蒙古族X连锁先天缺失牙／头发卷曲家系EDA基因新错义突变的发现

蒙古族X连锁先天缺失牙／头发卷曲家系EDA基因新错义突变的发现 蒙古族X连锁先天缺失牙,头发卷曲家系 EDA基因新错义突变的发现 2004年10月 第24卷第5期 基础医学与临床 BasicMedicalSciencesandClinics 0ctober2004 Vo1.24No.5 文章编号:1001.6325(2004)05-0509-05 蒙古族x连锁先天缺失牙/头发卷曲家系EDA基因 新错义突变的发现 白海花,张昕原,邱长春”,顾明亮,吉日木图,赵宏林,赵文海, 侯淑琴.,周文郁,吴柒柱,白玉华 (1.内蒙古民族大学,通辽028000;2.中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所 医学分子生物学国家重点实验室,北京100005) 摘要:为鉴定蒙古族x连锁先天缺失牙/头发卷曲家系外胚层发育不全无汗综合征致病基因(EDA)突变类型及其 与 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型的关系,本文以七代患有先天缺失牙的蒙古族大家系为研究对象,应用聚合酶链反应产物直接测序(PCR/Se. quencing) 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 每个成员EDA基因第一外显子碱基突变及其部位.测序结果显示,先证者及其他男性患者EDA基因 第一外显子193位的胞嘧啶被鸟嘌呤取代,均为193G/G纯合基因型,193C-~G颠换是一种新的错义突变,导致胞外 区65精氨酸转变为甘氨酸(R65G).先症者母亲?8为193C/G杂合基因型,牙齿正常.携带193G/C杂合基因型女 性临床表型为V3表现11,21,31,41缺如,V3l表现l2,22缺如,两者均伴有头发卷曲,而V1,V6,V8,V11,V20, V46及?l0,?3等牙齿数目及形态均无明显异常,头发无卷曲.综上所述,该蒙古族大家系中EDA基因第一外显 子193位c—G颠换引起的错义突变,是导致其发病的主要分子机制之一.但携带193G突变等位基因杂合基因型 女性表型各异以及男性患者表现度不一致的机制有待深入研究. 关键词:先天缺失牙;EDA基;基因型;表型 中图分类号:文献标识码:A 外胚层发育不全无汗综合症(anhydfiteectoder— micdysplasia,EDA)是以毛发,汗腺,牙齿等外胚层来 源组织发育不全或形态缺陷为特征的先天性遗传 病,人群中患病率约十万分之一.该类疾病的典型 l临床表现为少汗或无汗,毛发稀疏或全无,牙齿缺如 或牙齿形态异常等,群体中表型和基因型存在高度 异质性.EDA一般呈x连锁隐性遗传,男性表 型明显且l临床症状严重者多为携带突变致病基因的 纯合子.携带突变致病基因杂合子女性,通常无明 显表型或表型变化轻微. 外胚层发育不全无汗综合症(EDA)的致病基因 已被克隆,定位于x染色体短臂xp12—13.1区,分 别命名为EDA,EDAR和EDARADD.EDA基因编 码的蛋白质属于肿瘤坏死因子(TNF)配体家族.而 EDAR,EDARADD基因编码的蛋白质属于TNF受体 家族.大量研究资料表明,EDA基因极易发生突 变.据报告,碱基突变可分布于1,9外显子,内含 子及其连接处,从而导致EDA基因编码蛋白质功能 改变. 本文应用聚合酶链反应结合序列分析(PCR/Se— quencing),首次鉴定一个7代患有先天缺失牙同时 伴有头发稠密乌黑且卷曲临床特征的蒙古族大家系 成员的EDA基因第1,9外显子的新突变类型及其 与表型的关系. l材料与方法 1.1临床资料 1.1.1病例:先症者(?9),男,14岁.临床表现为 仅有16颗牙齿,由于无4颗第二双尖牙胚而第二乳 磨牙未脱落滞留,除4颗第二乳磨牙和4颗第一磨 收稿日期:2004—09—08修回日期:2004—09—10 基金项目:国家自然科学基金(30393139);东营协和基因技术有限责任公司资助 通讯作者:010—65296429;Dr.Qiu@163.com 5IO基础医学临床BasicMedicalSciencesandClinics 牙外其余牙齿形态异常呈锥形 曲状(图1),皮肤.汗腺等正常 排列稀疏+头发呈卷型特征.女性携带者中v3牙齿1121,3l,41缺如 1】.2家系资料:该家系为t代患订先天缺失牙 (图2).现生存的男性患者l4人,男性患者都表现 为先天缺失牙,但男-陛患者牙卣的数最,缺失部位不 同,患者牙齿最少有7颗,最多有2(】颗牙..牙齿形 态大部分异常:牙齿缺失者均有头发卷曲等共同表 f-79 V3112,22缺如,头发卷曲其他携带者牙齿数目, 形态均为正常. 1.2方法 I2.1基因组DNA提取:按常规用酚,氯仿方法从 外周血白细胞中分离提取基因组DNA,纯度达到 0D260/0I)280?I8= b 图1先证者临床表型特征 Fig1Clinicalfeaturesoftheproband B.Thepn~band14year~oktinm)…view-lloni,ml?~hapedteethinV:6:sc~dphairisthickwavy:hRadifJ grophsh~wingofte ethposition 图2蒙古族先天缺失牙/头发卷曲家系谱围 Fig2Pedigreeofthefamilywithx-linkedEDcongenitalanodotia/dense-wavy. hair rheprobandisirldicated~e,,ithan~FYI3WCarriermindicaled0.affectednesby?1aff~?tedfemalesby? Iaml 13orma[individualsnpensymbols.{【Iasll10. 一 2004.24(5)基础医学与临床BasicMedicalSciencesandClinics511 1.2.2第一外显子的PCR扩增:参照文献.设计 合成PCR扩增所用引物.扩增体积25L,含模板 DNA0.05,0.10g,上下游引物各4pmol,dNTP各 2mmo1/L.5L5×缓冲液(Tris.HC110mmol,pH8.0, 2mmol,LMgC1,,50mmol/KC1).TaqDNA聚合酶 0.5U(上海复华公司产品). PCR扩增参数:94?预变性3rain后,按94?, 40s,66?/40s,72?/40s程序,循环30周,72? 再延伸5min.PCR产物经2%琼脂糖电泳20rain, 紫外灯下观察并记录结果. 1.2.3基因突变分析:PCR产物经羟基磷灰石柱层 析(QiaquickPCRpurificationKit,Germany)纯化.应用 双脱氧末端终止法分析核苷酸序列(PE.ABI377 DNA自动荧光测序仪).测定结果与GenBank核酸 数据库相应序列比对,确定变异核苷酸所在位置和 类型. 2结果 2.1临床生化指标 本研究比较了该家系中受累与非受累成员血浆 中某些生化指标的变化.经分析两组间BUN CREUATGTC,HDL-CLDL-C,ApoAl ApoB及LD(a)水平无明显变化.而血清免疫指标 (表1)有所不同.ASO虽都在正常水平范围内,但 先天缺失牙患者ASO水平低于表型正常者,两组间 差异明显(P<0.05);两组群体CRP水平均超过汉 族人正常值水平,但组间无明显差异. 表1畸形少齿患者与表型正常家系成员 血清免疫学参数比较 Table1Comparisonofsomeimmunologicparameter betweenaffectedandnormalindividualsin theMongolianfamilywithx-linkedcong- enitalanodotia/wavyhair(k-?s) P<0.05comparedwithnormal 2.2EDA基因新错义突变的发现 该家系所有成员EDA基因第一外显子PCR扩 增产物片段长为686bp,测序结果如图3,其中a为 表型正常者,b为先症者,C为先症者母亲.将测序 结果与GenBank比对,发现表型正常的蒙古族EDA 基因第一外显子碱基序列与GenBank给定序列一 致.但先证者EDA基因第一外显子434位(相当外 显子193位)的胞嘧啶被鸟嘌呤取代,发生193c—G 颠换,使正常密码cGC—GGC,导致其编码第65位 精氨酸变为甘氨酸,为有功能的错义突变(R65G), 家系中14例患者均为193G/G纯合基因型.先症者 母亲为193G/C杂合基因型. 此外,该家系中携带杂合突变基因的女性则表 型不同,V3和V31牙齿少数缺失.其余8例携带突 变基因女性的牙齿数量和形状都基本正常.男性患 者第一外显子虽均为193G/G变异但缺失牙数量及 部位不同. 3讨论 x连锁外胚层发育不全无汗综合症是先天性遗 传病.由于其致病基因(EDA)的克隆和定位,以及 近年来分子生物学技术的发展和普遍应用,人们对 EDA基因突变多样性与疾病关系的研究越来越多, 已成为了解基因结构与功能的较好模型.迄今为 止,发现该基因突变类型,包括错义突变,无义突变, 插入,缺失突变,拼接点改变及分子重排等,而突变 热点区主要集中在编码EDA蛋白的3个功能区,即 c端的肿瘤坏死因子(TNF)样结构,胶元样结构和 Furin蛋白水解酶识别结构. 本文分析的蒙古族大家系,受累者均呈少齿伴 有头发稠密乌黑且卷曲的特征表型,是迄今未见报 道的EDA表型.所有男性受累者均为193G/G纯合 子,其基因型与特有的EDA缺少牙,头发卷曲临床 表型完全分离,而家系中表型正常者及50例无血缘 关系人群EDA基因第一外显子193位均为C/C纯 合基因型.值得重点讨论的是193c—G错义突变 与功能的关系.正如结果所示193C--~G颠换,使密 码CGC--”GGC,从而导致其编码第65位精氨酸为甘 氨酸取代.EDA蛋白的一级结构表明,该蛋白的胞 外和胞内N末端是外胚层形态发育信号调节的重 要靶点.G65突变发生位于EDA蛋白接近跨膜区 的胞外部分,该区富含亲水的精氨酸.R65G突变, 512基础医学与临床BasicMedicalSciencesandClinics2004.24(5) a b C “„ ~Tyr61_ Leu62_ GluSa-Le-Args5(R)-Se一G1一A窖s—A Tyr—Le13.6一G1-Le—Arg6(G)一Se6G1一A-Arg~. TTcTcC . TGCTACCTAAcTTGNcCTCcAcTTcCGCCccTCCCCCGCCCGCC d 图3EDA基因第一外显子序列分析 Fig3DNAsequencingofthefirstexoninEDAgene a.SequenceofnolTtlalindividualexonl;b.Sequenceofprobandexonl;e.Sequenceoftheproband?SmotherwithC/Gatposition 434intheexonl;d.Thecorrespondingaminoacidsubstitutionatposition65intheprotein. 65位亲水碱性精氨酸被一侧链最小的特殊氨基酸 即甘氨酸所代替.甘氨酸常常在多肽链的折叠中形 成狭小空间.推测EDA蛋白质构象的微小改变就 可能影响牙齿形态发育中的信号传递过程,有关其 机制尚待深入研究. 女性携带突变EDA基因型与表型的关系是 EDA遗传学研究中尚未解决的问题.本报告中10 例携带193G突变等位基因的杂合子女性中2例出 现先天缺失牙表型.余者在她们生育先天缺失牙小 孩之前,不能从临床表型判断是否携带突变基因. 参考文献: [1]ZonanaJ.Hypohidrotic(anhidrotic)ectodermaldyplasiamolec— ulargeneticresearchandit?stheclinicapplication[J].Semim Dermatol,1993,12:241—246. [2]KereJ,SrivastavaAK,MontonenO,eta1.X—linkedanhidrot— icectodermaldysplasiaiscausedbymutationinanoveltrans— membraneproteinlJJ.NatureGenetics,1996,13:409—416. [3]HashiguchiT,YotsumotoS,KanzkiT,eta1.Mutationsinthe ED1geneinJapannesefamilieswithX--linkedhypohidroticec?. todermaldysplasia[J].ExpDermatol,2003,12:518—522. [4]AmaFv,RicardoLR,deSouza,eta1.X—linkedhypohidrotic ectodermaldysplasiamutationsinBrazilianfamilies[J].AmJ 虽然Hert等曾以x染色体随机失活来解释携带 EDA变异基因女性表型各异现象.但x染色体失 活的特点,规律仍是值得深入探讨的课题. 致谢:先证者及其所有家系成员为此研究给予支持并提供 血样本;内蒙古民族大学科研处以及附属医院为该家系受累 成员I】盘床诊断与采集标本给予巨大帮助;北京华大中生科技 发展有限公司为此研究提供了技术平台和技术支撑.在此 一 并表示衷心感谢. MedGenet,2003.122A:51—55. [5]ZhangXue—Jun,ChenJian—Jun,SongYX,ela1.Mutation analysisoftheED1geneintwoChineseHanfamilieswithX— linkedhypohidmticectodermaldysplasia[J].ArchDermatol Res,2003,295:38—42. [6]NishibuA,HashiguchiT,YotsumotoS,eta1.AFrameshifi mutationofED1geneinSiblingcaseswithX--linkedhypohidrot-- icectodermaldysplasia[J].Dermatology,2003,207:178一 dDNA—basedprenataldiagnosis[J].BritishJour— nalofDermatology,2002,146:216—220. [8]SprecherE,Molho—PessachV,IngberA,eta1.Homozygous splicesitemutationsinPKP1resultinlossofepidermalplako— philin1expressionandunderlieectodermaldysplasia/skinfra— gilitysyndromeintwoconsanguineousfamilies[J].JInvest Dermatol,2004,122(3):647—651. 19JHeadonDJ,EmmalSA,FergusonBM,eta1.Genedefectin ectodermaldysplasiaimplicatesadeathdomainadapterinde- velopment[J].Nature,2001,414:913—916. [10]SchneiderP,StreetSL,GaideO,eta1.Mutationleadingto X—linkedhypohidroticetodermaldysplasiaaffectthreemajor fuctionaldomansinthetumornecrosisfactorfamilymember ectodysplasin—A[J].JBC,2001,276(22):18819—18827. 111JMonrealAW,ZonanaJ,FergusoB.Identificationofanew spliceformoftheEDAlgenepermitsdetecionofnearlyallX— linkedhypohidrotieectodermaldysplasiamutation[J].AmJ HumGenet,1998,63:380—389. 112]HertzJM,NorgardHansenK,JunckerL,eta1.Anovelmis— sensemutataion(412C—}T)inexon1intheEDAgeneina familywithX—linkedhypohidroticectodermaldysplasia[J]. NatureGenet,1998,53:205—209. Anovelmissensemutation(R65G)ofEDAgeneinamongolianfamilywith X—linkedcongenitalanodontia/wavyhair BAIHai—hua,ZHANGXin-yuan,QIUChang-chun,etal (InnerMongoliaUniversityforNationalities,Tongliao028000,China) Abstract:Toidentifytherelationshipofmutationtypeandphenotypeofanhydfiteectodermicdysplasia( EDA)geneina MongolianfamilywithX-linkedcongenitalanodontia/wavyhair.Studyobjectswerealongfamilywithcongenitalanodon— tiainsevengenerations,amongthem16membersarephenotypeanomaly(male14,female2).Thefirsttonighthexons EDAgenesofallmembersaffectedandnormalwereanalysedwiththePolymeraseChainReactionandSquencing(PCR/ Sequencing).ACl93斗 GtransvertioninthefirstexonofEDAgenewasshownintheprobandandothermalesaffected andallwere193G/Ghomogenousgenotype.TheC193--~Gtransvertionisanewmissensemutationwhichresultedinan Arg65Gly(R65G)substitutionintheextracellularlysegmentofproteinproductofthegene.Theproband?smother?8 carries193C/Gheterozygousgene,andherteetharenorma1.Amongfemaleheterozygousmutationof193G.V3lacks 11,21,31,41,V31lacks12,22,V1V6V8V11V20V46IV10? 3arenormaltermsofnumberandmor1)ho1ogYofthe teeth.ThemissensemutationofC193斗 GtransvertionofthefirstexonofEDAgeneinthefamilvisoneofthemainmo— lecularbasisoftoothagenesis.Thephenotypedifferenceofthefemaleheterozygouswith193—Gmutati onandtheexDres. sivitydifierenceofmaleaffectedremaintobestudied. Keywords:congenitalanodontia;EDAgene;genotype;phenotype correspondingauthor:NationalLaboratoryofMedicalMolecularBiology,InstituteofBasicMedicalScience,CAMS&PUMC,Beijing 100005,China;086—010—65296429:Dr.Qiu@163.com