大肠杆菌VT2噬菌体的分离与溶源转染
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第 , ,期 ,卷 ,, , ,年 ,月
中 国 病 毒 学
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大肠杆菌 , ,噬菌体的分离与溶源转染 ,
严亚贤 ,陆承平 ,
((上海交通大学农业与生物学院动物科学系,上海 , ,, ;, , , ,, (南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京 , , ,) ,,,
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摘要 :本试验利 用指示菌 ,,,, 。经双层琼脂法 纯化和 , ,扩增 , ,, , , 因,分 别从大肠杆菌 ,,,菌株 、牛粪 、 ,基 ,
鸡 粪和 污水中分离 获得 , 株含 , 基 因的噬菌 体 。这些 噬菌斑透 明,直径为 , ( ,, , , ( , ,,对 指示菌 的感 染效价均在 , , ,, , , ,以上 ,抵抗氯仿和 , :,,,的作用 。将噬菌 体分离株 , , , , , ,, , ,, , , 感染 ,, , , ,, 后。经 , ,鉴定获得 ,
一
株 溶源 菌株( ,,,, ,, , , , , , ) 。溶源株 的 , ,培养滤 液对 ,, , ,细胞 产生 了显著 的病变效应 ,而 ,,,, 在 同 ,,
等 条件下培养 的滤液无细胞病变 ,表 明 , ,噬菌体通 过溶源将 , , , ,毒力基 因水平转移 ,证 实了 , ,噬菌体 的转 ,
染与细菌毒力 相关。
关键词 :噬菌 体:, 基 因;转染 ;细胞 病变 ;毒力转 移 , ,
中图分类号 :, , ( ,,, , 文献标识码 :, 文章编码 :,, — ,,(, ,, ,, ,, , ,, , , , ),, , ,,
自 ,, ,,年首次报道人 的出血性肠炎以来,大 肠杆菌 ,,,作为一种新的致病性血清型已被全世 , 界所公认【。尽管该病原菌的毒力因子有许多【 】 , 】 ,, ( ,
由于该毒素能致 , , , ,细胞病变 ,因此也称 为 , , , , 毒素 ( , , , , ) 它 能引起肠上皮细胞的 , , , , , , ,, ,, , , 损伤 (, ; , , , ; , ,, ) , ,, , ,, , , ,且与出血性大 ,, , , , , , ,
肠炎、溶血性尿毒综合征直接相 训 。大量 的研究 认为 , ,是 由温和噬菌体 ( ,噬菌体)编码 ,, , ,, ,, , ,分为两种形式,, , , , , 与痢疾杆菌 , 和 , 。, ,
,, , 毒素与 , ,有一定的差别, 具有抗原的多样性, 主要作用于肠道以外的组织如肾 。, 与霍乱毒素 ,
但显著特征之一就是产生志贺毒素(,, ’, , ,, 所产生 的 , , ,, , , ) , , , ,几乎完全一致 ,主要作用于肠上皮 。
具有相似的 , ,亚单位 ,由一个 ,亚单位 (,, ) ,, ,
收稿 日期:, , ,,, ,修 回 日期 :, ,,,, , ,, —, ,,, —, 基金项 目:上海市教委曙光计划 ( , , ,, , ,, , ) ” 通讯作者:严亚贤 (,, ) ,,, ,女,江苏启东籍,副教授,博士,主要从事兽医微生物学与免疫学的研究。
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和一个五聚体 ,亚单位 (( , , , , 单聚体 ) , 组成 。 , 亚单位是受体结合蛋 白,介 导与靶细胞膜 的结合, 致使毒素分子 内在化 。,亚单位能酶解生成一个具 有催化活性的 , , ,的 , 亚单位 ,,, ,, , 发挥 , , ,
滤膜过滤 ,滤液 同 , ( ( ,的
方法
快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载
,检测滤液中是否 ,
存 在 噬菌 体 。
, 噬菌体 的纯化【, ( , , , 将上述含有噬菌体的滤液作 , ,倍稀释,利用
, 糖苷酶的活性, ( 特异性裂解真核细胞 ,,,, , ,, , 从而抑制细胞蛋 白合成过程 中的肽链 的延伸 ,致使 细胞死亡 。 , , ,和 , , , 具有 , ,的 , ,和氨基酸 , ,
的同源性 ,但免疫原性不同。同一种宿主菌可被编
双层琼脂法 ( 平板底层用 , ,琼脂 ,上层用 ,, ( , (, 琼脂 )分离滤液 中的噬菌体,从蚀菌斑分布均匀 的 平板上挑取单个空斑,接种到含有指示菌的 , ,培 养液 , , , ?培养 ,,后过滤 , , 再利用双层琼脂法进 行克隆空斑 ,重复 , ,,次,直至获得形态和大小
完全一致的蚀菌斑 ,即获得 了纯化的噬菌体。用无 菌牙签挑取纯化的噬菌斑 , 悬浮于 , , ,的 , ,, , ,
码不同 , ,毒素 的噬菌体溶源,从而表达多种类型 的,, , ,增强细菌 的致病性 。当今 ,噬菌体作为基 因克隆载体的应用较 为普遍,但噬菌体在病原菌 中 的毒力作用 以及 在细菌基 因多样性 的进化 中 的作 用 尚有很 多未解之谜。大肠杆菌 ,,,中 , , ,噬菌
体 的研 究在 国内尚无人涉及,因此为 了揭示大肠杆 菌 ,,,的毒力基 因传递 的机理,本试验从大肠杆 , 菌 ,,,菌株、牛粪、鸡粪及污水 中进行 , , ,噬菌
中。在摇床 中室温孵育 , ,后加一滴氯仿,继续孵 育 , ,,混合物 , , , , , , , , ?, , , , 离心 ,,,,上 , , , , 清 即为噬菌体分离株 的原液, ?保存备用。 , , 噬菌体 , 基 因的检测 ( , , , 取纯化 的噬菌体分离株培养液 ,, , , , 参照 ,, , ,,,,等方法【 ,利用 ,, ,,公司提供的噬菌 ,, , ,, ,
体 , ,试剂盒,按产 品说明,提取噬菌体 , ,。 , ,
体的分离和鉴定,并对所获 的噬菌体分离株进行了
溶源转染和 , , ,,细胞 的毒力测定,确定了 , , , 噬 菌体 的普遍存在 以及 , ,噬菌体 的溶源可增强细 ,
参照 ,,, 等【
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
一对 引物,扩增 ,,, , , , , , ,亚 ,
单位基 因, 上游引物为 , , , , , , , , , , ’, , , , , , , , , , ,下游引物 为 , , , , , , ,, , , ’ ’, , , : , , , , , ,
菌毒力 ,为从源头上控制大肠杆菌 ,,,提供新思 ,
路。
, 材料 与方 法
, 菌株 ( , 大肠杆菌 ,,, , , ,, ,, , : , , , , ,国家进 出口 ,
, ,
模板
个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载
为提纯的噬菌体 , ,,扩增条件为 , ? ’ , ,
预变性 , ,, , , 然后 , ?, , , ?, ,,, , , , ,,, , , , , ?, ,,
共 , 个循环 ,,, , , :延伸 , ,, ,, , , ,, , 浓度为 ,, , ,,
设 , , , ,, ,, , , , , ,, 和 ,, 的染色体 , ,分别为阳 ,
检验检疫总局上海分局保存 ,,株大肠杆菌 ,,, , 分 离株 由本 研 究 室 分 离 鉴 定 【。噬 菌 体 指 示 菌 , 】 ,, , , 由英 国利 物浦大 学提供 ,遗 传背景参 照 ,,
,,,,, , , 等 。 ,
性和阴性对照。 扩增 后 , ,的琼脂糖凝胶 电泳, ( , 观
察结果 。 , 噬菌体的物理特性 ( ,
将纯化的具有 , , 因的噬菌体分离株利用双 ,基 层琼脂法进行蚀菌斑计数 ,以获得噬菌体分离株 的 效价。并测定噬菌体分离株在 ,,、, ?、氯仿 中 : , 的稳定性 。 将分离株分别接种 , ,培养液 , : , ,培养 ,, , ,等分 , ,一份 , 份 ?、一份加氯仿 ( 终浓度 ,
,)一份 , ?水浴分别作用 ,, , 然后 , , , 、 , , ,。 ?,, , ,,离心 ,, , , , ,,上清滴定噬菌体的感染效价 。
,菌株中噬菌体的分离 ( , 将复壮后的大肠杆菌 ,,, , , , , ,株和 , 株分 离株分别接种 , ,培养液, , , ?培养 , 后经直径为 ,
, ,, 滤膜过滤。分别取 , , 滤液 ,逐滴加到 (, , , ( , , 已在培 养基表面均匀涂 布有培养至 对数期 的指 示
菌 ,, , ,的平板 ,, ?培养 ,, ,, , , ,同时设滴加无
菌生理盐水的平板作对照 ,判定是否出现噬菌斑 。
, 溶源菌的制备和检测【】 ( , , 取 ,, ,污水 中分离到的 , ,噬菌体培养物, ( , ,
加入到 , , ( ,的对 数期 的指示菌 ,, , , , ,, ,轻轻混 匀, , , ?作用 ,, , , , 后,取 ,, ,上述混合物均匀 ( ,
, 牛粪、鸡粪及污水 中噬菌体的分离 ( , 将, ,,, , , , ,, 指示菌接种于 , , ,培养 , ,, 基的中,, ,培养 , , , ,后分别加入 ,,新鲜采集 的 , 牛粪 或鸡粪 ( 别采 自上 海地 区的奶 牛场 和 养鸡 分
场)或将 , ,指示菌接种于 , ; , 倍浓度 的 , ,, , , , 培养液, , 培养 , ,: , ,后 , 加入 ,, ,污水样本 ( ,, 采 自上海交通大学农业与生物学院院内生活污水 , , , , )继续培养 ,, 加 , , ( , , , , ( ,氯仿振荡培养 ,, , , , ,, , ,, , , ?,,,, 离心 ,, , 上清液经直径为 , , , ,, , ,, , (, ,,
铺到 , 平板 ,, ?过夜培养 ,作溶源性检测 。挑 , ,
起可疑菌落 ,, 培养液过夜培养 ,将所培养的细 ,
菌作为 , ,噬菌体的裂解宿主菌 , , 利用双层琼脂法 进行蚀菌斑检测,如果没有蚀菌斑或菌苔周 围没有 透 明圈, 该菌株就是可疑溶源菌 。 并将 , , , 噬菌体
感染 ,, , , ,, 作对照。取可疑溶源菌 , , ,, , ?孵
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严亚贤, 等( 大肠杆菌, , , 噬菌体的丹离与溶源转染
育 ,,, , ,作模 板 ,然后 采用 , 的方法进 行 , ,, , ( , ,
指示菌 ,, , , ,, 的感染效价均有所下降, 但下降幅 度为几倍到几百倍不等,噬菌体的效价均还在 , , ,,, , ,,以上 ( ,,可见本试验分离到的噬菌体 表 )
对氯仿 和 , ?均 有较 强 的抵 抗 力 。 ,
检测溶源菌中的 , ,亚 单位基 因, , ; , , , , 设 , ;, ,, 和 , ,, , , ,分别为阳性和阴性对照,凡检测出 , , , 基 因的菌株 即 为 ,, ,噬 菌体感 染后 形成 的溶源菌 , 细菌滤液中 , , ( , , 毒素效价的测定, ,
将大 肠杆 菌 ,,, , , 株 、,,,, ,, , , ,的 ,, ,
噬菌体的溶源蔺、, ,, , , ,在 ,, , 培养液中 , ,, , ?培养 , , 培养物经直径为 , , , 滤膜过滤, , ,, (, , , 滤液用含 ,,犊牛血清 的 ,, , ,,进行 ,倍稀释 ,加
入到 已 长成单 层 的 , , ,,细胞 的 , ,孔板 中 ,, ?培 , 养 ,,后观 察 , , , , ,连续 观测 ,, , ,以 , 以上 的 ,
细胞发 病变的最高稀释度为 ,, , 毒素 的效价,
, 结 果
,, , ,噬菌体的分离与鉴定 ( , ,株大肠杆菌 ,,,菌株的滤液、,粪、鸡粪 , , , :
和污 水中均 有大 量蚀菌 斑 出现 ,经 反复纯 化 (从每
图】
,, ,
个样本的滤液 中均纯化出形态 和大 、 一致的噬菌 体毒株, 蚀菌斑的直径为 , — ,, , , , 蚀菌斑 为完全
透 明的 圆形 ( , 。进 一步 , , 检 测 , 图 ) , , 因, ,基
获得 , 株能扩增出 ,, , 特异十 条带的噬菌体( ) 宅 罔, ,
鉴定 出 ,株 , ,噬 菌 体 ( ,。 , 表 ) ,, 噬 菌体 的物理特 性
, 株噬菌体分 离株 的原液 的感 染效价为 , ,
, ,, 左右 (经 过液 体大 量培 养 ,双层 琼脂法 测 , ,,
圈, , ,,扩增噬菌体 , , ,基因
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口, , , ,中 , ( , ,, , ,,
得噬菌体分离株的赦价均在 ,,, , , 上 ( , ,, , 表 ,。 ) 噬菌体分离株经氯仿和 , ?水浴 , , , , , , 后, 对
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表, , ,噬茁催分离株 的特 性
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,, 溶源菌 的获得 和 ,, 因的检测 ,基
主带 ,而 ,;,, 中无 ,, ,, , 的特 异。 丰带出现 ( 图 ,, )进一步证实 了所获得的菌落为 、 , , 噬菌体的溶 , 源菌 。 , 细菌滤液 , ( , ,毒素效价的测定 细菌培养液的滤液接种 已长 成单层 的 , , 后, , ,
,, , ,株 的滤液 ,,就产 生细 胞病变 ,病变 表现 为 , 细胞 变圆 、皱缩 、脱落 而后 死 亡 ,,,, , ,的 ,, ,
利用 来源十污水已分离 鉴定的 , , , 噬菌体 , , 由 ,,感染 ,, , , ,, ,培养后获得的荫落作为宿主 菌,再次接种噬荫体 , ,, , ,来见有蚀菌斑或菌 落周,有透明带,现,可确 定浚菌落 为噬菌体 , , ,
, ,的溶源菌 ( ,,,,,, , , 经 , ,扩 增 ,, , ) , 溶源 菌和 大肠杆 菌 ,,,, , , , ,株均 扩增 出 ,,的 ,
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噬菌 体 的溶源 菌的滤 液也 致 , , 细 胞发 生相似 的 ,,
后 能形 成溶源性 细 菌( ,,,;,;,,) 在 自然 , , ,, ,, , , ,
细胞病变 ( , ,接种后 ,, 的毒素效价分别为 图 ) ,
, , 、 ,而 ,,,, 的滤 液与细 胞 作用 , ,未 出现 ,, , 细胞 病变 。
条件下一些溶源性细菌有少量可 自投裂解, ,, , , 噬菌体也具有这种特征,因此本试验中对同一 , , , 噬菌体采用不同的方祛既可测定裂解蚀菌斑,叉可
测 定溶 源 菌落 。 据 报道 ,, 嘴菌体 可 引起 溶 源转变 (,,,, ,,,,; ;,,, , ,, ,,,, ), , , ( ,所谓溶源转变 ,即噬菌体在感染
圈 , 溶源 菌和噬 苗体的 ,, 困的检测 ;基
?
宿主菌后,能引起溶源性细菌除免疫原性外的表型
特征的改变或致病性的改变。本试验中分离鉴定的 , ,噬菌 体 感染指 示菌 ,,,, 后 产 生的溶源 菌 , ,,
( ,,,,,,中, , ( ,, , )不仅 从基 因水平上 显示 了 , , , 基 因的转移 (而且经 , , 细胞 的毒 力试 验显示 ( ,,
该溶源菌的培养滤液对 , , ,,细胞产生了较强的毒 力作用。由于 ,, , , , 不能使 , , , , ,细胞产生病变 , 因此可以确定溶源菌对 , , , ,细胞的毒力作用是 由
于 , ,噬菌 体 的感 染 (引起溶 源转 变表 达 , ,所 , ,
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致, 这就有 力证实了, , , 噬菌体与细菌毒力的相关 性 据报道噬菌体不仅能引起细菌毒力的变化 同
,
图 , , 细胞接种细菌 ( , , ,,,, ,,中, , ,, , )滤波后的嫡
时在火肠杆菌基因多样性中发挥 巨大作用,,因此 , , 对 , 噬菌体的研究(不仅能揭示大肠杆菌 , , , ,, 的致病机理 ,同时也能解释细菌多样性的原因,因 此对噬菌件 的研究具有重要意义 。
娈 ( ) ,常细胞 ,) , 和 , ~ ,
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参考文献
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, 讨 论
大肠杆菌 ,,,进入机体的肠道后 (能分泌大 , 量的胞外产物,其中最主要的是 , , , 据报道 大 多数只产生 , , , 的菌株的毒力较强, 而只产生 , , , 的菌株所引起的疾病较轻微, , , , , 对人的肾脏微 血管内皮细胞的毒性作用比 , ,强 ,, 倍,,显 , ,, 示出 , ,更容易损害肾小球血管,反映 了产 , , , , 的菌株与人的溶血性尿毒综合征的相关性 即 , , , 在 ,,,致病中的重要作用 。考虑到 , , ,由噬菌体 编码,而我国对 , ,噬菌体的研究还是空白,因此
本试验 设 计分离含 , , 因 的噬 菌体 , 以确 定我 国 ,基
亚贤, 华修国 大啮轩蒲 , , , ,的毒力固子的研究进展, , ,畜牧
与兽医 (,, , , ,,, , ,( ,( ): ,, ,
『 严 亚 贤(华恬 国 , ,
太 眄轩 苗 ,,, 其它 产志 赁毒 索太脑 杆菌 的毒 ,和
闵, 一 附 素【】中 国预 踌兽 医学撒 (,, , , ,, , , ,, (, , ): , , ,,
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环境中是否存在 , , , 噬菌体 , 实验结果表明了 , , , 噬菌体在菌株和外界环境中普遍存在, 通常噬菌体感染宿主菌后有两种表现形式 ,
种 为裂解 ( , ) , , ,另 一种 是溶 源 (,,,,) , ,, ,,,, 。,
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严 蛆贤(施慧源 ( 修 国 牛 内山 大腑 扦菌 ,,,的 调壹, 畜牧 ,
与兽 医(, ,, ) ,,, ,, , , , ,,
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噬菌体属于 家属的噬菌体, , 噬菌体感染宿主菌
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严亚 贤,等(大肠杆菌 ,, , ,噬菌体 的分 离与溶源转 染
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菌 ,,, ,毒素【 (上海商检科技, , ,, ,,, , :, , 】 ,,, : ,, (
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微生物学教程, (, , 北京:高等教育出版社, , , ,,,, , ,? ( , ,, 周德庆( ,
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,, , ,, 彭奕冰,郁燕萍,支立 民,等( , 细胞毒性试验法检测大肠杆 ,,
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