荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的抑制作用研究

荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的抑制作用研究 荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的抑 制作用研究 第28卷第10期2007年10月环境科学 ENVIRONMENTALSCIENCE V01.28.No.10 0ct..2007 荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的抑制作用研究 李磊,侯文华 (中国环境科学研究院湖泊生态环境创新基地,北京100012) 摘要:在实验室条件下,通过测定培养液中铜绿微囊藻的藻细胞浓度和叶绿素a含量,研究了具有较高观赏价值的水生植物荷 花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的抑制效应.结果表明,不同浓度的荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的抑制作用不尽 相同,表现为明显的低促高抑现象;而连续滴加荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻的生长也有较明显的抑制作用,使藻细胞基 本失去了进行正常光合作用的能力,其中睡莲种植水的抑制效果比荷花的更明显;另外,扩大实验中通过测定铜绿微囊藻的 SOD活性,MDA积累量表明,藻细胞在共培养过程中受到了胁迫和伤害.灭菌方法对种植水的抑藻试验也有影响,不能采用高 温灭菌来代替微膜过滤,说明荷花和睡莲分泌物中含有热不稳定性的物质. 关键词:荷花;睡莲;铜绿微囊藻;生长;抑制效应 中图分类号:X173文献标识码:A文章编号:0250.3301(2007)l0.2180-07 InhibitoryEffectsofLiquorCulturedwithNelumbonuciferaandNymphaea tetragonaontheGrowthofMicrocystisaeruginosa ULei.H0UWen.hua (ResearchCenterofLakeEnvironment,ChineseResearchAcademyofEnvironmentalScie nces,Beijing100012,China) Abstract:TheinhibitoryeffectsofliquorculturedwithNelumbonucOCeraandNymphaeatetragonaonthegrowthofMicrocystisaeruginosahave beeninvestigatedbymeasuringthecellnumberandthechlorophyllacontentofMicrocystisoa~ylzglnosaofcultureinthelaboratory.Theresults showedthattheinhibitoryeffectsonthegrowthofMicrocystiscterl~rirgosawithdifferentconcentrationoftheliquorculturedwithNelumbo nuclferaandNymphaeatetragonaweredissimilar,andanevidentphenomenonappearedthatlowconcentrationscouldpromotethegrowthof Microcystiscterl~rirgosa.However,theinhibitoryeffectsonthegrowthofMicrocystisaer~rgosawithcontinuousliquorculturedwithNelumbo nuciferaandNymphaeatetragonawereobvious,whichmadethealgalcellalmostlosethecapabilityofphotosynthesis,andtheinhibitory effectsofliquorculturedwithNymphaeatetragonawerebetterthanthoseofNelumbonuclfera.Thescale-upexperimentdemonstratedthatthe algalcellreceivedmenaceanddamagebymeasuringtheactivitiesofperoxidase(SOD)andtheaccumulatedcontentsofmalondialdehyde (MDA)ofMicrocystisaeruginosaintheCO— culture.Sterilizationmethodsinfluencedthealgalgrowthinhibitionexperiment80thathigh temperaturecouldn'treplacemicroporefilter,whichexplainedthatthematterexcretedbyNelumbonuciferaandNymphaeatetragonamay containthermally-instabematter. Keywords:Nelumbonuclfera;Nymphaeatetragona;Microcystiscterl~rirgosa;growth;inhibitoryeffect 我国富营养化湖泊大部分属于磷限制型,而 利用高等植物对氮,磷等无机营养的吸收能力来防 治水体富营养化"是当前环保领域的一个重要课 题.20世纪90年代,随着水域污染的日益加剧和藻 类的大量暴发,水生植物的化感作用研究异常活 跃,人们试图通过对水生植物代谢产物的研究揭 示水生植物的抑藻效应,寻找生态治理的方法 来修复水体的功能.戴树桂等n从香蒲提取物中分 离鉴定了克藻化合物,并对比研究了不同的藻类抑 制效果,Wium.Andersen等研究认为不稳定的含 硫化合物是主要的抑制藻类生长的活性物质,后来 的研究发现金鱼藻在高磷浓度下对稳定和维持清水 状态具有重要作用". 以往的研究主要侧重于植物的净化效果,较少 顾及到景观的功能.研究较多的水生植物是香蒲 (Typhaminima),风眼莲(Eichhomiacro~ipe,),浮萍 (Lemna),金鱼藻(Leratophyllumdemersum),满江红 (Asollaimbricata)等;但对一些园林中具有较高观赏 价值的水生植物的研究较少,如荷花(Nelumbo .ucifercg),睡莲(Nymphaeatetragona),水葱(Scirpus tabernaemontani)等.其中荷花和睡莲是园林造景中 运用极为广泛的2类水生植物之一.荷花为多年生 挺水植物,原产我国,现广布全球,适应性强,喜热不 耐寒,多生长于湖泊,沼泽.睡莲为多年生水生草本, 叶浮于水面,喜温暖,湿润,阳光充足的环境.迄 今为止,国内外对荷花,睡莲对藻生长的影响研究较 收稿日期:2006.1l.02;修订日期:2006-12.04 基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)项目(2002CB412300);国 际合作项目(2005DFAg0960) 作者简介:李磊(1982一),女,硕士研究生,主要研究方向城市湖泊生 态控藻技术,E.mall:lilei20089@163.c0m *通讯联系人,E.mall:houwenhlla@sina.c0m l0期李磊等:荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的抑制作用研究 少,本研究以水华发生常见的铜绿微囊藻为对象,考 察了荷花,睡莲对铜绿微囊藻生长的影响,旨在为观 赏水生植物荷花,睡莲的进一步的开发利用提供 依据. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1铜绿微囊藻 铜绿微囊藻来自中国科学院武汉水生生物研究 所,保存在pH为8.0的M一11培养基中",培养条件 为温度28?,光暗比12h:12h,照度为2200lx.每5 d转接1次,重复2次,所得微囊藻浓度经镜检计数 超过106个/mL时,便作为实验用. 1.1.2荷花种植水 荷花种植水取自种植在温室的荷花玻璃缸内, 此缸内种植有3株荷花,每株各1盆.在生长旺盛 期,将玻璃缸和荷花植物体清洗干净,然后用薄膜将 盆内土层覆盖住,加水后20d内不再加水,20d后 自缸内取种植水水样,经0.45m滤膜过滤后的种 植水,冷藏待用.试验前须再用0.45m滤膜减压抽 滤以消除其它微生物的影响. 1.1.3睡莲种植水 睡莲种植水同样取自种植在温室的睡莲玻璃缸 内,缸内种植有3株睡莲,每株各1盆.同上,从缸内 取睡莲种植水,将过滤后的种植水冷藏待用.试验前 再用0.45m滤膜减压抽滤以消除其他微生物的 影响. 1.2分析方法 1.2.1培养方法 (1)铜绿微囊藻的培养将上述铜绿微囊藻藻 种用M一11培养基于日本SANYAO公司生产的MLR一 350型人工恒温光照培养箱中进行扩大培养,培养 温度为28?,光暗比12h:12h,照度为2200lx,pH 值为8.0,每日定时摇动. (2)荷花和睡莲种植水的抑藻试验实验在上 述光照培养箱中进行,采用500mL锥形瓶,用经过 0.45m滤膜过滤的荷花和睡莲种植水配制250mL M一11培养基,对照仍采用去离子水配制,加入铜绿 微囊藻藻种,使起始的D瑚值为0.057,藻细胞浓度 为12×lo'个/mL.在培养过程中锥形瓶用0.45m 的滤膜封口,每天定时摇动3次,每隔24h测定藻 细胞数,每组均设3个平行样.在设置不同浓度进行 比较实验时,100%浓度是完全由种植水配制的培 养基. (3)连续滴加荷花和睡莲种植水的克藻试验 实验方法同上,培养1d后,实验组每天添加种植水 10mL,连续添加7d,对照组添加去离子水,每日测 定藻细胞数.每组均设3个平行样. (4)连续滴加植物种植水的扩大试验扩大实 验在2L的大烧杯中进行,内置1L荷花和睡莲的种 植水与藻的培养液,初始藻细胞浓度同上,培养1d 后,每天添加种植水50mL,对照组添加去离子水, 培养当天进行相关生理生化指标的测定,以后隔天 测定1次,至第8d测定完毕.藻细胞数每天测定1 次,每组均设3个平行样. 1.2.2测定方法 (1)藻细胞数测定藻细胞数采用XB—K.25型 血球计数板,在Olympus显微镜下以显微镜视野法 进行计数.自接种之日起每天定时采样并计数. (2)叶绿素a的测定叶绿素a含量的测定用 比色法测定?.色素的浓度根据如下 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 计算: c=13.95D665—6.88D649 式中,D鲫,D?分别为在665,649nm波长下的吸光 度,C.为叶绿素a的浓度,mg/L. (3)酶液的制备取50mL藻液加至灭菌的离 心管中,4000r/min离心15min收集藻细胞,加入5 mL预冷的0.05mol/LpH7.2的磷酸缓冲液.冰浴下 超声波破碎(92一?型超声波细胞粉碎机,超声5 S,间隔5S,工作次数为24次,功率600W,重复3 次).4?下12000r/min离心15min,收集上清液即为 酶液,一20~E保存备用. (4)可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝 蛋白染色法.蛋白 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 和试剂均购自南京建成生物 工程研究所,测定方法按照试剂盒的说明书进行. (5)丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比 妥酸(TBA)法n,上清液1.5mL于带塞试管中(可 做2个重复),加入0.5%(质量分数)TBA溶液2.5 mL,混合后于沸水浴上反应20min,冷却后离心,上 清液分别于532,600和450nm波长下测定D.计算 公式为: c(MDA)=6.45(D532一D600)一0.56D450 式中,C(MDA)为丙二醛浓度,t~mol/L,然后以材料鲜 重(t~mol/g)表示丙二醛含量. (6)超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用 黄嘌呤氧化法,药品购自南京建成生物研究所,测定 方法按照试剂盒的说明书进行.用每mg可溶性蛋 白的酶活表示,单位为U/mg. 2182环境科学28卷 2结果与分析 2.1不同浓度的荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻 生长的影响 实验结果表明,不同浓度的荷花和睡莲种植水 对铜绿微囊藻生长的抑制效果都不尽相同. 图1(a)所示为不同浓度下的荷花种植水抽滤 液对铜绿微囊藻生长的影响趋势.很明显,100%种 植水对铜绿微囊藻的生长有一定的抑制作用,此处 理组的微囊藻藻细胞浓度的增长速度明显没有对照 组快;前6d藻细胞浓度有缓慢增长并随之有下降 趋势,之后又急速上升,说明荷花种植水对铜绿微囊 藻生长的抑制作用是由种植水中所含的植物分泌物 冒 当 × 魁 艇 基 赢 棚} 冒 童 × 魁 艇 基 赢 的浓度决定的,培养一段时间之后植物分泌物浓度 降低,抑制作用变弱,所以微囊藻又开始快速生长. 但是80%和40%种植水的处理组对微囊藻的生长 几乎没有抑制作用,而且藻细胞浓度的增长速度在 前6d比对照组还要快,同其他植物一样表现出明 显的低促高抑的现象u. 图1(b)的睡莲种植水的100%浓度处理组也表 现了明显的抑制作用,前3d藻细胞浓度缓慢增长, 与对照组相似,但之后呈明显下降趋势,第5d后又 开始增长,与荷花种植水100%浓度处理组的实验 结果相一致.睡莲种植水80%,40%浓度处理组在 前5d也表现出了明显的低促高抑的现象,第5d之 后藻细胞增长速度则没有对照组快. 图1不同浓度的荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的影响 Fig.1EffectsofdifferentconcentrationoftheliquorculturedwithNelumbonuciferaandNym phaeatetragonaonthegrowthofMicrocystiso~rugilto$a 2.2连续滴加荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生 长的影响 图2是连续滴加荷花和睡莲种植水对铜绿微囊 藻藻细胞浓度和叶绿素a含量的影响趋势.由图2 可见,连续滴加种植水后,与对照组相比,荷花和睡 冒 耋 × 魁 艇 基 赢 莲对铜绿微囊藻的抑制效应相当明显,藻细胞浓度 明显没有对照组增长速度快,荷花种植水处理组基 本上处于缓慢增长状态,第4d后开始有缓慢下降 趋势,而睡莲种植水处理组则基本上没有明显增长, 藻细胞几乎停止生长.说明睡莲种植水在同样条件 图2连续滴加荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的影响 Fig.2EffectsofcontinuousliquorculturedwithNelumbonz'吨屉 mandNymphaeatetragonaonthegrowthofMicrocystisaeruginosa 1O期李磊等:荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的抑制作用研究 下比荷花的抑藻作用更好. 藻类和浮游植物依靠光合作用生长,而叶绿素 a是所有藻类的?主要光合色素,通过测定藻类和浮 游植物叶绿素含量可掌握水体的初级生产力情况, 在监测中可将叶绿素a含量作为其光合作用潜力的 一 种指标.实验中测得的微囊藻叶绿素a含量可从 藻细胞的生理角度检验其受荷花和睡莲种植水影响 的程度.如图2(b),连续滴加睡莲种植水的处理组 微囊藻叶绿素a含量几乎没变,说明睡莲所分泌的 物质对铜绿微囊藻有抑制作用,藻细胞已基本上失 去了进行正常光合作用的能力.而荷花种植水处理 组中微囊藻叶绿素a含量先是有一个上升阶段,第 5d后又有所下降,说明荷花所分泌的物质对微囊藻 也有抑制效应,但效果不如睡莲. 2.3连续滴加荷花和睡莲种植水的扩大实验 ? 鑫 髻 簧 旨 为了更好地说明荷花和睡莲种植水对铜绿微囊 藻的作用效果,进行了扩大实验. 图3显示了扩大实验中荷花和睡莲种植水对微 囊藻叶绿素a含量的影响趋势,由图3可见,对照组 中的叶绿素a含量增长趋势明显,由47.3mg/m3增 加到第9d的312.7mg/m3;而实验组中的叶绿素a 含量呈现出先升后降趋势,在实验的第5d达到了 最高值,此后随着藻细胞受到种植水中物质的破坏, 叶绿素a含量很快就下降到了63.9mg/m3和48.2 mg/m3(分别为荷花和睡莲实验组),说明藻细胞的光 合作用能力已经达到了很低的界限.扩大实验进一 步证实,连续滴加种植水对铜绿微囊藻的生长有很 好的抑制效果,这进一步说明了抑藻效果的强弱取 决于水生植物所分泌的物质的浓度,因此荷花和睡 莲能否成为优势群体,进而分泌大量的物质是抑制 ? 鑫 髻 篓 旨 图3扩大实验中荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响 Fig.3EffectsofliquorculturedwithNelumbonuciferaandNymphaeatetragonaontheconten tof chlorophyllaofMicrocystiso,er~ginosainthescale-upexperiment 微囊藻生长的关键. 2.4荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻的生理影响 图4为荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻SOD 活性的影响趋势,由图4可见,对照组的SOD活性 在实验过程中几乎没有变化,说明对照组的藻类生 长状况良好,没有受到外界条件的胁迫;而实验组中 藻类的SOD活性则呈现出先升后降的趋势,从实验 开始表现出了上升的趋势,第7d时达到了最大值, 细胞内原有的0;一产生和清除的动态平衡状态被 打破,0;一积累增加.超氧化物歧化酶(SOD)是生物 体内清除超氧化物阴离子自由基(0i一)的重要金属 酶类.它和过氧化氢酶,过氧化物酶一起构成了生物 体内重要的酶促反应防御体系,从而维护生物体内 细胞正常的生理代谢和生化反应.作为细胞抗衡胁 迫的主要保护酶,SOD活性在处理前期增大可能是 微囊藻在水体中受到了种植水中物质胁迫时的应激 反应,而第9dSOD活性开始下降,可能是SOD活性 不能与0;一在更高的水平上建立新的平衡,表明此 时藻细胞已经受到了实质性伤害. 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害,往往发生 膜脂过氧化作用,丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最 终分解产物,从膜上产生的位置释放出后与蛋白质, 核酸起反应修饰其特征,使纤维素分子间的桥键松 驰或抑制蛋白质的合成.MDA的积累可能对膜和细 胞造成一定的伤害.微囊藻在生长过程中受到植物 种植水物质的抑制破坏,细胞内的丙二醛含量会直 接体现出来,实验测定的MDA含量变化如图5. 由图5可见,对照组与实验组的藻细胞MDA的 含量变化差别较大,对照组中MDA的相对含量几乎 没有大的波动;而实验组MDA的含量变化趋势与 环境科学28卷 SOD活性变化趋势相似,先升后降,升高是由于藻细 胞脂膜过氧化程度加深,使细胞膜受到伤害,到实验 ? 阜 掣 船 a o 暑 警 罂 蚕 的第7d开始MDA的含量显着下降可能此时藻细 胞膜结构受到严重损伤,藻细胞已经开始破裂. 图4荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻SOD活性的影响 Fis.4EffectsofliquorculturedwithNelumbonuciferaandNymphaeatetragonaontheSODo fMicrocystisaeruginosa ? 暑 警 罂 蚕 图5荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻MDA含量的影响 Fis.5EffectsofliquorculturedwithNelumbonuciferaandNymphaeatetragonaontheMDA ofMicrocystisaeruginosa 2.5灭菌方法对抑藻实验的影响 图6分别是采用传统的高温灭菌和0.45m微 滤膜过滤处理荷花和睡莲种植水的抑藻实验结果. 采用种植水对藻细胞生长的抑制实验,微生物的影 响是很大的,有时甚至会得出相反的结果,在进行植 物种植水抑藻实验时必须先排除微生物的干扰,通 常可用小于0.65m的滤膜过滤或采用高温高压灭 菌的方法.经镜检和细菌培养表明,通过0.45m滤 膜过滤和高温灭菌后的种植水中都没有发现微生物 和菌落.采用微滤膜过滤需要在减压的条件下完成 且速度较慢,而采用高压灭菌锅灭菌的方法较简单 快捷,但由于植物分泌物质大多是热不稳定性物质, 高温加热容易导致其分解.如图6,比较高温灭菌和 微膜过滤,结果显示高温灭菌后的种植水处理组藻 生长速度更快,明显超过对照组;而0.45m滤膜过 滤后的种植水处理组藻细胞生长速度不如对照组, 说明荷花和睡莲种植水在高温处理后,克藻能力明 显降低,且对藻的生长还有促进作用,表明荷花和睡 莲的分泌物中含有热不稳定性物质,因此在用种植 水进行生物测试时不能采用高温灭菌来代替微膜 过滤. 3讨论 通过一系列实验表明,荷花和睡莲种植水对铜 绿微囊藻存在一定的抑制作用,且采用连续滴加种 植水方法能显着提高克藻能力,说明荷花和睡莲种 植水的克藻作用是源于植物连续分泌的物质,当种 植水中植物分泌物质浓度很低时,其对铜绿微囊藻 的生长反而有促进作用.这与Satoshi等n.的研究结 果相一致:抑制作用的强弱与植物分泌物的浓度是 密切相关的.SOD活性,MDA积累量等在实验过程 中发生的变化,则从铜绿微囊藻生理生化的角度印 10期李磊等:荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻生长的抑制作用研究 证了藻细胞在共培养过程中受到了胁迫和伤害.且 实验结果表明,连续滴加睡莲种植水对铜绿微囊藻 冒 鲁 8 香 {醚 甏 碧 暴 橱} 的抑制作用比荷花种植水的效果要明显,说明睡莲 分泌的物质对微囊藻的抑制作用更好. 阜 里 宝 × {醚 甏 碧 暴 橱} 图6种植水抑藻实验 Fig.6AIgaJgrowthinhibitionofculturesolutionafterhig}ltemper~umoraftermieroporefilt ermemberane 植物分泌的物质中有很多物质容易被微生物所 利用,只有当它们达到一定的浓度时才会抑制微生 物的生长,且不同物质对藻类生长的影响差异很 大?.而不同植物所分泌的克藻物质也是不同的, 因此利用各种植物的协同作用合理搭配水生植物种 类,充分发挥它们之间的协同增效作用,联合它们的 观赏价值,合理搭配浮叶,挺水,沉水和漂浮4种类 型的植物,可创造出好的环境效果.且多种植物的合 理组合搭配不仅满足了物种多样性,更容易保 持湖泊生态系统的长期稳定性.故在采取水生高等 植物进行水体修复时,充分利用各种植物的习性和 特征,如荷花,睡莲等具有很高观赏价值的水生植 物,在不同水域合理搭配使用,将能产生更好的修复 效果,也是一种经济有效的方法. 4结论 (1)荷花和睡莲种植水对铜绿微囊藻存在一定 的抑制作用,且采用连续滴加种植水方法能明显提 高抑制藻生长的能力;当种植水中植物分泌物质浓 度低时,对铜绿微囊藻的生长反而有促进作用,并通 过对SOD活性,MDA积累量等生理生化指标的测 定,初步验证了上述结果. (2)不同植物所分泌的物质对铜绿微囊藻的生 长抑制影响差异很大,睡莲分泌的物质对微囊藻的 抑制作用比荷花好.因此可以利用植物的协同作用 合理搭配水生植物种类,发挥它们之间的协同抑藻 作用,同时利用植物的搭配营造好的景观. 参考文献: [1]金相灿.湖泊富营养化控制和管理技术[M].北京:化学工 ,I出版社.2001.112,l46. 娄敏,廖柏寒,刘红玉,等.3种水生漂浮植物处理富营养化 水体的研究[J]中国生态农业,2005,13(3):194,195. Nyakang'OJB,va/lBruggenJJACombinationofawell functioningconstructedwetlandwithapleasingland~apedesignin Naimbi,Kenya[J].WatSeiTech,1999,40(3):249,256. 金送笛,李永函,倪彩虹,等.菹草对水中氮,磷的吸收及若 干影响因素[J].生态,1994,14(2):168,173. NakaiS,InoueY,HosomiM,eta1.GrowthinhibitionofblBe. greenalgaebyallelopothieeffectsofmacrophytes【JJ.WarSciTech, 1999,39(8):47,53. NakaiS,InoueY,Ho~miM,eta/.Myrophyllumspieatum- releasedallelopathiepolyphenolesinhibitinggrowthofblue-green algaemierocystisaemgino~[J].WatRes,2000,34(11):3026— 3032. 孙文浩,余叔文,杨善元,等凤眼莲根系分泌物中的克藻化 合物[J].植物生理,1993,19(1):92,96. 袁峻峰,章宗涉.金鱼藻对藻类的生化干预作用[J].生态学 报,1992,13(1):45,5O. 河池全,叶居新.石菖蒲克藻效应的研究[J].生态, 1999,19(5):754—758. 戴树桂,赵凡,金朝辉,等.香蒲提取物的抑藻作用及其分离 鉴定[J].环境化学,1997,16(3):268271. 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