分子光谱法研究联苯双酯及其类似物与白蛋白的相互作用机制

分子光谱法研究联苯双酯及其类似物与白蛋白的相互作用机制 分子光谱法研究联苯双酯及其类似物与白蛋白的相互 作用机制 郑州大学 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 分子光谱法研究联苯双酯及其类似物与白蛋白的相互作用机制 姓名:柴亚辉 申请学位级别:硕士 专业:药物 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 学 指导教师:王瑞勇 201204中文摘要 中文摘要 近年来,关于生物大分子功能特性的研究引起了临床医学工作者、生命科学 人员和化学科研工作者的极大兴趣,特别是对于蛋白质生物大分子与药物小 分子 相互作用的研究,不仅有助于了解药物小分子与蛋白质的相互作用机制,而 且有 助于认识药物药效发挥的途径,并且为药物分子 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 及新药开发提供理论依 据。 本文通过采用荧光光谱法、紫外.可见吸收光谱法和分子模拟研究了在接近 生理的实验条件下,及其结构类似物与白蛋白的相互作用。应用荧光猝灭 方程进行数据处理,计算得到相应的猝灭常数。由计算结果可知,及其结 构类似物对白蛋白的内源性荧光具有较强的猝灭作用,其相互作用机制为静 态猝 灭。依据热力学方程求得及其结构类似物与白蛋白发生相互作用的焓变、 自由能变和熵变,从而确定及其结构类似物与白蛋白之间的作用力主要为 疏水作用力。根据非辐射能量转移理论,通过测定白蛋白的荧光光谱和 及其结构类似物的紫外吸收光谱,分析处理数据,求得及其结构类似 物与白蛋白色氨酸残基之间的结合距离均小于,该结果表明及其结构 类似物与白蛋白之间发生了非辐射能量转移。同时,采用同步荧光光谱法和 三维 荧光光谱法对白蛋白与及其类似物发生相互作用后其二级结构进行了检 测,结果表明:白蛋白的构象及其所处微环境随着及其结构类似物的加入 发生一定程度的改变。通过比较及其结构类似物与白蛋白发生相互作用的 有关参数发现:由于及其结构类似物所含活性基团的不同,导致它们与白 蛋白相互作用的差异性,通过对这些特定基团部分进行修饰,可以合成具有 更高 生物活性的化合物。 关键字:荧光光谱法白蛋白类似物分子模拟 ?, . ,, .. .. 四,’ . , ,. ,.,,也 . ,, . 呵: ; ;; ; ?符号说明 一 符号说明 联苯双酯?一一?一??双环醇??~~?~?牛血清白蛋白人血清白蛋白~??一.卵清 白蛋白?~?~?~.色氨酸??一??~??~一酪氨酸??一~~??~?.苯丙氨酸 一?~?~??一圆二色谱法~红外光谱法?~??~核磁共振波谱法第一章绪论 第一章绪论 随着科学技术的进步和生活水平的提高,人们对健康的关注日益升温。探究 与生物体健康密切相关的生物大分子和有机小分子之间的相互作用,并从分 子水 平上揭示具有生物活性的大分子潜在的生物功能,对促进人类健康的研究具 有颇 为重要的意义。 在生物体中,蛋白质是必不可少的生命活性物质,其最基本的作用是用于构 成生物体的结构并产生相应的生物功能,参与了生物体几乎所用的生命活 动。蛋 白质的大部分生物功能是由其结构决定的,研究蛋白质分子的结构与其功能之间 的关系是当今生命医学领域研究的核心课题之一。探讨蛋白质的各级结构、构象 变化以及其与有机小分子之间的相互作用,不仅对促进临床医学和药学等相关领 域的研究和发展有着不可估量的生理学和临床意义,同时也为完善和发展蛋白质 相关功能研究的方法提供更多的科学依据。近年来,国内外有关有机小分子与生 物大分子之间相互作用的研究也日趋活跃【卅。研究药物小分子和生物大分子之 间的相互作用已成为生命科学、药代动力学、医学和化学科研工作者共同关注的 课题。 .药物分子与蛋白质相互作用的研究意义 药物与人类的健康息息相关,能够影响机体的生理和病理过程,可用于预防、 诊断、治疗疾病等。药物进入生物体后,经过吸收、分布、代谢以及排泄从而发 挥药效,影响生物体某些器官组织的功能。不同的药物,其在生物体内发挥作用 的部位具有差异性,一些药物直接在血浆或组织中与蛋白质发生结合作用,而另 一些药物则主要在肝脏中进行代谢。药物与蛋白质的结合是一个快速、可逆的过 程,二者之间的相互结合作用具有饱和性和竞争抑制性。药物与白蛋质之间的结 合能力和结合率将影响药物的起效时间、效应强度和药效持续时间等。另外,药 物的浓度也将影响药物的一些重要的药代动力学特性。 药物小分子与蛋白质发生相互作用后,二者的光谱特性将会发生一系列变 化,目标蛋白质分子的吸收光谱或发射光谱最大峰位置的蓝移或红移、发射光谱 峰强度的变化以及出现新的吸收峰等,都可以为研究药物与蛋白质的相互作用提 供新的理论信息。研究药物分子与蛋白质之间的相互作用关系,不仅可为药物分 子活性基团的修饰及合成具有更高生物活性、疗效更好、毒性更低的药物提供有 价值的理论依据【;同时也有助于从分子水平上理解药物在体内的运输和代谢过 程,对于阐明药物的作用机制、药代动力学、指导合理用药以及研究生物大分子第一章绪论 与药物小分子相互作用的化学本质都具有重要的意义。 .药物分子与蛋白质相互作用的研究方法 常用的研究药物与蛋白质之间相互作用的方法有:光谱学研究方法比如紫 外.可见吸收光谱法【】、荧光光谱法、圆二色谱法【】、红外光谱法【小】、核磁共振 法以及化学发光法等、平衡透析法、电化学方法等。目前一些新的研究手段如 质谱、核磁共振等逐渐应用与药物与蛋白质相互作用的研究。总体来讲,研究药 物与蛋白质的相互作用主要是采用分子光谱法,应用分子光谱法研究药物小分子 与蛋白质的相互作用,不但可以揭示蛋白质与配体小分子之间的相互作用机理, 还可以研究蛋白质的结构、构象、活性及其所处微环境的变化。 ..光谱学方法 对于大多数蛋白质,因其含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等 残基,而具有内源性光学活性,因此利用光谱法研究药物分子与蛋白质相互作用 后蛋白质的构象、活性及其所处微环境的变化,从而推断其相互作用机理,是一 种最为常用、行之有效的分析方法。 ...紫外一可见吸收光谱法 紫外.可见吸收光谱法 是 研究蛋白质与药物小分子相互作用最常用的光谱方法之一。紫外.可见吸收光谱 法具有仪器设备简单、灵敏度高、精确度和准确度较高、选择性较好以及应用广 泛等优点。组成蛋白质常见的种甜氨基酸中,在紫外区具有吸收特性主要为 、、等残基。这些氨基酸侧链含有吸收紫外光的基团,使得蛋白质具 有紫外吸收的特性;另外,肽键也有较强的紫外吸收特性,其特征吸收峰波长为 。在波长处具有特征吸收峰,而在波长附近的紫外吸收 峰则为残基中共轭双键以及的特征吸收峰。蛋白质分子中氨基酸所处的 微环境与其构象有关,若蛋白质分子的构象发生变化,则其所处微环境也发生改 变,同时蛋白质中所含生色团的紫外吸收光谱会随之发生改变。药物与蛋白质相 互作用的荧光猝灭机理【也可依据蛋白质在发生相互作用前后其构象的变化情 况进行判断。另外,也可采用紫外.可见吸收光谱法计算药物小分子与蛋白质发 生相互作用的结合常数和结合位点数【。 ...荧光光谱法 荧光光谱法是基础理论研究的有效方法】,具有方法简便、仪器操作简单, 第一章绪论 试剂试样用量少、选择性好、灵敏度高等优点,被广泛用于蛋白质与有机小分子 相互作用的研究【剀。荧光光谱法能提供目标分子的吸收光谱、荧光光谱、荧光 强度等参数【。通过对相关参数的测定,可获得许多关于药物与蛋白质相互作 用的信息,如直接根据药物对蛋白质内源荧光的增强或猝灭作用考察二者的相互 作用机理和结合程度,采用动态或静态猝灭方程求得猝灭常数和结合常数,确定 二者相互作用的猝灭机制:药物与蛋白质之间的相互作用力类型可通过测定热力 学参数进行推断,同时可结合分子模拟的结果加以印证;依据药物的紫外吸收光 谱和蛋白质荧光光谱的重叠积分结果,求得蛋白质氨基酸残基与药物分子特定活 性基团之间的结合距离,据此判定药物与蛋白质发生结合的空间部位;根据蛋白 质与药物发生相互作用后,其最大荧光峰位置的变化,判断蛋白质的构象是否发 生改变,从而进一步了解蛋白质的功能和其构效之间的关系。 研究药物小分子与蛋白质的相互作用时,通常在一定浓度范围内药物小分 子对蛋白质的内源荧光具有猝灭作用,出现这种猝灭现象的原因可能有以下几 种:动态猝灭、静态猝灭、动态和静态的联合猝灭、电荷转移猝灭及能量转移猝 灭等【】。对于动态猝灭机制,荧光物质的吸收光谱不受影响,而其激发态的某 些特性将会改变;而静态猝灭过程,荧光物质与猝灭剂发生相互作用后,其吸收 光谱或荧光强度将会发生显著的变化,据此可初步判断蛋白质与药物发生相互作 用的猝灭机制。 同步荧光分析法 .主要包括以下四 种类型:第一种为通常所说的同步荧光法,即在光谱扫描过程中保持恒定的波长 差.常数;第二种为恒能量同步分析法,在扫描的过程中用能量差 代替波长差,即固定和之间的能量差进行扫描;第三种为可变角或 可变波长同步荧光分析法,它是在扫描的过程中,使两个单色器以不同的速率 同时扫描;第四种为恒基体同步荧光法,在该扫描方法中,把干扰物质看作基体, 用基体的等荧光强度线表示其扫描路径。 同步荧光分析法最初被和【】应用于法医检验,之后同步荧光分 析法发展为一种引人关注的新的分析方法。该方法具有光谱简单、谱带窄化、光 谱重叠性小等优点。同步荧光法主要用于表征示踪分子和蛋白质的内源荧光基团 所处微环境的变化情况。由前人的实验探列】及相关的参考文献可知, 时,主要表现为残基的光谱特性;时,表现为耻残基的光谱特性。 三维荧光光谱法. 尸成为一种广 泛应用的分析方法,该法是描述荧光强度同时随和变化的关系图谱, 可用等角三维投影图和等高线光谱图两种形式来表示。采用等角三维投影图研究 待测样品的综合信息时,、和荧光强度是三个重要的参数。若配体分子第一章绪论 与蛋白质相互作用的三维荧光图谱用等高线描述,则能够比较全面直观的反应待 目标分子的荧光信息,如果在荧光峰附近的激发波长或发射波长发生移动、出现 新的荧光峰或固有的荧光峰消失,则表明蛋白质与药物小分子发生相互作用后其 构象发生变化。 ...圆二色谱法 圆二色谱法 ,是在一定波长范围内记录左旋和右旋偏 振光? 的连续变化并对波长作图的方法。该法灵敏度高,是一种研究稀溶液中 蛋白质空间结构快速、简单、较准确的方法,可在模拟生理条件下探究白蛋白的 构象变化情况,是一种有效的研究相互作用的方法,但该法的应用不是很普遍。 蛋白质的主链构象有种形式:螺旋、.折叠、.转角和无规卷曲。组成蛋 白质的氨基酸,其.碳原子和主链构象具有不对称性,使蛋白质具有一定的光学 特性。通常情况下,蛋白质在远紫外区.和近紫区.都可 能会出峰【引,其主链构象的变化是通过蛋白质远紫外区的特征峰进行判定,因 为在该区域主要是由肽键的吸收所致,表现出蛋白质的二级结构特征。通过 光谱的变化,可了解蛋白质二级结构的构象变化情况【】。利用光学活性化合物 的光谱,为研究蛋白质的构型、构象和反应机理提供许多重要信息。 ...红外光谱法 红外光谱法 是根据物质对红外辐射的特 征吸收进行定性和定量的分析方法,但该法主要用于定性分析,能够提供待测物 质的精细结构信息,分子之间的相互作用信息也可通过红外光谱法获得。红 外光 谱法不太适用于水溶液及含水物质的分析,因为水在处有强吸收,且 侵蚀红外光谱仪吸收池的盐窗,因此,若对含水试样进行检测,需对待测试样 进 行干燥处理之后制成均匀薄片。 蛋白质的红外吸收主要源于其二级结构中酰胺带的特征吸收,包括酰胺带 . . . 以、酰胺带 和酰胺?带 以。酰胺带吸收最强,此带对蛋白质结构变化最灵敏,酰胺带和酰胺? 带吸收较弱。酰胺带是由.的伸缩振动产生,水在‘处有较强的红 外吸收,将会影响确切定量。常用的定量分析方法为:.螺旋含量仅用 . 范围 处峰面积的百分含量表示,.折叠含量用 . 处峰面积百分含量表 内峰面积百分含量表示,.转角含量用 . 示,无规卷曲含量则用 处峰面积百分含量表示。酰胺带的 振动为伸缩振动和..面内变形振动,水在此带无吸收峰,不产生干扰。 在酰胺?带,.螺旋含量用. 处峰面积百分含量表示,.折叠 第一章绪论 含量用 .范围内峰面积百分含量表示,.转角含量用 . 峰面积百分含量表示,无规卷曲含量用 处峰面 积百分含量表示【。采用红外光谱研究药物与白蛋白的相互作用时,可依据洳 螺旋和?折叠含量在相应波数范围内的变化判断二者之间是否发生相互作用。 ...拉曼光谱法 拉曼光谱法 ,是一种分子振动.转动光谱技术,与红外光谱类 似,源于分子的振动和转动能级跃迁,属于分子振动.转动光谱,可获得分子结 构的直接信息。水的散射极弱,此法适合含水体系的研究,尤其对生物 试样和无机物的研究远较红外吸收光谱方便,具有分辨率高,重现性好,测量简 单快速、准确,可以进行无损、原位测定以及时间分辨测定等优点。/光谱 法对分子振动具有指纹式的分辨率,可在接近自然状态的极稀浓度下研究生物大 分子的组成、构象和分子间的相互作用,所以该法是研究生物大分子的有效手段。 近年来,发展了一些新的拉曼光谱技术,如共振光谱法和表面增强 光谱法。共振光谱的谱线强度具有选择性,用于研究蛋白质发色团的局 部特征及其与小分子的相互作用,表面增强光谱适用于蛋白质与活性分 子作用机制的研究。 ...共振光散射技术 共振光散射 技术具有灵敏度高,选择性好,仪器 构造简单,操作使用方便等优点,随着科技的进步,此分析方法得到了迅速发展, 目前该法已被应用于蛋白质等生物大分子与有机小分子相互作用的研究。 ..其它研究方法 ...电化学法 电化学分析法具有灵敏度高,选择性好等优点。近年来,已应用于生命科学 等相关领域的研究,该法适用于吸收较弱或无紫外吸收的试样,特别适用于测定 以静电引力与蛋白质相结合的配体分子。 ...核磁共振波谱法 核磁共振波谱法 是一项以 原子核自旋为探针,详尽反映原子核周围化学环境变化的波谱技术,主要用于有 机物和无机物的结构测定,但蛋白质等生物大分子由此法得到的三维结构信息【 及其动力学行为,具有较强的可信度,所以该法在小分子与蛋白质相互作用的研第一章绪论 究中也有应用。 ...平衡透析法 对于游离药物的浓度分析主要应用平衡透析法,将平衡透析法与其它方法联 用研究药物与蛋白质的作用机制已有报道】。任何分析方法都具有两面性,此 法也不例外,其在实际应用过程中存在一定的局限性。该分析法具有耗时、所用 半透膜吸附小分子或阻碍小分子通过的缺点,但分析结果的可靠性较强,也可作 为一种研究药物与蛋白质相互作用的分析测试方法。 .药物分子与蛋白质相互作用的研究对象 .。蛋白质概述 蛋白质作为组成生物体细胞和组织的主要成分之一,是一类具有特定空间构 象和生物功能的大分子【】。研究配体小分子与蛋白质之间的相互作用,不仅可 以阐明二者的相互作用机制,对改进以及发展新的分析蛋白质的研究方法具有促 进作用。 常用作研究对象的蛋白质有:血清白蛋白、溶菌酶、过氧化氢酶、血红蛋白 、免疫球蛋白【剐等。人和脊椎动物血浆中含量最丰富的一类蛋白质为血清 白蛋白,它在血浆中的总浓度为/,占血浆中所有蛋白总量的%,提 供%的血液渗透压【,具有结合和运输‘叫内源性与外源性物质,清除自由 基,抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能,此外,血浆中白蛋白的浓度也是 检验生物体健康与否的生理指标。本论文以牛血清白蛋白、人血清白蛋白和 鸡 卵清白蛋白为目标蛋白质分子,研究这三种白蛋白与药物小分子的相互作 用。 ..有机小分子 在蛋白质等生物大分子与有机小分子相互作用的研究中,常用的有机小 分子主要为以下几类:医用药物、生物毒剂、表面活性剂、金属离子、染料 等。这些有机小分子与蛋白质发生相互作用后,形成小分子.蛋白质复合物, 使所研究体系的相关理化性质发生变化,获得有关蛋白质与小分子作用前后 结构变化以及小分子潜在的特性信息。关于生物毒剂与蛋白质相互作用的研 究,为深入了解其在生物体内的运输、分配、产生药效和代谢提供理论参考 依据。表面活性剂在生活中有着广泛的应用,研究其与蛋白质的相互作用, 具有重要的现实应用价值。金属离子在生命活动中发挥着重要的作用,它不 仅用于构成具有特定功能的金属蛋白质或金属酶,同时也是维持生物体新陈 第一章绪论 代谢必不可少的微量元素;此外,药物中的金属离子被生物体吸收代谢后, 在发挥药效的同时也可能产生一定的毒副作用,最近出现的铬超标的“问题 胶囊”引起了国民的普遍关注,因此有必要研究金属离子与蛋白质的相互作 用。目前研究最多的主要是药物与蛋白质的相互作用,本文以联苯双酯 及其结构类似物作为研究对象,探讨这五个化合物与白蛋白的相互作用。 .药物分子与蛋白质相互作用的研究 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 ..药物分子与蛋白质相互作用机制的研究 蛋白质与药物分子发生相互作用的荧光猝灭机制主要为动态猝灭和静态猝 灭【,发生于猝灭剂与荧光分子的激发态之间的猝灭过程为动态猝灭,源于猝 灭剂与荧光分子基态之间的相互作用为静态猝灭。区分动态猝灭和静态猝灭 主要 采用以下种方法【: 测定不同温度的猝灭常数:对于动态猝灭,其猝灭常数随温度的升高 而增大,而静态猝灭过程,其猝灭常数随温度的升高而降低。 扫描紫外.可见吸收光谱:如果发生的是动态猝灭作用,荧光物质的紫 外.可见吸收光谱不发生变化,若为静态猝灭过程,荧光物质的紫外.可见吸 收 光谱将发生改变。 测定荧光寿命:该法是判断动态猝灭和静态猝灭最准确的方法。在动态 猝灭过程中,荧光物质的荧光寿命由于猝灭剂的存在而缩短,即//:对于 静态猝灭过程,物质的荧光寿命没有发生改变,即以。 比较猝灭速率常数:即比较值,荧光物质的平均寿命约为一。对 于受扩散控制的猝灭过程,其最大猝灭速率常数约为.× 。山。【】,若。。~, . ’。~,则猝灭机制为静态猝灭;若. 则猝灭作用为动态猝灭。 ..药物分子与蛋白质相互作用结合常数及结合位点数的测定 蛋白质与药物分子的相互作用研究,通常采用荧光猝灭方法研究二者之间的 结合常数。荧光猝灭依据其猝灭机制的不同可分为动态猝灭、静态猝灭、动 态和 静态的联合猝灭、电荷转移猝灭和能量转移猝灭作用等。 ...动态猝灭理论 动态猝灭常数可根据.方程计算】: /【】】 .第一章绪论 % . 式中和分别为加入猝灭剂前后所测得的荧光强度,为双分子猝灭过 程的速率常数,为.猝灭常数,】为猝灭剂的平衡浓度。为无 猝灭剂时测得的荧光物质的平均荧光寿命,勖一。以/对【作图,由所 得直线斜率求出,但需指出,在个别情况下,静态猝灭过程按. 方程作图同样能得到直线,此时需要根据温度和黏度的不同、数值的大小等 对静态和动态猝灭做出区分。 ...静态猝灭理论 对于静态猝灭过程,其猝灭常数依据方程进行计算: 吐. 】。 . 式中为结合常数,和分别为加入猝灭剂前后所测得的荧光强度,【 为猝灭剂的平衡浓度,此方程仅适用于结合位点数为一的体系。 对于结合位点较多的体系,可依据下式求取结合位点数: ?/】 . 以/对作图,通过所得直线的截距和斜率可分别求出结合常 数和结合位点数,对于具有多个结合位点的静态猝灭体系,应用此公式求出 的结合常数最准确【。 ..药物分子与蛋白质相互作用的热力学参数及作用力类型的测定 药物等有机小分子与生物大分子之间的作用力主要为疏水作用力、氢键、范 德华力和静电引力等。【等人根据大量的实验数据,总结出了依据热力 学参数,判断生物大分子与小分子之间的作用力类型的规律:当, 时,相互作用力主要为静电引力;,时,二者以氢键和范德华力为主 相结合;,时,主要为疏水作用【】。温度变化不大时,视作常数,根 据’方程,以对胛作图,由直线斜率和截距可求得和,由 即可求出反应的自由能变: 一// . ? 一 . 在实际反应体系中,鉴于蛋白质结构的复杂化,体系的水合效应、溶剂化效 应以及共存离子效应,药物等小分子与蛋白质之间可能同时存在多种作用 力。 。.药物分子与蛋白质相互作用的结合距离 药物分子与蛋白质发光基团之间的结合距离,可依据非辐射能量转移 理论进行求算,结合距离越/,表明药物小分子与蛋白质之间越容易发生能第 一章绪论 量转移,该过程是通过偶极一偶极耦合作用的共振能量转移实现的。能量转 移效 率与供体一受体间的距离的关系为: 卜停&/凡 . 式中,表示能量转移效率,和分别加入猝灭剂前后测得的荧光强度, ‰为临界距离,为供体一受体间的距离。 能量转移效率为%时的距离称为临界距离‰,则: 凡.×。西一 . 式中,为供体.受体间空间取向因子,为介质的折射率,为供体的荧 光量子产率,表示供体的荧光光谱与受体吸收光谱的重叠积分。 ?柚 的?砭的?九 . 式中,为荧光供体在波长九处的荧光强度,柚为受体在波长九处的摩尔 吸收系数。 通过计算求得,根据测定的发射和吸收光谱求出重叠积分,即可计算得 到鼬与。 .本论文研究的意义及内容 ..本论文的研究意义及目的 研究蛋白质与药物等有机小分子之间的相互作用已引起生命科学、医学和化 学科研工作者的普遍关注。年,教授就提出,蛋白质与小分子之间的 相互作用,在蛋白质分子的生物功能中起着主导作用【。年, 等通过统计分析建立了种蛋白质与配体小分子形成复合物的三维结构数据 库,并由此获得自由能参数,在设计配体小分子的步骤中,预测蛋白质与配体之 间的亲和作用起着至关重要的作用,并且对配体小分子尤其是药物小分子的功能 团的修饰和结构设计具有指导作用】。因此,研究蛋白质与小分子药物之间 的相互作用,有助于了解蛋白质的结构特征和功能特性,以及其与小分子的结构 和性质之间存在的某些相关性。 荧光光谱法是分子光谱法中研究蛋白质与配体小分子相互作用应用最广泛 的一种方法。它能提供激发光谱、发射光谱及荧光强度等多种物理参数,并且利 用其光谱特性能够深入考察蛋白质与配体小分子发生相互作用的热力学性质。通 过测定猝灭常数、结合常数等参数,获得蛋白质与小分子发生相互作用的多种信 息,因此研究药物与蛋白质的相互作用对了解药物在生物体内的贮存、转运、分 布、代谢以及其发挥功效的途径有着重要的意义。国内外已有大量关于小分子与 白蛋白相互作用研究的报道【,但涉及到小分子及其结构类似物与白蛋白相互 第一章绪论 作用的研究不多。 ..课题的研究内容 本论文的创新之处在于以下两点: .药物小分子的选择:综合国内外相关领域的研究,究其根源关于蛋白质 与药物相互作用的研究,仅局限于单个孤立的药物与蛋白质相互作用的研究,由 此得出的实验结论规律性不明显,对新药物分子的设计和研发启发性不显著。鉴 于以上的局限性,可通过选取结构上具有相似性且含有不同活性基团的一系列结 构类似的药物或化合物,研究它们与同一种蛋白质之间相互作用的相似性和特异 性,从而获得其发生相互作用的规律性,为新药物分子的设计、筛选和研发提供 具有参考价值的信息。本文选取了个结构相似的化合物,其中和双环醇 是我国自主研发的保肝降酶药物,另外个化合物为本实验室合成的 结构类似物,这个化合物均含有,二甲氧基.,,,’.二次甲二氧基.,? 联苯骨架结构,其结构不同之处在于联苯骨架,’位的活性基团不同。 .蛋白质生物大分子的选择:到目前为止,关于蛋白质与药物小分子相互 作用的研究已有数十年,但是大部分研究所选择的目标蛋白分子均为血清白蛋 白,对于其它种类蛋白质的研究非常少。从不同角度考察不同蛋白质与药物 之间 的相互作用对于更全面地了解药物的转运和代谢过程以及阐明蛋白质与药物小 分子相互作用的化学本质都具有非常重要的意义。本文所选择的目标蛋白分子除 了经典的具有内源性光学活性的牛血清白蛋刍和人血清白蛋白外, 同时选用了鸡卵清白蛋作为研究对象,具有起泡性好、亲水能力 强和乳化性能高的优点,其在酶联免疫分析中主要用与包被抗原、封闭微孔 板或酶标板中的非活性位点等;在生产实践中,主要用于加工婴儿食品、肉 制品、面包和甜点制造业。因此有必要研究与药物小分子的相互作用, 对阐明蛋白质与药物小分子的相互作用方式具有一定的指导意义。 本文以及其结构类似物和白蛋白为研究对象,、作为一 类化学新药,具有明显的保肝降酶活性且毒副作用小、安全性好。本实验室对 、基本骨架的部分基团进行修饰,合成了种与其结构相似的类似 物。是人工合成五味子丙素的中间产物,由于天然的五昧子丙素含量非常 少,及纯品不易获得,本实验室已成功合成出高纯度的及其 结构类似物。 本文主要采用荧光分析法、紫外.可见吸收光谱法和分子模拟,在接近生理 条件下.,研究及其结构类似物与、和的相互作用。 计算不同温度下.猝灭常数,结合常数、热力学常数等参数,在此基 第一章绪论 础上应用非辐射能量转移理论,求得及其结构类似物与白蛋白氨基 酸残基之间发生相互作用时的结合距离和能量转移效率;其次,运用同步荧 光光 谱法和三维荧光光谱法探讨了及其结构类似物与白蛋白的相互作用时白蛋 白构象的变化情况,采用分子模拟研究了及其结构类似物与发生相 互时的结合部位,同时印证了二者之间相互作用力的类型,获得更加丰富的 信息。第二章及其类似物与相互作用的研究 第二章及其类似物与相互作用的研究 .引言 牛血清白蛋白吼趾“ 是牛血清中的一种球蛋白,且 是机体循环系统中最丰富的白蛋白之一,分子量为,等电点为.。分子由个氨 基酸残基组成,其中有两个色氨酸残基和 和 个酪氨酸残基,因而具有内源性荧光活性。和的三级结构具有%的 相似性, 二者是同源性蛋白质【】。的三级结构由、、三个结构域组 成,形成一个“心型分子形状【】,每个结构域由两个亚域组成,分别称为认、 、%、、、,与配体发生结合作用时,主要位于的 认亚域和亚域疏水腔内【。。当作为载体时,药物等小分子能够与 发生可逆的结合作用【。研究药物等有机小分子与蛋白质相互作用时, 也是应用最多的蛋白质之一。 联苯双酯,的化学名称为, ’二甲氧基.,,’,’二亚甲二氧基.,’.二甲酸甲酯联苯,是在人工合成五味 子丙索的研究中发现的中间产物,为我国研制的一种治疗肝病的药物【删。能 选择性地降低血清谷丙转氨酶的活性,对化学毒药如四氯化碳及硫代酰胺损害 肝脏造成的高血清转氨酶以及皮质激素诱导肝脏酶蛋白所引起的血清转氨酶升 高【确】,都有明显的降低作用,并能减轻肝脏的病理损伤,保护肝细胞生物膜 的结构和功能;亦可降低波尼松诱导所致的肝脏谷丙转氨酶升高,能促 进部分肝切除小鼠的肝脏再生【‖。 双环醇商品名百赛诺,是我国首先研发的国家一类抗肝炎新药【。 具有保护肝细胞和抗肝炎病毒疗效显著的活性,尤其是其降酶作用,效果明显, 毒副作用性低,安全可靠。 对多种化学性、免疫性肝脏损伤具有明显的保护作用,能明显的降 低血清转氨酶,显著减轻肝脏病理损伤,在一定程度上能够减轻由于病理形态 学造成的肝脏组织损害【。体外试验结果显示对肝癌细胞转染人乙 肝病毒的..细胞株具有抑制、、分泌的作用【。 和除具有明显的保肝作用外,兼具降酶速度快,毒副作用小, 价格便宜,是比较理想的治疗肝炎的药物。在临床上能明显改善慢性肝炎病人的 肝功能,目前在全国范围内已广泛使用,远销印度、韩国、越南等国家,产生了重 大的社会效益和经济效益。 五味子丙素作为一种活性成分,具有显著的抗肝炎病毒和抗艾滋病毒的活 第二章及其类似物与相互作用的研究 性,因而受到了广泛关注。但是天然五味子丙素的含量在.%以下,为了深入 研究其药理活性,本课题组对五味子丙素基本骨架的部分基团进行修饰,合成一 些简化物,通过对五味子丙素简化物构效关系的研究,可对特定基团部分进行修 饰,合成具有更高生物活性的化合物。由于市面上销售的片剂或滴丸,不 易提取纯度较高的,实验所用及其结构类似物均由本实验室合成。 目前尚未见有关及其结构类似物与之间发生相互作用的研究报 道。本章主要运用荧光光谱法和紫外.可见吸收光谱法,研究在近生理条件下 .及其结构类似物与的相互作用机理,求得二者发生相互 作用的动态猝灭常数、结合常数、热力学参数和结合距离等,根据热力学参数确 定及其结构类似物与之间主要的相互作用力类型,定性分析了 及其结构类似物对构象的影响,对于深入理解及其结构类似物与 的相互作用机理具有重要意义,同时也有利于了解、在生物体内的 代谢、分布和药理作用发挥的途径等情况,从而为进一步提高、 的药理作用、指导临床用药、降低其毒副作用以及新药物分子的设计和开发 提供 一定的理论基础。 及其类似物的结构式如图.所示:图. 及其类似物分子结构图 .实验仪器与试剂 ..实验仪器 荧光光度计上海三科仪器有限公司:荧光光度计日本日立 公司;一上海雷磁仪器厂; 电子分析天平上海上平仪器有限 公司;紫外.可见分光光度计美国安捷伦科技公司;恒温水浴 锅北京中兴伟业仪器有限公司。 ..实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与试剂第二章及其类似物与相互作用的研究 ,纯度?%,用二次蒸馏水配制成浓度为.一?’的溶 液,溶液保存于。的冰箱中备用;及其结构类似物,用无水乙醇配制成浓 .。.. ?‘缓冲溶液 度为.一.。的储备液;. ?以的溶液;所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏 .;. 水,经检测均无荧光杂质。 ..实验方法 ... 及其类似物与相互作用的荧光光谱法测定 在一系列 的比色管中,分别加入. .的.缓冲溶 ..×一?。的溶液,. 液,. ?溶液,. 不同浓度的或其结构类似物溶液,以二次水定容。使或其结构 ?~,的最终 类似物的最终浓度分别为.,.,.,.,. 。在激发波长为 浓度为.×击‘~,混合均匀并静置 ,荧 一 石英比色皿,在 范围内扫 光激发和发射狭缝均为眦,用 描记录荧光发射光谱图。 ...?及其类似物与相互作用的同步荧光光谱 在一系列 的比色管中,分别加入. .的缓冲溶 . 液,. ?以溶液,. .一?。的溶液,. 不同浓度的或其结构类似物溶液,以二次水定容。使或其类似 物的最终浓度分别为.,.,.,.,.×珥?,的最终浓度 。固定激发和发射波长差从分别为 为.一?~,混合均匀并静置 一 、 、 ;分别记录其在 ,荧光激发和发射狭缝均为 ?波长范围内的同步荧光光谱图。 ... 及其类似物与相互作用的三维荧光光谱 在一系列 的比色管中,分别加入. .的。缓冲溶 .液,. 溶液,. .×一?以的溶液,. 不同浓度的或其结构类似物溶液,以二次水定容。使或其结构 ?一,的最终 类似物的最终浓度分别为.,.,.,.,. 。固定波长间隔均为 ,荧 浓度为.×币?一,混合均匀并静置 、 光激发和发射狭缝均为时,分别记录激发和发射波长为衄一 一 波长范围内的三维荧光光谱图。 第二章及其类似物与相互作用的研究 ... 及其类似物的紫外吸收光谱图 在一系列 的比色管中,分别加入. .的.缓冲溶 . 液,. ?以溶液,. 不同浓度的或其类似物溶液, 以二次水定容。使或其类似物的最终浓度分别为.,.,.,., .,.‘ ?~,混合均匀并静置 。在 一 范围内进行 扫描测定得到紫外光谱图。 .实验结果与讨论 ..确定实验最佳化条件 ...缓冲体系的选择 按实验方法,测定了.,,.缓冲体系 对与及其结构类似物发生相互作用的荧光强度差值?的影响,研 究结果表明,在.缓冲液中,所测得荧光图谱峰形较好且灵敏度较高, 与及其类似物的荧光强度差值值最大,因此选用.溶液作缓冲 介质。 ...溶液酸度及缓冲液用量的影响 考察了不同酸度条件下,及其结构类似物对的荧光猝灭情况, 图.为对与相互作用的影响结果其结构类似物没显示,由 实验结果可知,当?缓冲溶液的.时,或其类似物对的 荧光猝灭效果最佳。同时探究缓冲溶液用量在. 一. 范围内时, 一 荧光强度之差随缓冲溶液加入量的变化趋势,研究发现当用量在. . 之间时,?呈线性增加,之后随缓冲溶液用量的增加而减小。当缓 时,或其类似物与相互 冲溶液..的用量为. 作用的?最大且恒定,因此,本实验选用. .的.缓冲液。第二章及其类似物与相互作用的研究 图. ,眦. 对与相互作用的影响,入 ?, ‰.× ?~,‰.× ?。 ...试剂添加次序的影响 固定其它实验条件且在仪器参数最佳的条件下,测试不同试剂添加次序对 与相互作用荧光强度的影响,研究表明当添加次序为 .?或其结构类似物时,与或其结构类似 物发生相互作用的荧光强度较强且灵敏度很高,因此本实验选用此添加次 序。 ... 浓度的影响 固定其它实验条件,考察浓度在. ?.. ?范围内对 与及其类似物相互作用荧光强度的影响。图.为浓度对 ?‘ 与相互作用的影响结果其结构类似物没显示,当浓度为. 时,与或其类似物相互作用的荧光猝灭程度最大。 图. 浓度对与相互作用的影响,, 一?~,睇.×。?。 .,醑. ...无水乙醇用量的影响 第二章及其类似物与相互作用的研究 由于在实验过程中所用及其类似物溶液均用无水乙醇配制,考察无水 乙醇的溶剂效应对和及其类似物的光谱特性影响是必不可少的。固定 广.. 实验操作条件,使其均处于最佳状态,探究无水乙醇加入量在. 或其类似物的最终浓度为. ?。范围内对、及其 类似物荧光强度的影响,图.为无水乙醇对、荧光强度的影响其 结构类似物没显示。研究发现,无水乙醇加入量对的荧光强度基本上无影 响且其最大发射波长位置几乎不变,然而及其类似物的荧光强度随着无水 乙醇加入量的增多逐渐增大。为了减少实验误差,本实验选用或其类似物 。 溶液的体积为 , 图.无水乙醇加入量对及荧光强度的影响,入 .,眦. ?~,嘲.× ?~,呻.× 。 ?,卜分别表示加入乙醇的体积为,.,.,. ... 位移?入的影响 在以上所探讨的最佳实验条件下,分别扫描测定?九,,,,,,, 时,与相互作用的同步荧光光谱。当 或 时, 所得二者相互作用的同步荧光光谱比较匀称,在此微环境下,的内源性荧 光主要来源于酪氨酸或色氨酸残基,从同步荧光光谱可以看出,在此实验条 件下, 及其类似物对的内源性荧光猝灭程度最大。因此,进行同步荧光光谱 、 。 扫描时,选用 综上所述,本章实验所采用最佳实验条件为:在 比色管中,分别加 入.. . ?缓冲溶液,. ?以溶液,. .一?以的溶液,. 不同浓度的或其类似物溶液,以 二次水定容至 。混合均匀并静置 。荧光激发和发射狭缝均为, 用石英比色皿,在 一 范围内,沁 ,扫描记录荧光发 第二章及其类似物与相互作用的研究 一 、 射图谱:固定激发和发射波长差?九为 、眦,分别记录在 一 波长范围内的同步荧光光谱图;波长间隔均为 ,分别记录 一 、 一 其在激发和发射波长为 /的波长范围内的三维 荧光光谱图。 .. 及其类似物与相互作用的荧光光谱 按照实验方法测定在溶液中分别加入不同浓度的或其结构类似 物的荧光图谱,图.为与及?号类似物发生相互作用的荧光光谱图 其它类似物的荧光光谱图没显示。 羞?? 亚 口 ? 卸 日棚 蝴 硼?嘲嘶蝴 图. 及其类似物对荧光光谱的影响,入, .,. ?~,.×书?~,分别表 示或其类似物的浓度为,.,.,.,.,.×一?~。 在.×西.的溶液中,分别加入不同浓度的或其类 似物溶液,扫描其相互作用后的荧光光谱。由图.可知,在激发波长为 时,的最大荧光发射波长为 ,在一定浓度范围内,的荧光强度随 或其类似物浓度的增加而降低,出现典型的荧光猝灭现象,由前面实验结 果可知,无水乙醇对的荧光强度无影响,表明及其类似物与发 生了相互作用,猝灭了的内源性荧光,这种猝灭作用可能引起中荧光 发色团的微环境及蛋白质分子构象行为的变化强?。 .. 及其类似物与相互作用的荧光猝灭机理 荧光猝灭过程主要分为动态猝灭和静态猝灭两类,动态猝灭主要是由于猝灭 剂与激发态荧光分子之间发生相互碰撞引起的,而静态猝灭是由于猝灭剂与 荧光 物质形成了不发光的配合物引起的。第二章及其类似物与相互作用的研究 如果及其类似物对荧光猝灭过程为动态猝灭,可依据. 方程分析处理实验数据: /【】】 . 分别测定、、下与及其类似物发生相互作用的荧 光光谱,利用不同温度下的实验结果,以/对相应的及其类似物浓度作图, 经过一元线性拟合后得到及其类似物对猝灭的.曲线图 .。由图.可见,在整个实验浓度范围内,/与】呈良好的线性关系。由 式.求得、。、时与及其类似物相互作用的猝灭常数, 计算结果如表.所示。 ? ? 图.不同温度及其类似物与相互作用的曲线, ?.,入 ,、‰、加或。。同图.。 表.不同温度下及其类似物对的猝灭常数?? ‘小 .’ . ..【】 .. . . 【】 .×? . ..【】 ..× .×’ . 【】 ...” . 】 ...× . ’】 .? . ..【】 .. . . 】 .×’ . ..×】 .” . ..【】 .’ . ..,【】 .. .? . 【】 .. .×? . 【】 。?啪蛐。?嘲:萎.?啪 。?啪一。?嘲一?啪 .. × .’ . 】 . . ..×【】 从计算结果可看出,对于及其结构类似物与相互作用的体系, 第二章及其类似物与相互作用的研究 及其类似物对荧光的猝灭常数随温度升高而减小,可以初步判定 此过程为静态猝灭过程,其表观猝灭速率常数远大于各类猝灭剂对生物大分 子的最大动态猝灭速率常数.× 一,进一步证明动态碰撞不是引起 荧光猝灭的主要原因,而是由于这种化合物与形成了复合物,从而使 的内源性荧光猝灭。 .. 及其类似物与相互作用的结合常数 由于静态猝灭作用是导致及其类似物对荧光猝灭的主要原因,所 以采用静态猝灭公式即方程: ?吐吖 】. . 处理实验数据,以对相应的】。作图,如图.所示。根据斜率可得 到不同温度下及其类似物与发生相互作用的结合常数见表.。 。 图.不同温度下及其类似物对的结合常数的影响,., 入珊, ‰、‰、啪或。同图.。第二章及其类似物与相互作用的研究 从表中可看出,及其类似物与的结合常数较大且随温度的升高而 略有减少,表明及其类似物与之间有较强的结合作用,形成了 复合物,并且温度对结合常数的影响较小。比较同一温度下个化 合物与的结合常数可知,与的结合常数最大,对荧光的猝 灭能力最强,号化合物的结合常数最小,猝灭能力最弱。个化合物与 发生相互作用时的结合常数的大小次序依次为。 个化合物与发生相互作用时所表现出来的差异性与它们所含活性基 团的性质有关,由图.可知,个化合物具有相同的联苯骨架结构,其区别在 于,’.位的官能团不同。比较发现:.含有两个.基团,号含有 两个.基团,?号含有一个.基团和一个.基团,号含有一 个.基团和一个.基团,含有一个.基团和一个 基团:.号在无水乙醇中的溶解度最小,疏水作用最弱;?号与 相互作用的结合常数最小,猝灭能力最弱;号具有较强的疏水作用和猝灭 荧光的能力;与相互作用的结合常数最大,猝灭能力最强,这与 中所含的两个.基团有关,与相互作用的结合常数大于 号,主要与二者所含活性基团.和.性质的差别有关。 .. 及其类似物与之间的相互作用力类型 药物和蛋白质之间的结合力主要为疏水作用力、氢键、范德华力和静电引力 等。等根据大量的实验结果,总结出了判断生物大分子与小分子结合力类型 的热力学规律,根据反应前后和?的相对大小,可判断药物与蛋白质之间的 第二章及其类似物与相互作用的研究 主要作用力类型:当,时,主要表现为疏水作用力;,, 主要表现为氢键和范德华力;,,主要表现为静电引力。在温度变化 不大时,反应的焓变可以看作一个常数,由可以求出反应的自由能变: 一// . ?一. 图.为及其类似物与相互作用的热力学曲线,计算结果见表.。 图. 及其类似物与相互作用的热力学曲线 表.不同温度下及其类似物与相互作用的热力学参数 从表中数据可以看出:及其类似物与的作用过程是一个放热过程 ,由于及其类似物具有非极性的苯环结构,因此可以插入蛋白质第二章及其 类似物与相互作用的研究 的疏水区域,释放出蛋白质中结合的水分子,使原来排列有序的体系混乱度 增加, 因而反应过程出现了熵增现象,当时,通常认为是典型的疏水 作用】,?时,主要为静电引力作用【。由计算结果可知,?,但 据此并不能把二者之间的相互作用力主要归因为静电引力,在结合反应中只 要有 氢键存在,恒为负值【】,因此不能用单一的作用力类型来解释热力学参数的 正负性。有利于反应的自发进行,据.式可知,对的主要贡献 来自与?而不是,所以疏水作用是该结合反应的主要作用力类型,但不能 排除氢键作用力的存在。 .. 及其类似物与相互作用的结合距离的计算 根据非辐射能量转移理论【厶,可以计算出及其类似物受体 与分子中色氨酸残基供体之间的距离。能量转移效率与距离的关系如 下式所示: 一//& . 式中,表示能量转移效率,和分别为加入猝灭剂前后测得荧光物质的 荧光强度,民为临界距离,为供体.受体间的距离。 能量转移效率为%时的距离称为临界距离凡。 时.×吨奄叫 . 式中,‖为供体.受体间空间取向因子,为介质折射率,:为给体的荧光 量子产率,表示供体的荧光光谱与受体吸收光谱的重叠积分。 ?柚 ?/九?九 . 式中,为荧光供体在波长九处的荧光强度, 的为受体在波长九处的摩尔 吸收系数。 据文献报道【,对于,;,.,.。及其结构 类似物的吸收光谱与的发射光谱均发生了明显的重叠,对光谱重叠部分进 行积分运算可求得值。图.为的荧光光谱与及号类似物其 它类似物的图谱没显示吸收光谱的重叠图,计算结果见表.。第二章及其类似 物与相互作用的研究 曲 ? ? 州 哝 邮 晡 ?目口? 叫 峨 幔 叫 图. 的荧光光谱与及号类似物的紫外吸收光谱的重叠图 ,磨.,眦. ?。:的荧光光谱图, ‰. ‘ ?一,入;:或号类似物的紫外吸收 ?。 光谱图,嘲.×. 表. 与及其类似物相互作用的结合距离 由计算结果可以看出:号、号、和这个化合物与 色氨酸残基间的结合距离相差不大,而号与的结合距离最大,推测 号、号、和与发生相互作用的结合位点可能位于的 同一结构区域,而?号则结合在的不同区域;均小于眦,表明 色氨酸残基与及其类似物之间能够发生有效的非辐射能量转移;凡说 明这个化合物对内源性荧光的猝灭过程不是以能量转移为主,而是以静 态猝灭为主,即静态猝灭是导致及类似物对的内源荧光的猝灭主要因 素,同时存在能量转移猝灭。 .. 及其类似物对构象的影响 ... 及其类似物与相互作用的同步荧光光谱研究 常运用同步荧光光谱探讨蛋白质中酪氨酸和色氨酸微环境的变化情况【。 的内源性荧光主要来源于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基。 时, 第二章及其类似物与相互作用的研究 同步荧光光谱只显示酪氨酸的光谱特征, 时,仅显示色氨酸的光谱特 征【】。 图.为及其号类似物与相互作用的同步荧光光谱图,其它 随着及其类似物浓 类似物的同步荧光光谱图没显示。从图中可以看出, 度的增加,酪氨酸和色氨酸的荧光强度逐渐降低。图.中酪氨酸的荧光峰从 红移至 处,说明酪氨酸所处微环境疏水性略有降低,极性增加【刀】。 附近,而酪氨酸的 由图.可看出中色氨酸的最大发射波长在 荧光强度值小于色氨酸的,表明的荧光主要来自色氨酸,其荧光谱峰从 红移到 处,说明色氨酸所处微环境的极性和疏水性均发生变化。色氨 酸残基的荧光猝灭程度比酪氨酸更明显,揭示出及其类似物主要与中 的色氨酸形成复合物。 劫 骞 柚 ? \ ~. 柚 柚 蛳 锄 撕 期 、岫嘲 入衄 ? 图. 及号类似物与相互作用的同步荧光猝灭光谱,实验条件同图 .,:入;入。 第二章及其类似物与相互作用的研究 ... 及其类似物与相互作用的三维荧光光谱研究 三维荧光光谱法是近年来发展逐渐成熟和完善的分析方法,能够更加科学可 靠地反映蛋白质与小分子结合前后其构象的变化情况。 图.为和 .三维荧光光谱图结构类似物与相互作用的三维荧光图谱 没显示,由图可知,其酪氨酸和色氨酸的荧光峰位置发生了较小的红移,且图 谱等高线的疏密度明显减小,荧光强度显著降低,该实验现象进一步表明 及其类似物与可能生成了复合物,与及其类似物的结合位置可 能就位于这种疏水腔内,由此可推测,及其类似物与发生了相互作用, 改变了氨基酸残基所处的疏水性环境,的构象发生了改变,由此可得出与