经内镜粘膜下注射硬化剂治疗支气管胸膜瘘的动物实验研究和临床

经内镜粘膜下注射硬化剂治疗支气管胸膜瘘的动物实验研究和临床 复旦大学 硕士学位论文经内镜粘膜下注射硬化剂治疗支气管胸膜瘘的动物实验研究和 临床疗效分析 姓名:张春荣 申请学位级别:硕士 专业:外科学 指导教师:郑如恒 20060418硕士论文 中文摘要 中文摘要第一部分,，)大鼠气管粘膜下注射硬化剂后,,,,、,,,的表达及 光镜、电镜观察目的 研究,,大鼠气管粘膜下层经硬化剂刺激后,,,,、,,,的表达以及观察光镜下粘膜下层微血管的形成和电镜下成纤维细胞的增生。材料与方法 将,,大鼠,,只随机分成正常组、空针对照组和硬化剂组三大组，正常组,只，空针对照组和硬化剂组各,,只，后两组按第,、,、,和,天四个时间点各,只。正常组不作任何处理，空针对照组仅用空针刺激气管粘膜下层，硬化剂组用,,乙氧硬化醇,(,,,,气管粘膜下注射，分别在第,、,、,和,天取下气管标本作,,染色和,,,,、,,,免疫组化染色，用，,,,, ,,, ,,,, ,(,图像分析软件对每张免疫组化染色切片进行半定量分析面积比值和积分光密度，两组间及组内比较用,检验。在光镜下观察粘膜下微血管的变化，并在电镜下观察成纤维细胞的增生变化。结果 ,(光镜下空针对照组粘膜下微血管比正常组增多，硬化剂组粘膜下微血管比空针对照组明显增多。,(电镜下硬化剂组成纤维细胞在从第,天开始明显增多，并有胶原纤维形成，第,天达到高峰，胶原纤维变致密，并出现弹力纤维，至第,天成纤维细胞开始破碎、分解。,(空针对照组,,,,面积比值和,,,,积分光密度均高于正常组(,,,(,,);硬化剂组在各个相应时间点的,,,,面积比值和,,,,积分光密度均明显高于空针对照组(,,,(,,)。硬化剂组组内比较，,,,,面积比值第,天高于第,天(,(,(,,)，而第,、,和,天的比较无明显差异(,,,(,,);积分光密度第,天明显高于第,天(,《,(,,)，第,和第,天无明显差异(,,,(,,)，而第,天又高于第,天(,,,(,,)。,(空针对照组,,,面积比值和积分光密度均比正常组高(,,,(,,);硬化剂组在各个相应时间点的,,,面积比值和,,,积分光密度均明显高于空针对照组(,,,(,,)。硬化剂组组内比较，,,,面积比值和,,,积分光密度第,天明显高于第,天(,,,(,,)，第,天和第,天无明显差异(,,,(,,)，而第,天,,,面积比值明显高于第,天(,(;,(,,)，第,天,,,积分光密度也高于第,天(,,,(,,)。结论 ,(空针能够刺激,,大鼠气管粘膜下层,,,,和,,,的表达和微血管的增生;,(硬化剂能够明显促进,,大鼠气管粘膜下层,,,,、,,,的表达和微血管的形成以及成纤维细胞的增生:,(硬化剂刺激作用的高峰时间在第,,,天。关键词 ,,乙氧硬化醇;粘膜下层;,,,,;,,,;微血管;成纤维细胞硕士论文 中文摘要第二部分经纤维支气管镜粘膜下注射硬化剂治疗支气管胸膜瘘的 临床疗效分析目的 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 本院采用经纤维支气管镜粘膜下注射,,乙氧硬化醇的方法治疗肺切除术后支气管胸膜瘘的临床疗效。材料与方法 自,,,,年,月到,,,,年,月，共有,例肺切除术后支气管胸膜瘘患者接受经纤维支气管镜,,乙氧硬化醇粘膜下注射治疗。其中男性,例，女性,例，平均年龄为,,(,岁(,,,,,岁)。,例患者中,例为左全肺切除术后支气管胸膜瘘， ,例患者发生于肺叶切除术后，其中,例为左上肺叶切除术后，,例为左下肺叶切除术后，,例为右中下肺叶切除术后，,例为右下肺叶切除术后。手术方法:常规采用全身麻醉，经气管插管置入纤维支气管镜，确定瘘口位置，仔细观察瘘口情况，然后经过纤维支气管镜的操作孔置入内镜的注射器， 在气管镜直视引导下将注射器针头在距瘘口,(,,,(,;,处插入瘘口周围粘膜下，注入,(,,,,,乙氧硬化醇。根据瘘口大小每个瘘口周围注射,到,点。结果,例患者中,例获得痊愈，,例治疗失败，其中,例行带蒂背阔肌移植术后痊愈，另,例留置永久胸腔引流出院。,例治疗成功患者平均注射次数为,(,次(,,,次)，平均治疗时间为,,(,天(,,,,天)。注射次数以及住院时间与瘘口大小有一定的相关性，瘘口小于,,,的,例患者平均注射次数为,(,次。而瘘口大于,,,的,例患者注射次数分别为,次和,次。术中及术后均未发生严重的并发症。结论 经纤维支气管镜,,乙氧硬化醇粘膜下注射治疗支气管胸膜瘘是一种安全、有效而简便的方法，可以重复注射，患者容易接受。关键词 支气管胸膜瘘;纤维支气管镜;,,乙氧硬化醇;粘膜下层硕士论文 英文摘要 ,,,,,,;,,,,, ,:,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,, ,,, ,, ,, ,,,,’,,,;,,, ,,,,,;,,, ,,,,, ,,,,;,,,, ,,,, ,,,,,,;,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,; ,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,, ,, ,,,;,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,,(,,,,),,, ,,,,,, ,,,;,, ,;,,,(,,,),, ,, ,,,,’,,,;,,, ,,,,,;,,, ,,, ,, ,,,,,,, ,,,;,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,; ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,;,,,,(,,,,,,, ,, ,, ,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,(, ,,,,)，,,,,, ,,,,,,,,,,;,,,,(,, ,,,,),,, ,,,,,,;,,,, ,,,,;,,,,(,, ,,,,),,,,,(,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,？,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,;;,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,, , ,, ,,,，,,, ,,,，,,,,,, ,,, ,,, ,,,(,,,, ,,,,’,,,;,,, ,,,,,;,,, ,,,, ,,,,;,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,(,,,, ,,,,,,,,;,,,,，,,, ,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,;,(,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,),, ,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,，,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,;,,,, ,,;,,,;,,,,(,,, ,,, ,,,, ,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,,(，,,),, ,,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,, ，,,,, ,,,,,,, ,(, ,,,,,,,,(,,,,,,, ,(,;;,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,;,,,;,,,:,,, ;,,,,,,,, ,, ,,,;,,, ,,,,,;,,,试,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,，,,, ,,,, ,,;, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,;,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,(,(,;;,,,,,, ,, ,,, ,,,;,,,, ,,;,,,;,,,:,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,;,,,, ,,,,;,,,, ,,,,, ,,,, ,,;, ,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,(,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,;,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,;,,, ,,,, ,,, ,,, ,,, ,, ,,, ,,, ,,,(,(,,, ,,,, ,,,;,,,,,, ,,, ，,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,(,,,(,,)，,,, ,,,, ,,;, ,,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,;,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,(,,,(,,)(,,,,,, ,,, ,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,，,,, ,,,, ,,,;,,,,,, ,, ,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,, ,,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ,,,(,,,(, ,, ,,,,,,,,;, ,,,,, ,,)，,,, ,,,,, ,,,, ,, ,,,，,,, ,,, ,,, ,,,(,,,(,,);,,, ，,, ,, ,,,, ,,, ,,;, ,,,,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,, ,,, ,,,(,,,(,,)，,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,, , ,, ,,,,,,,,;,,(,,,(,,)，,,, ,,,,, ,,,, , ,,,,,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,(,,,(,,)(,(,,, ,,,,,,,;,,,,,, ,,, ，,, ,, ,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,(,,,(,,)，,,, ,,,, ,,;, ,,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,;,,,,,,,,;,,,, ,,,,,(,,,(,,)(,,,,,, ,,, ,,,,,,;,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,，,,, ,,,, ,,,;,,,,,,,, ，,, ,,,, ,,;, ,,,,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ,,,(,,,(,,)，,,, ,, ,,, ,,,, ,,,硕士论文 英文摘要,,;, ,,,,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ,,,(,,,(,,)，,,, ,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,;,,,,,,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,(,,,(,,);,,, ，,, ,,,,,, ,,, ,,;, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ,,,(,,,(,,)(,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,,(,,,(,,)，,,, ,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,;, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,，,,, ,,,(,,,(,,)(,,,;,,,,,,, ,(,,,,, ,,,,,, ;,, ,,;,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,’,,,,,;,,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,, ;,,,,,,,, ,,,,,,,,,(,(,,,,,,;,,,, ;,,,,,,,,;,,, ,,;,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,, ,,, ,, ,, ,,,,’,,,,,;,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,, ;,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,(,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,;,,,, ,,,, ,,, ,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,(,,, ,,,,, ,,,,,,;,,,,;,,,,,;,,,;,,,,;,,,;;,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,, ,:,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,(,,,),,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,,, , ,,,,,,,, ,,,,;,,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,;, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,谢,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,;,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, , ,,,,,,,, ,,,,; ,,,, ,,, ,,,,,,,,,(,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,，, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,;,,,,,,,,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,(, ,,, ,,, , ,,,,,，,,,, ,,,,,,(, ,,,,,),,,, ,,,,,,,晰,,,,,,,,, ,,,,,;,,,, ,,,,;,,,, ,, ,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,;,,,; ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, , ,,,,,,,, ,,,;,,,;,,,，,,;,,,,,, , ,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,, ,,, , ,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,(,,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,(,,,,,,(,,,),, ,,,,,,,,(,,,,,,, , ,,,,,,,,、:,,,,, ,,,,,, ,,;;,,,,,,,,(,,,, ,,, ,, ,;;,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,，, ;,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,;,; ,,,,;,,,,，,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,?澹幔耄幔纾?,, ,,, ,,,,, ;,,, ,,, ,,, ,,,, ,,, ,,,;, ,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,;,,,(,,;,,,,,;,,,,,, ,;;,,,,, ,,, ,, ,,, ,,,,;,,,, ,,,,, ,,,,(,,,;,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,(,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,, ;,,,,,,,,, , ,,,,, ,,,,,,,,,,;,,,,,,;,，,, ,, ,, , ,,,,,,，,,,,，,;,,;,,, ,,,,,,,,; ,,, ,,,,;,,,,(,,, ,,,,, ,,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,;,,,,,,,, ,,,,;,,,;,,,;,,,,,,;,,,,;,,,,,;,,, (,,硕士论文 前言 前言 支气管胸膜瘘(,,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,,)是支气管树与胸膜腔之间形成的窦道。其发生与感染、损伤和胸部手术等有关，但是最为常见的原因还是既往的肺部手术史。根据统计，支气管胸膜瘘,,,发生于肺部手术之后，发 生率为,,,,,，全肺切除术后最为多见，发生率为,,,,,,“,。国外文献报道肺手术后支气管胸膜瘘的发生率为,(,,,,,,,“,。患者身体状况差、放化疗、术中清扫淋巴结对支气管残端血运的破坏、术后机械通气，以及合并结核、糖尿病等都是支气管胸膜瘘的易发因素。近年来，随着对解剖结构的深入了解、手术技巧的提高、手术辅助器械的运用，以及围手术期处理方法的改进，肺切除术后支气管胸膜瘘的发生率正在逐渐减少。但是，一旦发生支气管胸膜瘘，临床处理仍然十分棘手，死亡率高。 目前支气管胸膜瘘的治疗方法主要有内科保守治疗、内镜下治疗和手术治疗。,,,,,,,等”,于,,,,年首次报道经气管镜用导引钢丝和球囊导管将带线的铅丸置于瘘口，待瘘口闭合后再将铅丸取出，成功治疗了支气管胸膜瘘，开创了经气管镜治疗支气管胸膜瘘的先河。经气管镜治疗支气管胸膜瘘，因其具有简便、安全和有效等特点，近年来发展较为迅速，国内外研究颇多。经气管镜治疗支气管胸膜瘘的具体方法包括用组织粘合剂、纤维蛋白胶、氰基丙烯酸盐粘合剂、明胶海绵、抗生素等直接封闭瘘口，用无水酒精、硬化剂等在瘘口周围粘膜下注射，用激光或硝酸银烧灼瘘口周围粘膜，以及放置支气管内支架或支气管内瓣等。 ,,,,,,等人“,于,,,,年报道经纤维支气管镜在瘘口周围粘膜下注射硬化剂治疗支气管胸膜瘘获得成功。也有报道用组织粘合胶、无水酒精等粘膜下注射成功治疗支气管胸膜瘘。“,。国内有报道用,,三氯醋酸粘膜下注射治疗支气管胸膜瘘“…。经内镜支气管粘膜下注射的治疗方法，据推测其主要作用机制是刺激粘膜下层形成肉芽组织，以达到封堵瘘,,的目的。但是目前尚未见到有关这方面动物实验研究的报道，国内尚未开展用硬化剂粘膜下注射治疗支气管胸膜瘘。 内镜下硬化剂注射治疗食管静脉曲张破裂出血己被临床广泛推广运用，其止血、预防出血的疗效已为大量的临床随机对照研究所肯定““。硬化剂注射疗法的机理是将能使血管产生炎症影响的硬化剂注入到曲张的静脉内，使静脉内膜受化学刺激产生无菌性炎症，血管内膜损伤，伴有不同程度的血栓形成，纤维组织增生，血栓机化为纤维组织所代替，使管腔变窄，纤维组织收缩使曲张的静脉管腔粘连、闭塞或栓塞，从而阻滞血流进入曲张的食管静脉，降低了静脉内压力，解除了静脉曲张的静脉壁薄弱、静脉压力升高的诱因，达到临床治疗急性食管静脉曲张破裂出血、预防再出血的目的。乙氧硬化醇(,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,)是硕士论文 前言硬化剂的一种，,,,,,,, ,等“”报道乙氧硬化醇具有损伤轻、愈合迅速、毒副作用小等特点，是治疗、预防食管静脉曲张破裂出血相对理想的硬化剂。 本实验第一部分用,,乙氧硬化醇在,,大鼠气管粘膜下注射后在光镜下观察微血管的形成和在电镜下观察成纤维细胞的增生情况，并分析其,,,,、,,,的表达，以了解肉芽组织增生的过程及特点，为临床使用乙氧硬化醇治疗支气管胸膜瘘寻找理论依据。第二部分总结并分析了经纤维支气管镜粘膜下注射,,乙氧硬化醇治疗支气管胸膜瘘的临床疗效。硕士论文 第一部分 第一部分 ,,大鼠气管粘膜下注射硬化剂后,,,,、,,,的表达及 光镜、电镜观察 材料和方法一(实验材料 ,(实验动物: 雄性,,大鼠(复旦大学医学院实验动物中心提供),,只，,,,级，,月龄，体重,,,,,,,,，在中山医院实验动物房普通饲养，自由进食标准颗粒饲料及饮水。具实验动物合格证书，编号:,,,,(沪),,,,,,,,,,。 ,(实验试剂: 戊巴比妥钠(,,,,,,支) 上海晶美生物工程公司(配置成 浓,(,,，,”,保持) 阿托品(,(, ,,,,,) ,,,,,公司 ,,乙氧硬化醇(,,,,,瓶) 德国产 一抗: 鼠抗人,,,,单克隆抗体(,,,,;,,,,, ,,,,, ,,,,?,,,,, ，,,,,， ,,,,,,,,) 上海基因技术生物有限公司 鼠抗人,,,单克隆抗体(,,,,;,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,;,,,;,,, ，,,,,，,,,,,,,,) 上海基因技术生物有限公司 二抗: 二步法抗兔，鼠通用型免疫组化检测试剂盒(,,,,,,,,,,,,,,,,,,， ,, ,,,, ,,,,,) 上海基因技术生物有限公司 ,(实验设备 手术显微镜 上海手术器械厂 眼科手术器械一套 上海医疗器械有限公司 ,—, ,,,,,,,缝合线 强生医疗器械有限公司 徕卡显微镜(,,,;, ,;,,) 德国,,,;,公司 ，,,,, ,,, ,,,, ,(,图像分析软件 美国,,,,, ,,,,,,,,;,公司 ,,(,,,透视电子显微镜,,，,，,,二(实验方法: ,(实验动物分组:硕士论文 第一部分 将,,只,,大鼠随机分正常组、空针对照组和硬化剂注射组三大组。分别于第,、,、,、,天取下气管标本送检。具体分组如下: 正常组: ,只(不作任何处理) 空针对照组: ,,只(空针刺激粘膜下层)(第,、,、,、,天各,只) 硬化剂注射组: ,,只(硬化剂粘膜下注射)(第,、,、,、,天各,只) ,(操作过程: 将,,大鼠用,(,,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(按,,,,,,,剂量注射)，加用,(，,,的,(,,,,,,阿托品腹腔注射，过十分钟左右麻醉成功，剪去颈前毛发，用橡皮筋将四肢和头部固定于操作板，成仰卧式，并使颈部抬高，,(,,碘伏消毒颈前皮肤,遍，沿中线剪开皮肤，长约,;,，逐层分离皮下、颈前筋膜至气管前壁，用眼科镊钝性加锐性分离气管两侧壁和后壁，抬高固定气管，沿气管软骨环横形切开气管前壁，长约气管周径的,,,，在手术显微镜下将,,乙氧硬化醇,(,,,,注射到气管粘膜下层的,点和,点处，见到粘膜隆起，稍发白，然后彻底止血，用,—, ,,,,,,,缝线间断缝合气管前壁,针，检查无漏气，,号丝线逐层关闭切口。 空针对照组操作基本同上，在注射时使用空针针尖刺激气管粘膜下层。 手术结束后将大鼠继续普通饲养，并分别在第,、,、,和,天取下气管标本。三(标本切片制作: ,(,,染色切片制备 ,) 取材和固定:把,,大鼠杀死后，立即割取气管组织块，并快速投入 ,,,的甲醛固定液中; ,) 冲洗:用水冲洗，以洗去固定液; ,) 脱水:按酒精梯度，将材料经,,,酒精一,,,酒精一,,,酒精(，) 一,,,酒精(，，)一无水酒精(，)一无水酒精(，，)，各级酒精,, ,小时; ,) 透明:将脱水后的材料经,:,无水酒精与二甲苯一二甲苯(，)一二 甲苯(,,)，各级时间为,(,,,小时; ,) 浸蜡:将透明后的组织块浸入融化的石蜡中,,,小时; ,) 包埋:修正蜡块使切面平整，将蜡块用刀片修整成上下两边平行的正 方形或长方形; ,) 切片:在旋转式切片机上将蜡块切成,,, ,,,厚的薄片。切下的薄片 蜡带，用毛笔轻轻取下蜡带，放在蜡带盒内备用; ,) 贴片:将蜡片粘贴在载玻片:硕士论文 第一部分 ,) 染色:将蒸馏水洗涤后的切片移入,,,,,,苏木精液中,,,,,,,,，使 细胞核着色。用自来水洗去切片上残余的染液。用,,盐酸酒精分色 数分钟。分色时随时用显微镜检查切片，使分色适度。在蒸馏水中浸 片刻后将切片入,,,酒精一,,,酒精一,,,酒精各,,,,,,。再入,(, ,品红酒精溶液中染色,,,,,,，使细胞质着色。 ,(免疫组化染色 切片制备: ,) 脱蜡、水化: ,),,,洗,,,次各,,,,,: ,) ,,,,,,(,,,甲醇)滴加在载玻片上，室温静置,,,,,: ,),,,洗,,,次各,,,,: ,) 抗原修复:采用石蜡切片高压抗原修复方法。取,,,(,的构椅酸盐缓冲 液,,,,,,注入高压锅内，电炉加热至沸腾。将切片置于金属架上，放 入锅内，使切片位于液面以下，盖高压锅盖，并加盖高压阀门。当高 压锅开始慢慢喷气时(约加热,,,,,,)，计时,,,,,,，然后将高压锅 端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片;( ,),,,缓冲液冲洗,次，每次,,,,: ,) 滴加正常山羊血清封闭液，室温,, ,,,，甩去多余液体; ,) 滴加，抗,,,,，室温静置,小时，,。,过夜; ,),”,过夜后在,,?复温,,,,, ,,),,,洗,次各,,,,: ,,)滴加?抗,,,,,,,，室温静置,小时; ,,),,,洗,次各,,,,: ,,),,,显色,,,,,,,，在显微镜下掌握染色程度; ,,),,,冲洗,,,,,: ,,)苏木精复染,,,,，盐酸酒精分化; ,,)自来水冲洗,,,,,,,,: ,,)脱水、透明、封片、镜检。 ,(透视电镜样品制备 ,) 取材暴露大鼠气管后，用刀片快速切下所需组织，切成,×,,,,,小 条，放入电镜固定液中，标写编号，,。,冰箱保存。 ,) 固定,(,,戊二醛，磷酸缓冲液配制固定 ,小时 用,(,,磷酸漂洗液漂洗 ,,’×, ,,锇酸固定液固定 ,,,小时 用,(,,磷酸漂洗液漂洗 ,,’×,硕士论文 第,部分 ,) 脱水 ,,, ’,,,’ ,, ,,,, , ,,,乙醇 ,, ,,,, , ,,,乙乙醇 ,, 醇 ,,,乙醇,,,丙酮 (,:,) ,,’,,,’ , ,,,丙酮 ,,’,,, 以上在,”,冰箱内进行 ,,,,丙酮 室温 ,,’,,,’,, ,) 浸透 纯丙酮，包埋液(,:,) 室温 ,,,小时 纯丙酮，包埋液(,:,) 室温 过夜 纯包埋夜 ,,? ,,,小时 ,) 固化 ,,?烘箱内 过夜 ,,?烘箱内 ,,小时 ,,?烘箱内 ,,小时 ,) ,,,—，型超薄切片机切片,,,,,衄 ,) ,,醋酸铀一枸橼酸铅双染色 ,),,，,，,, ,,(,,,透视电镜观察，拍片四(切片成像和免疫组化半定量分析 在徕卡显微镜下，先用低倍镜(, ,,,)观察并选取目标视野，然后在高倍镜(,,,,)下对每张切片拍摄,张图片。,,,,和,,,免疫组化染色切片应用，,,,, ,,, ,,,, ,(,图像分析系统对每张染色图片进行半定量分析。测定粘膜下层阳性信号的面积，进行分析并统计得到阳性染色面积占选定分析总场面积的比值 (放大倍数和选定分析总场面积一致)，同时测定阳性信号的积分光密度 (,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,, ，,,)(系统尺寸定标和光密度定标一致)，取平均值。积分光密度值与染色强度呈正相关。五(统计学分析 采用,,,, ,,。,统?迫砑 型臣蒲Т 恚 惺笛槭 莶捎镁 勘曜疾睿ǎ 溃樱?硎尽,屏孔柿辖 械ヒ蛩胤讲罘治觯 榧浜妥槟诒冉喜捎茫艏煅椋 校迹埃 埃等衔 哂型臣蒲б庖澹 校迹埃 埃比衔 哂懈叨韧臣蒲б庖濉?结果一(显微镜下,,染色观察结果 在低倍镜下，经由空针和硬化剂刺激后的,,大鼠气管粘膜下层与周围未作处理的正常部位相比可见增厚，在硬化剂组尤为明显。在高倍镜下，正常,,大硕士论文 .