的人脐带间充质干细胞代谢物提取方法选择的优化

的人脐带间充质干细胞代谢物提取 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 选择的优化 磁共振成像 2011年第2卷第6期 Chin J Magn Reson Imaging, 2011, Vol 2, No 6 基础研究 | Original Articles 用于高场MRS研究的人脐带间充质干细胞代谢物提取方法选 择的优化 1 1 1 2 2 3 1* 代海洋 ,洪璧楷 ,肖叶玉 ,杨玉萍 ,马 廉 ,陈耀文 ,吴仁华 基金项目: [摘要] 目的 从代谢物提取效率及9.4 T MRS对不同提取物检测敏感性差异的 本文受国家自然科学基金重点项目编 角度 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 比较离体频谱研究中常用的代谢物提取方法,对提取方法的选择进行 号:30930027、国家自然科学基金面 一定的优化。方法 培养获取人脐带间充质干细胞,利用高氯酸perchloric acid, 上项目编号:60971075和汕头大学医 PCA提取细胞水溶性代谢物,利用甲醇/氯仿methanol-chloroform, M/C提取 学院基础与临床科研基金项目2010年 细胞脂溶性代谢物,并使用甲醇/氯仿/水一次性提取方法dual phase extraction, 支持。 DPE同时获取两种组分,对不同方法所得提取物干重进行配对样本t检验。利用 9.4 T 磁共振获取不同干重的水溶性及脂溶性提取物频谱,寻找能获得良好谱线 作者单位: 质量的提取物重量。结果 相比于DPE法,PCA对水溶性代谢物具有更高的提 1. 汕头大学医学院第二附属医院影像 取效率,M/C对脂溶性代谢物具有更高的提取效率。高场MRS能更敏感地检测 科,广东 汕头 515041 出低浓度的脂溶性物质,不足1 mg的脂溶性提取物就能得到良好的谱线质量, 2. 汕头大学医学院第二附属医院儿 而约6 mg的水溶性提取物才能得到较好的谱线。结论 可以利用PCA提取水溶 科,广东 汕头 515041 性代谢物联合M/C提取脂溶性代谢物,在获得更多代谢信息的同时达到对细胞 3. 汕头大学中心实验室, 广东 汕头 的充分利用。 515041 [关键词] 间充质干细胞;磁共振频谱;代谢物提取;优化 第一作者简介: Extraction methods optimization in high-field MRS study of 代海洋1985-,男,在读硕士, the human umbilical cord mesenchymal stem cells 医师。研究方向:影像诊断、磁 共振频谱及干细胞研究。E-mail: 1 1 1 2 2 DAI Hai-yang , HONG Bi-kai , XIAO Ye-yu , YANG Yu-ping ,MA Lian , CHEN d.ocean@163 3 1* Yao-wen , WU Ren-hua 1 Department of Medical Imaging, The Second Affiliated Hospital of Shantou 通讯作者: University Medical College, Shantou 515041, China 吴仁华,E-mail:rhwu@//0>. 2 Department of pediatrics, The Second Affiliated Hospital of Shantou University 收稿日期:2011-07-12接受日期:2011-09-25 Medical College, Shantou 515041, China 3 Shantou University Central Laboratory, Shantou 515041, China * 中图分类号:R445.2 Correspondence to: Wu RH, rhwu@//. Received 12 Jul 2011; Accepted 25 Sep 2011 文献标识码:A DOI: 10.3969/j.issn.1674-8034.2011.06.008 Abstract Objective: To explore the suitable cell extraction methods that most fit in vitro MRS study by analyzing the extraction efficiencies and detecting sensitivity, and to make some optimizations to the choice of different extraction procedures. Materials 代海洋,洪璧楷,肖叶玉,等. 用于高场 and Methods: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were cultured and MRS研究的人脐带间充质干细胞代谢 collected. The water-soluble metabolites were extracted by perchloric acid PCA and 物提取方法选择的优化磁共振成像, the lipid-soluble metabolites were extracted by methanol-chloroform M/C, and we 2011, 26: 430-434. employed a dual phase extraction DPE procedure by methanol-chloroform-water to get both fractions from the same cell batch. The net weights from different extraction methods were compared and analyzed using Student paired t-test. Results: Compared with the net yields from DPE, the PCA extraction procedure has a higher efficiency in extracting water-soluble metabolites while M/C is efficient in extracting lipid- soluble metabolites. MRS is highly sensitive in detecting extremely small quantity of lipid-soluble metabolites. Conclusion: We can employ PCA combined with M/C to obtain both water- and lipid-soluble metabolites for the efficient use of cells in MRS analysis. Key wordsMesenchymal stem cells; Magnetic resonance spectroscopy; Metabolite extraction; Optimization ?430? ////. 2011年第2卷第6期 Chin J Magn Reson Imaging, 2011, Vol 2, No 6 基础研究 | Original Articles 从组织或细胞中提取代谢物用于频谱检测是离 上层液置于低压冻干机冻干,下层液用高纯氮气吹 体MRS研究的常用方法,从一定量的样本中高效获 干。样本干燥后置-20 ?冰箱保存。 取足够提取物是频谱研究的前提。本研究对高场频 1.3 代谢物的9.4 T MRS检测 谱研究中常用的代谢物提取方法进行比较,综合分 用精密微量天平称量并 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 不同方法所提 析不同方法的提取效率及9.4 T MRS对水溶性及脂溶 取的细胞代谢物干重 m g ,其中水溶性部分溶 性提取物检测敏感性的差异,以此对高场MRS研究 解于0.5 ml含有一定量内标为三甲基硅烷丙酸钠 中代谢物提取方法的选择进行一定的优化。 3-trimethylsilyl propionic acid-d4 sodium salt, TMSP 的重水,脂溶性部分溶解于0.5 ml含内标为四甲基硅 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 烷tetramethylsilane, TMS的氘代氯仿,充分溶解后 1.1 人脐带间充质干细胞的获取 分别移入直径为5 mm的核磁测试管中,置于Burker 人脐带间充质干细胞来自于胎儿脐带的华尔 9.4 T 400 MHz, Bruker Avance, Switzerland核磁共振 通氏胶组织,利用组织块贴壁法进行培养,经原代 仪检测探头内。频谱采集参数为:含抑水脉冲的zgpr 及传代培养后可得到纯度达95%以上的间充质干细 序列,机器自动匀场,带宽为5 kHz,扫描次数为32 胞。本研究所用细胞均为第四代。 次,数据采集点为4096。分别获取水溶性及脂溶性 1.2 代谢物的提取 提取物的氢质子频谱原始数据,经傅里叶转换,基 1.2.1 高氯酸提取水溶性代谢物 线及相位校正后得到频谱图像输出。将频谱数据输 7 每个样本细胞数量为1.0×10 。吸净培养瓶中的 入微机,应用Bruker自带的频谱后处理软件Mestrec 培养液,用磷酸盐缓冲液phosphate-buffered saline, 4.7对谱线中主要代谢物的化学位移进行定位。 PBS冲洗2次,用细胞刮棒刮取细胞后移入离心管配 1.4 统计学处理 平离心条件1500 rpm, 5 min,弃去上清液收集细胞 每种方法样本数为12个,提取物干重mg以x?s 沉淀。细胞沉淀加入浓度为12%冰冻的高氯酸3 ml, 表示。PCA水溶性和M/C 脂溶性法所得提取物干 冰浴中进行超声波碎裂5 min,碎裂后将混合液置 重分别与DPE法所得相应部分进行配对资料的t -检 高速离心机离心以除去细胞碎片,离心环境0 ?、 验,数据分析采用SPSS 17.0软件包,P0.05为差异 13000 rpm,时间为20 min。离心后分离上清液,上 有统计学意义。 清液中加入1 mmol/L的氢氧化钾溶液进行中和,调 整pH至7.2,中和所产生的沉淀再次高速离心去除, 2 结果 条件同上。离心后上清液置于低压冻干机内冻干, 2.1 人脐带间充质干细胞的频谱代谢特征 样本干燥后置-20 ?冰箱保存。 1.2.2 甲醇/氯仿提取脂溶性代谢物 6 每个样本细胞数量约为1.5×10 ,细胞收集方 法同上。细胞沉淀加入1?2v/v冰冻的甲醇和氯仿 3 ml,涡旋震荡1 min,再加入0.5 ml的生理盐水,再 次震荡。震荡后混合液置4 ?静置24 h,静置后混合 液分层,下层液为氯仿层,其内含脂溶性代谢物, 分离后置离心管用高纯氮气吹干,样本干燥后置-20 ?冰箱保存。 1.2.3 甲醇/氯仿/水一次性提取水溶性及脂溶性代谢 物 7 每个样本的细胞数量约为1.0×10 ,细胞收集方 法同上。细胞沉淀先加入2?1v/v的甲醇和氯仿1.5 ml,冰浴中进行超声波碎裂5 min,再加入1?2 v/v 氯仿和双蒸水1.5 ml,震荡混匀。将混合液置离心机 图1 人脐带间充质干细胞水溶性提取物频谱特征。提取 离心,离心环境0 ?、13000 rpm,时间为20 min。 物分别来自于PCA和DPE法的水溶性部分 离心后溶液分层,其中上层液为甲醇和水的混合 Fig 1 Water-soluble metabolite profile of the human umbilical 物,其内含水溶性代谢物,下层为氯仿层,其内含 cord mesenchymal stem cells. Cell extractions were prepared by PCA and DPE method. 脂溶性代谢物。用微量取样器小心分离两层液体, ////. ?431?磁共振成像 2011年第2卷第6期 Chin J Magn Reson Imaging, 2011, Vol 2, No 6 基础研究 | Original Articles 人脐带间充质干细胞的水溶性提取物频谱中主 别如图1、2示。 要代谢峰有乳酸、醋酸、谷氨酸、苏氨酸、肌酸、 2.2 不同方法提取物产量 肌醇及胆碱复合物等;脂溶性代谢提取物频谱中主 PCA与M/C法所得提取物的干重分别与DPE法 要代谢峰为饱和及不饱和脂肪酸类等,特征谱线分 的水溶性及脂溶性部分 配对比较。PCA与DPE法使 图3 不同方法所得提取物产量。提取物分别由高氯酸 PCA、甲醇/氯仿M/C和甲醇/氯仿/水DPE法获得; 图2 人脐带间充质干细胞脂溶性提取物频谱特征。提取 **:P0.001 物分别来自于M/C和DPE法的脂溶性部分 Fig 3 Extraction yields of different methods. Metabolites Fig 2 Lipid-soluble metabolite profile of the human umbilical were extracted by PCA, M/C and DPE methods. **: P0.001 cord mesenchymal stem cells. Cell extractions were prepared by M/C and DPE method. 图5 不同干重的水溶性提取物谱线。所检测提取物分别 图4 不同干重的脂溶性提取物谱线。所检测提取物分别 为:a:1.4 mg,b:3.2 mg,c:5.6 mg 为:a:0.7 mg,b:1.5 mg,c:3.0 mg Fig 5 Spectra of the water-soluble metabolite extraction of Fig 4 Spectra of the lipid-soluble metabolite extraction of different net weights for detection. a: 1.4 mg, b: 3.2 mg, c: 5.6 mg different net weights for detection. a: 0.7 mg, b: 1.5 mg, c: 3.0 mg ?432? ////. 2011年第2卷第6期 Chin J Magn Reson Imaging, 2011, Vol 2, No 6 基础研究 | Original Articles 7 用的细胞数量为1.0×10 ,M/C法使用的细胞数量 而DPE法虽能同时获得两类代谢提取物,其提取效 6 为1.5×10 ,PCA所得水溶性提取物干重9.64?0.65 率特别是对水溶性代谢物的提取效率相对较低。虽 mg与DPE法的水溶性部分干重2.95?0.35 mg之 然本研究中DPE与M/C法所获得的脂溶性提取物干重 间存在显著性差异P 0.001,M/C所得脂溶性提取 没有统计学差异,然而从DPE法处理的同一细胞样 物干重2.52?0.30 mg与DPE法的脂溶性部分干重 本中所得的水溶性部分却不足以获得良好的谱线质 2.83?0.43 mg之间无显著性差异P0.05,然而考 量,要想利用DPE法获取足够的水溶性提取物供检 虑到所使用细胞数量的显著差异,M/C法仍是提取 测,则须增加所使用的细胞数量,而这无疑又大大 脂溶性代谢物的高效方法图3。 增加了研究的工作量。 2.3 9.4 T MRS对水溶性及脂溶性提取物检测的敏感 利用高场磁共振对不同干重的提取物进行频谱 性 检测,发现极少量的脂溶性提取物就可以得到较好 称取不同干重的水溶性和脂溶性提取物进行频 的谱线质量,而要得到良好 的水溶性代谢物谱线则 谱检测,方法同1.3,以能获得清晰明显的代谢峰及 需要更多的提取物。由于脂溶性提取物频谱中大部 平滑的基线作为评价谱线的质量的简易标准。在脂 分代谢组份为饱和及不饱和脂肪酸类,其在氘代氯 溶性提取物谱线中,不足1 mg的提取物就可以得到 仿中具有良好的溶解性且化学结构中含有丰富的氢 平滑的基线及数个明显的代谢峰,而在水溶性提取 质子,这可能是较少的脂溶性提取物即能获得良好 [12] 物谱线中,约6 mg的提取物才可以得到良好的谱线 谱线质量的原因 。在PCA法所得的水溶性提取物 质量图4、5。 谱线中,可以看到位于1.28 ppm处代表不饱和脂肪酸 的亚甲基峰-CH2-及位于0.89 ppm处代表饱和脂肪 [13] 3 讨论 酸的甲基峰-CH3 ,而在DPE所得水溶性部分提取 磁共振频谱技术是利用磁共振化学位移现象来 物谱线中,这两个位置并未检测到明显的代谢峰, 才测定组成物质的分子成分的一种检测技术,亦是 这也从一定程度上说明溶剂的选择对代谢物提取效 目前惟一可测得活体组织代谢物的化学成分和含量 率会有一定的影响。 的检查方法,磁共振频谱已广泛运用于良恶性疾病 综合本实验的研究结果, 我们认为可以利用 [1-3] 的鉴别、疗效评估及随访中 。间充质干细胞具有 PCA提取细胞的水溶性代谢物联合M/C提取脂溶性代 强大的增殖能力和多向分化潜能,在组织损伤修复 谢物,在获得两类提取物频谱特征的同时,达到对 [4-5] 及再生医学中具有广阔的应用前景 。干细胞的磁 细胞的合理利用和减少研究工作量的目的。虽然该 共振频谱特征研究已见报道,其频谱信息的明确对 提议额外增加了利用M/C法提取脂溶性代谢物的过 干细胞生物学特性研究,干细胞凋亡、分化及移植 程,却大大减少了细胞的使用数量及繁琐的细胞培 [6-7] 后生理状态的监测有重要意义 。 养的工作,具有更高的可操作性和实用价值。虽然 提取细胞或组织代谢物进行检测是高场MRS研 本研究是对人脐带间充质干细胞代谢物提取效率的 究的常用方法,目前常用的是利用高氯酸提取水溶 比较,我们在进行肺癌细胞、小鼠成骨细胞的代谢 [8] 性代谢物,利用Tyagi等 介绍的甲醇/氯仿1?2v/ 物提取时亦得到相同的 结论,因此该方法具有较强 [9-10] v法提取脂溶性代谢物,后来Bligh等 对Tyagi的 的可推广性。然而我们认为在对活体组织进行代谢 方法进行改进,使用甲醇/氯仿/水1?1?1v/v/v从 物提取时,由于取材的限制性相对较小,亦可以考 同一批细胞或组织样本中一次性地提取出两类代谢 虑使用DPE法进行提取。 物。在细胞的频谱研究中,由于所使用的细胞数量 综上所述,在代谢提取物的高场MRS研究中, 较大,细胞培养的工作量不可忽视,利用较少的细 可以根据不同方法的提取效率及MRS对水溶性和脂 胞数量高效地获得较多提取物供检测以及能同时获 溶性代谢物检测敏感性的差异,对提取方法的选择 得细胞水溶性与脂溶性的全面代谢特征信息是频谱 进行一定的优化,在获取细胞全面代谢特征信息的 研究所期望的,从该角度看,DPE法似乎是较合适 同时达到对细胞的合理利用及工作量的简化。 的备选 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。DPE是由经典的M/C法经改进而来, [11] Belle等 研究发现,DPE对水溶性代谢物特别是对 参考文献 [References] [1] Huang MQ, Nelson DS, Pickup S, et al. In vivo monitoring 谷氨酸及胆碱复合物等具有良好的提取效果,而其 response to chemotherapy of human diffuse large B-cell 研究并未对DPE与PCA及M/C的提取效率进行分析比 lymphoma xenografts in SCID mice by 1H and 31P MRS较。我们的研究 发现,作为经典的PCA和M/C法, Acad Radiol, 2007, 1412:1531-1539. 其对水溶性及脂溶性代谢物提取效率较DPE法高, [2] Peng J, Luo TY, Lv FJ, et al. Elevated Lip signals on 1H- ////. ?433?