积小时，毛细血管静水压高，故当机体缺血时，肾血流量减少，毛细血管血压下降，尿生成减少。胶体渗透压主要决定于液体内物质，当液体内糖、蛋白质及离子等物质增多时，液体胶体渗透压增高，故当肾小球血管壁受损时，血液内物质进入肾小球，是胶体渗透压差值降低，尿生成增加(但此时通常肾血流量会减少而导致尿生成减少)。肾囊内压通常较稳定，对尿的生成影响小，仅在肾结石，肿瘤等疾病时机体会因囊内压升高而少尿。 肾小管和集合管通过重吸收作用回收尿内的小分子物质如糖、一些离子物质，而99%的水也会被重吸收，故原尿仅有1%会成为尿液。当肾实质受损时，肾小管重吸收功能减弱，尿量增加(但肾实质受损时通常毛细血管静水压会下降而导致尿生成减少)。 肾小管和集合管的分泌功能主要通过分泌一些小分子物质进入尿液而改变尿液胶体渗透压而改变尿量。但由于其分泌量较少，对尿生成影响不大。 机体对尿生成的调节主要依靠肾素-血管紧张素-醛固酮系统，该系统抑制时，尿量增加。 3.2尿肌酐及内生肌酐清除率(Ccr) 尿肌酐全部由肾小球滤过，不被肾小管重吸收，很少被肾小管排泌，而内生肌酐清除率(Ccr)指肾单位时间内把若干毫图1 肾小球滤过率的影响因素 升血液内的肌酐全部排泄出去，是肾小球功能的极敏感指标， [2]当肾小球功能受损时，Ccr降低。 3.3实验数据分析 25 20 治疗方案一15 治疗方案二 10治疗方案三 5 0 插管后输生理盐水输葡萄糖再灌后治疗后 图2各治疗方案下尿量变化折线图 18 16 14 12治疗方案一10治疗方案二8治疗方案三6 4 2 0 正常再灌后治疗后 图3 各治疗方案下Ccr变化折线图 3.3.1 各情况下各指标变化分析 静脉快速注射30ml生理盐水后，家兔尿量及平均动脉压上升但不显著(尿量上升不大于1ml， 1平均动脉压升高不大于10mmHG)，其主要原因为:?静脉注射NS后血浆胶体渗透压降低但不 2显著，肾小球滤过率增加不明显，故尿量轻微增加。?NS注入后血容量上升(2.2kg家兔血容量约130ml)，肾动脉血压上升，使肾小球滤过率增加，且血管壁受刺激使肾素-血管紧张素-醛固酮系统兴奋，机体保水功能抑制，尿量增加。 静脉注射20%葡萄糖后，家兔尿量显著增加(均大于1.5ml)，但平均动脉压变化趋势不明 1显。其主要原因为:?高渗葡萄糖的升胶体渗透压作用较生理盐水强，故尿量升高也更明显。2?由于高渗葡萄糖在已经注入30ml生理盐水后注入，故家兔血容量增加更明显，尿量也更显 3著地增加。?此时，实验过程进行已久(超过1.5h)，家兔由于各种手术而导致失血过多，且应激状态逐渐减弱，肾上腺素等释放减少，是机体血压下降，这种作用拮抗了高渗葡萄糖的升压作用。但由于各家兔生理状况不同，故各组平均动脉压变化趋势不明显。 夹闭左肾动脉后，机体进入应激状态，再灌注后，由于肾功能严重受损，机体进入急性肾功能衰竭少尿期而严重少尿，可比正常值少0.2ml以上。尿肌酐、Ccr急剧下降，反映肾小球坏死严重。目前，急性缺血再灌注肾损伤的发病机制尚未完全阐明，现有的研究资料表明它与ATP 的减少、大量氧自由基的产生、细胞内钙超载、细胞凋亡基因的调控等介导的肾小管、 [1]肾小球细胞损伤具有密切关系。 在家兔接受第一种治疗方案(20ml生理盐水)后，家兔尿量上升，平均动脉压升高不明显。平均动脉压变化趋势分析同前(实验过久导致缺血而无法升高)，尿肌酐、Ccr回升但不明显，可能因为生理盐水仅有增加血容量作用，对家兔解救效果不明显。 在家兔接受第二种治疗方案(19ml生理盐水+1ml速尿)后，家兔各项指标回升明显，其原因是呋塞米(速尿)能增加水、钠、氯、钾、钙、镁、磷等的排泄。呋塞米能抑制前列腺素分解酶的活性，使前列腺素E2 含量升高，从而具有扩张血管作用。扩张肾血管，降低肾血管阻力，使肾血流量尤其是肾皮质深部血流量增加，从而预防急性肾功能衰竭。呋塞米等袢利尿药存在明显的剂量,效应关系。随着剂量加大，利尿效果明显增强，且药物剂量范围较大。 在家兔接受第三种治疗方案(10ml生理盐水+10ml20%葡萄糖)后，家兔各项指标回升比单纯生理盐水明显，其原因可能为高渗葡萄糖使组织液更多地进入血液，从而使血容量增加更多，利尿作用更强而使治疗作用更好。 3.3.2 各治疗方案数据对比分析 如图2，再灌注前，各尿量变化曲线均平坦，而治疗后尿量明显增加，以方案二增加最为显著可见治疗方案二的利尿作用最强。可能因为肾缺血再灌后，机体处于应激状态，各种生理功能亢进，在药物注入后机体新陈代谢加快，尿量增加。而速尿(呋塞米)具有极佳的利尿作用，且兼有扩血管，扩血容量作用，故治疗效果最好。 如图3，尽管治疗后二、三治疗方案Ccr相差不大，但二方案的家兔正常Ccr较高，故仍然可以看出治疗方案二的治疗效果最佳，其次为方案三，方案一治疗效果不佳，甚至治疗无效(Ccr较该家兔正常值低，但可能由于实验实验过长(此时已达3h)，肾功能已经发现不可逆衰竭而治疗无效)。 3.4 实验中遇到的问题 (1)实验过程家兔易死亡，分析原因有一下几点:?插管操作不熟悉导致家兔失血过多，而本此实验耗时较长，家兔失血死亡;?本次实验需有三个创口，需暴露颈部、胸腔和腹腔。可能由于操作不当使家兔器官衰竭而亡;?肾是机体主要的排泄器官之一，能够调节细胞外液容量和血流的渗透压，排除体内过剩的电解质离子，从而维持机体内环境的稳态，保证机体各种生命活动的进行，而且肾脏是一个高血流的器官，易发生缺血再灌注损伤，当我们在 缺血的家兔再进行缺血灌注，导致死亡。 (2)正确的插管技术是实验成果的先决条件。本组实验遇到的最大困难即输尿管插管后无尿液，经过分析，可能有以下几个原因:?教室气温低、动物麻醉和长时手术创伤等应急性刺激均可提高交感神经系统兴奋性,使肾血管收缩,导致肾血流量和肾小球血浆流量显著减少,肾小球滤过率也因此而减少;?交感神经兴奋也可调动肾素一血管紧张素一醛固酮系统,醛固酮通过保钠保水作用而致尿量减少;?长时间手术如出血较多可致循环血量减少，反射性地引起抗利尿激素释放增多，尿量减少;?插管不成功，可能是未成功分离输尿管、输尿管插管过高或误将输尿管扎破等原因引起。实验过程中，发现本实验组的家兔盆腔有无色透明的液体溢出，猜测是由于输尿管插管时用力过大，而使输尿管破损，尿液从破损处流出，因而收集不到尿液。本实验小组经过分析后，选取右肾输尿管重新插管，成功收集到尿液。 (3)在测量动脉血压时，本实验组发现计算机导出的数据为0，检查家兔的呼吸心跳，发现生命体征正常，触摸动脉插管发现无搏动感。可能原因有一下几种:?未成功分离颈动脉，误将颈静脉当做颈动脉;?颈动脉插管失败，不慎将颈动脉刺破或结扎过紧而使管子不通;?未用足够肝素浸润，使管内血液凝固而阻塞血管;?换能器内空气未排尽。经过检查发现，换能器中有气泡，注射生理盐水将气泡排出后，即可成功测得动脉压。 3.5 本实验的改进 本实验由于学生初学操作技术，人为因素对结果影响极大，且实验设计本身不够完美。如: 在加入30ml生理盐水后再加入高渗葡萄糖，此时由于家兔血容量已大，故各指标增加更明显是否是高渗葡萄糖的作用不得而知。 [4]有文献研究，膀胱内插管不但操作更简便，且实验结果更准确。故对于初学者来说，膀胱内插管可能比本实验采用的输尿管插管更合适。 [3]而已分光光度法测定肌酐也已不是目前检验科所用的常用方法，故改进各数据的测定方法也是本实验可改进之处。 综上，本实验使医学生通过实践操作了解了各种因素尤其是缺血再灌注对肾功能的影响，但结果的影响因素多，人为因素大，故更多的是以课程教学为目的，而无法真正为科学研究提供依据。 参考文献 1. 陈军宁.肾缺血再灌注损伤的研究进展. 医学信息[J]. 2010,23(7):2246-2248 2. 朱大年. 生理学[M]. 第7 版. 北京:人民卫生出版社，2008:229-234. 3. 陈文彬，潘祥林等. 诊断学[M]. 第7版 北京:人民卫生出版社，2008:351-354 4. 王海波. 影响尿生成因素生理学实验中膀胱内、外输尿管插管的比较. 综合医学 [J].2012-8,9(22):140-141