大鼠血清孕激素水平对胚胎_植入窗_的预测作用_cropped

大鼠血清孕激素水平对胚胎_植入窗_的预测作用_cropped 3大鼠血清孕激素水平对胚胎“植入窗”的预测作用 1 1 2 1谭宗建李尚为邱东升韩字研 ( ) 1. 四川大学华西第二医院 生殖免疫室 成都 610041; 2. 华西第二医院 生殖内分泌实验室 () 【内容摘要】 目的 探讨大鼠血清孕激素 水平对胚胎“植入窗”的预测作用。方法 收集自然交配孕 3, 10 P 天大鼠的血清及子宫组织, 以动情期雌鼠为对照。 通过组织学切片确定各孕天发生胚胎着床的大鼠数, 以 ,2. 5P 间距表示胚胎“植入窗”。 采用放射免疫法测定大鼠血清 水平。 用免疫组化 法和计算机图像 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 检97. 5 P P L sA B () 6. 65 天,胚胎着床的中位数时间为 测孕激素受体 在孕早期大鼠子宫内膜及胚胎滋养层细胞中的表达。结果 PR ( )大鼠胚胎“植入窗”在孕 4. 65, 8. 68 天之间。 孕 3, 10 天大鼠血清 曲线的峰值出现在“植入窗”内 孕 5, 8 天。 P 在大鼠内膜腺、腔上皮、基质细胞、蜕膜细胞及滋养层细胞中均有表达, 其表达强度曲线的峰值也出现在大鼠胚 PR 胎的“植入窗”内, 并与血清 水平呈显著性正相关; 在大鼠滋养层细胞中的表达随妊娠期增加而升高, 与血清 P PR ()无显著性相关。、与胚胎植入时间均呈显著性相关 相关系数分别为 01868 和 01724, < 0105。结论 通P PPR P P 过上调自身受体, 对胚胎“植入窗”具有重要调节作用, 可能是胚胎“植入窗”的启动因子。连续监测血清 可作为 P P 确定“植入窗”的生化标记。 【关键词】 孕激素 孕激素受体 植入窗 胚胎 【中图分类号】 492. 6Q Ta n Pred ic table Fun c t ion of Blood Proge steron e Con cen tra t ion on Em bryo “ Im p lan ta t ion W in dow ” in Ra t 3 3 , , , , Zo n g j ia n L i S h a n gw e iQ iu D o n g s h e n g H a n Z iy a n L ab of R ep rod u c t ion and Im m u n ity W es t C h ina S econd , , 610041, H osp ita lS ich u an U n iv e rs ity C h endu C h ina 【】 “A bstrac tO bjec t ive T o eva lua te th e po ssib ility o f u sing p ro ge ste ro ne a s a p red ic tab le ind ica to r o nim 2 210 3p lan ta t io n w indow ”in ra t. M e thods T h e u te ru s and se rum o f p regnan t ra t w e re co llec ted du r ing day s o f ge sta t io n, and th e ra t in e st ru s w a s u sed a s co n t ro .l T h e num be r o f ra t s w ith em b ryo n ida t io n o ccu r r ing p e r day o f th th , 2. 51597ge sta t io n w a s de te rm ined by h isto lo g ica l in sp ec t io nand th e im p lan ta t io n w indow w a s def ined by th e to () . ; p e rcen t ileT h e se rum p ro ge ste ro ne P co ncen t ra t io n w a s m ea su red by rad io imm uno a ssayth e exp re ssio n o f p ro 2 () ge ste ro ne recep to r PR in endom e t r ium and t rop ho b la st ce ll w a s de tec ted by h isto imm uno ch em ist ry and quan t if ied th () . 6. 5; by com p u te r im age ana ly sisRe sults T h e im p lan ta t io n h app ened o n th e day o f ge sta t io n m ed ianth e im 2 th th ()4. 65 8. 68 2. 597. 5. p lan ta t io n w indow lay be tw een and day s o f ge sta t io n to p e rcen t ileT h e se rum P co ncen t ra2 ( “”528 t io n o f p regnan t ra t s va r ied lik e a w ave and reach ed p eak du r ing th e em b ryo im p lan ta t io n w indow day s o f ). , p regnancy PR m a in ly exp re ssed in lum ina l and g landu la r ep ith e lium endom e t r ia l st rom a l ce ll and t rop ho b la st ; , , , ce llth e in ten sity o f it s exp re ssio nshow ing sign if ican t co r re la t io n w ith se rum P app ea red lik e w aveand it s p eak . lay be tw een im p lan ta t io n w indow tooT h e in ten sity o f PR exp re ssio n in t rop ho b la st ce ll ro se w ith p regnan t da te . and show ed no sign if ican t co r re la t io n w ith se rum PBo th P and PR w e re sign if ican t ly co r re la ted w ith im p lan ta t io n t im e o f em b ryo. Con c lus ion B y up 2regu la t ing o f it s ow n recep to r, P h a s som e im po r tan t ro le s in em b ryo im p lan2 . ta t io n and m ay be th e p rom o to r o f im p lan ta t io n w indowSucce ssive m o n ito r ing o f P se rum co ncen t ra t io n can be .u sed a s a b io ch em ica l ind ica to r o f im p lan ta t io n w indow 【Key words】 P ro ge ste ro ne P ro ge ste ro ne recep to r Im p lan ta t io n w indow Em b ryo 近年来研究表明, 卵子受精后, 子宫内膜仅在某尚不能直接观察子宫内膜在胚胎“植入窗”期间所发 一 特定的时间段内接受胚胎着床, 即所谓的“植入 , 故无法确知胚胎“植入窗”的开始 生的适应性变化 1 () 窗”, 一般认为在卵子受精后的第 4, 8 天。 目前 及持续时间。 孕激素 , 对于胚胎着P ro ge ste ro n eP 床至关重要, 但其与胚胎“植入窗”的关系尚缺乏详 ( ) 3 国家自然科学基金 批准号 39970764和四川省计划生育委 细研究。本实验旨在探讨 对胚胎“植入窗”预测的 P ( ) 员会基金 批准号 972423资助 可能性及其机理, 寻找一个能简便、有效预测胚胎 “植入窗”的生化指标。替一抗, 同批检测, 每个标本兼作 染色。 H E 1. 2. 4 染色结果判定 阳性染色为细胞浆和 PR 1 材料与方法 细胞核内出现棕黄色颗粒, 以细胞核阳性染色为主。 1. 1 实验动物、试剂与仪器 以多媒体彩色图像分析系统进行定量分 300 M ISA 雌 性 大 白 鼠, 体 重( ) 健 康、成 年 及 未 产 仔 的 析: 用显微摄像头 200〓随机选取每张切片 10 个 SD ( 200, 250 , 由我校实验动物中心提供 合格证号: 区域, 将图像输入计算机。以阳性细胞灰度值代表染g )() 川实动管第 70 号。 臵于室温 18, 22?, 相对湿度色强度, 反映 的相对含量, 结果用任意单位 PR U 65%, 75% 的屏障系统内饲养, 自由摄食、饮水。 兔 表示。 () ( 抗大鼠 受体 的多克隆抗体 美国 1. 3 统计学方法P PR San ta C ru z ) 各组 及 之间的比较用方差分析, 各组发 P PR 公司生产, 生物素标记的二抗和辣根过氧化物酶标 ( ) 链卵白素 美国 公 司 生 产, 显 色 生胚胎着床的动物数之间的比较用秩和检验, 及B u r lin gam e DA B P ()剂 美国 公司生产。孕酮双抗法放射免疫检 , 检验与胚胎“植入窗”的关系用等级相关分析PR Zym ed ()测试剂盒 购自天津德普生物制品有限公司。水准 = 0. 05。M IS2 Α A - 300 计算机图像分析仪。结果2 1. 2 实验方法 ( 实 验 持 续 22 天, 实 验 对 象 淘 汰 4. 5% < 1. 2. 1 动物实验将 雌性大鼠编号后随机分 SD )9 个组, 每组 10 只, 分别为: 孕 3 天、孕 4 天、孕 5为 20% 。 各实验组大鼠体重, 实验前后各组大鼠体重 () 天、孕 6 天、孕 7 天、孕 8 天、孕 9 天、孕 10 天组以及 及各组孕鼠的仔鼠数均无显著性差异 > 0. 05。P 动情期对照组。通过阴道涂片确定雌鼠动情期, 并于 2. 1 大鼠妊娠以后胚胎的植入情况动情期内以 1?1 比例与雄鼠合笼, 阴道涂片发现精 大鼠胚胎一般植入子宫内膜的对系膜侧, 在胚 子之日定为妊娠第 1 天。胚泡尚未着床前, 处死大鼠 胎着床的第一天, 组织学切片上可见囊胚透明带消 后冲洗子宫腔及输卵管, 找到胚胎以确定妊娠; 胚泡 失, 孕鼠子宫内膜腔上皮细胞崩解、融合, 子宫腔消 着床后, 通过组织学连续切片, 计数各孕天发生胚胎 失, 囊胚被融合的子宫内膜所包被。孕 4 天即有胚胎 着床的雌鼠数, 以 , 间距表示胚胎着床 开始植入, 但大部分胚胎在孕 5, 7 天开始植入大鼠 2. 597. 5 P P 子宫内膜, 孕 9 天还有少数孕鼠发生胚胎植入, 孕 3 的时间范围, 即“植入窗”。 ()1. 2. 2 血清 测定采用放射免疫双抗法进行检天与孕 10 天均未发现胚胎植入 附表。胚胎着床的 P 测。中位数平均时间在孕 6. 5 天, 大鼠胚胎“植入窗”位 组织学标本制备及染色 每只大鼠分别取于孕 4. 65, 8. 68 天之间。 见图 1。 1. 2. 3 同侧子宫组织, 10% 福尔马林缓冲液固定, 浸蜡, 按2. 2 大鼠早孕期的孕激素水平 纵横两个方向包埋于石蜡之中, 5切片。 免疫组 大鼠妊娠以后血 逐渐升高, 其峰值出现在孕Λm P 织化学 法染色, 阳性对照为已知 阳性的5, 8 天, 位于胚胎“植入窗”内, 随后降到动情期水 L sA B PR () 平, 见附表。 大鼠卵巢切片, 阴性对照以磷酸盐缓冲液 PB S代θ() 附表 大鼠血清 、的定量分析及妊娠后不同时间胚胎的植入情况 ?PPR x sθ() , ?Re sults of ra t serum PPR quan t ita t ive ana ly s is an d em bryo im plan ta t ion on d if f eren t day s of ge sta t ion x sTable () PR U N um be r o f ra t s w ith em b ryo Se rumG ro up s ()ƒP p gm l n ida t io n o ccu r r ing E ndom e t r ium T rop ho b la st 0 - E st ro u s 〒7. 86 〒6. 27 37. 89139. 07330 - d 44. 15〒14. 89142. 95〒9. 11 41 - 54. 92〒5. 95144. 64〒3. 20d ##57 74. 24〒 154. 97〒 - d 11. 875. 45##610 - d 70. 65〒 150. 83〒 4. 346. 65##76 75. 74〒 155. 53〒 - d 27. 627. 16# 82 64. 56〒 〒9. 23 136. 23d 17. 19138. 85〒14. 92?91 144. 27〒 d 143. 87〒9. 058. 4944. 37〒12. 47? 10 d 0 48. 89〒7. 70135. 03〒9. 68155. 19〒 6. 34 3 33 ; #d m ean s rd day o f p regnancy P < 0. 05 w h en com p a red w ith E st ro u s g ro up; ? P < 0. 05 w h en com p a red w ith 8 th day o f p regnancy 图 1 大鼠胚胎着床后形成的卵柱。HE ×40 图 2 PR 在孕 10 天大鼠子宫内膜腺体细胞中的表达。HE ×400 图 3 PR 在孕 10 天大鼠子宫内膜基质细胞中的表达。 HE ×400 图 4 PR 在孕 10 天大鼠胚胎滋养层细胞中的表达。 HE ×400 th ×40 2 10F ig 1 The egg co lumn f orm ed af ter em bryo im plan ta t ion in ra t. HE F ig PR expre ss ion in en dom e tr ia l g lan d ce lls of day th ×400 3 10 . pregnan cy group in ra t. HE ×400 F ig PR expre ss ion in en dom e tr ia l stroma l ce lls of day pregnan cy group in ra tHE th 4 10 ×400 . F ig PR expre ss ion in trophobla st ce lls of day pregnan cy group in ra tHE )2. 3 PR 的表达 0105。 2. 4 在动情期大鼠的子宫内膜中, 只表达于腺、 P 与“植入窗”的关系 PR 孕鼠血清 的浓度与 在子宫内膜中表达的腔上皮细胞, 在内膜基质细胞中没有表达。 孕 3, 5 P PR 天, 在子宫内膜腺、腔上皮细胞表达增强, 并在 强度具有相似变化趋势, 其曲线的峰值均位于胚胎PR () 蜕膜细胞中开始有表达。 孕 6, 7 天, 在内膜腺、“植入窗”内 孕 4. 65, 8. 68 天。 经等级相关检验,PR ( 0. 868, 和 与“植入窗”都呈显著性正相关 = 腔上皮细胞及蜕膜细胞的维持较强表达。 孕 8, 10P PR r ) 天, 在内膜腺、腔上皮细胞中的表达较弱, 在壁 < 0. 05 和 = 0. 724, < 0. 05。PR P rP 蜕膜细胞中的表达强度也很弱, 但在基蜕膜的巨型 3 讨论 () 蜕膜细胞 以后参与构成胎盘的母体部分中仍维持 3. 1 胚胎“植入窗”较高水平的表达。在孕 8, 10 天的大鼠胚胎滋 PR 养层细胞中均有表达, 与母体基蜕膜细胞邻近的滋 胚胎“植入窗”是指哺乳动物的子宫内膜能允许 胚胎着床的一个极短的关键时期。在“植入窗”内, 子 养层细胞表达较强。 见图 2, 4。 表达的定量分析见附表, 在孕 3, 4 天 宫内膜的形态、显微结构及生化等方面要发生一系 PR PR 2 3列的变化以适应胚胎着床。等 通过观察大鼠子宫内膜中的表达较动情期有所增强, 但差异 B u sch e r (( )无显著性 > 0. 05。 孕 5, 7 天 大鼠胚胎“植入 104 例因不孕症进行 2的妇女发现, 人类胚 P IV F E T ) () 窗 ”内, 的表达较动情期显著增强并达到峰值胎的胚胎植入发生在排卵后的 6. 6 天 50,“植入 PR P ( )()( 窗”位于排卵后的 5. 9, 7. 5 天 25, 。以往的0. 75< 05 。 孕 8, 10 天 降 到 动 情 期 水 平 > P P P P 参与了子宫内膜的蜕膜化和对蜕膜细胞能通过 研究对胚胎“植入窗”的确定大多是通过间接实验,PR 所获数据不够精确。 本实验通过观察孕 3, 10 天的 的功能调节。 在孕 8, 10 天, 在子宫内膜中的表 PR (大鼠胚胎着床情况确定“植入窗”, 结果较为可信。本 达降到动情期水平, 但在基蜕膜的巨型蜕膜细胞 参 ) 研究发现, 大鼠胚胎着床发生的时间为孕 6. 5 天, 与 构成胎盘的母体部分中仍有较强表达, 说 明 P ( ) 可能对胎盘母体部分的形成也有作用。在孕 8,“植 入 窗”在 妊 娠 受 精 后的 第 4. 65, 8. 68 天PR 3( ) 215, 与 等 97. 5, 报道的人类“植入10 天 的 大 鼠 胚 胎 滋 养 层 细 胞 中 有 表 达, 并 逐 天 增 P P B u sch e r 窗”时间相近。强, 提示 参与了孕早期胚胎滋养层细胞的功能调P 节。综上, 可能充当了胚胎滋养层细胞与母体子宫 3. 2 P 与胚胎“植入窗” P 近年来的研究已充分证明胚胎“植入窗”存在于内膜之间相互作用的协调因子。 3. 3 对胚胎“植入窗”的预测作用人及其他哺乳动物, 如何确定“植入窗”的开始及持P 续时间对于辅助生育技术及节育措施的发展意义重 本实验发现, 早孕期大鼠 与 曲线的峰值 P PR 大, 但目前尚缺乏简便易行的生化指标进行监测。出现时间与胚胎“植入窗”基本吻合, 经等级相关检 P 对胚泡着床至关重要, 无 P 时, 囊胚虽能生存几天,验, 其相关系数达 0. 868 和 0. 724, 说明大鼠血 及P 在子宫内膜中表达变化的时相与“植入窗”的开但不能植入。人类约有 10%, 40% 的不孕症和反复 PR 1 2流产是由黄体功能不足所致。本实验发现, 孕鼠血 , 等报道的放及持续时间具有较强相关性B u sch e r 清 在孕 5, 8 天迅速上升并达峰值, 几乎为动情期 人类“植 入 窗”的 时 间 与 妇 女 排 卵 后 黄 体 中 期 的 P P 4 的 两倍, 峰出现的时间与大鼠的胚胎“植入窗”相 峰也基本吻合, 进一步说明 与胚胎“植入窗”密 P P 当。提示大鼠的“植入窗”需大剂量的 维持。P M illi2 切相关, 可能是胚胎“植入窗”的启动因子, 连续监 P 4测血 可作为确定“植入窗”的生化指标。等 也发现, 切除早孕期小鼠的卵巢, 不同孕期P gan 小鼠维持妊娠所需的 P 的量是不同的: 在胚胎尚未 参 考 文 献 ( ) ( 着 床的孕早期 孕 1, 4 天, 只需极低量的 正常 P 1 祝彼得 司徒亮. 妊娠生理. 张丽珠. 不孕症. 见: 曹泽毅主编. 中 ) 生理水平的 25% 即可允许胚胎着床; 但在随后的 华妇产科学. 第 1 版. 北京: 人民卫生出版社, 1999: 174, 175,() 着床阶段 孕 5, 9 天, 着床点的发展和子宫内膜的 2324, 2325迅速蜕膜化, 则需要大剂量的 才能维持妊娠。 在 P 2 , , , . A co sta A A E lbe rge r L Bo rgh i M et a lE ndom e t r ia l da t ing () 妇女排卵后的第 4, 9 天 即黄体中期, 也可观察到 and de te rm ina t io n o f th e w indow o f im p lan ta t io n in h ea lth y fe r2 5 ( ) . , 2000; 73 4: 788类似的 峰, 进一步说明胚胎着床前后的 峰对 t ile w om enF e r t il S te r il P P , , , . B u sch e r U Schm iady H k en ten ich H et a lD e te rm in ing im p lan2 3 于调节子宫内膜的容受性和允许胚胎着床至关重 . ta t io n t im e f ram o f t rop ho b la st by hC G leve l m o n ito r ing 要。( ) , 1995; 55 12: 661Gebu r t sh ilfe F rauenh e ilk d 要通过 才能发挥其生物效应。 本实验发 P PR , . M lilligan SR F inn CAM in im a l p ro ge ste ro ne suppo r t requ ired 4 现, 在大鼠子宫内膜中的表达与其血清 水平PR P . , 1997;fo r th e m a in tenance o f p regnancy in m iceH um R ep ro d 6 ( ) 12 3: 602 的变化基本一致, 但与张沅等报道的 PR 的 m R 2 吴熙瑞. 生殖内分泌学. 见: 罗丽兰主编. 不孕与不育. 第 1 版. 北 5 在 孕 早 期 大 鼠 子 宫 内 膜 中 表 达 的 变 化 趋 势 不N A 京: 人民卫生出版社, 1998: 38, 39 同, 可能是 的 与蛋白表达水平不一致所PR m RN A 张 沅, 朱国璋, 张友端等. R T 2PCR 测定大鼠妊娠早期孕激素 6 致。在孕 5, 7 天, 在大鼠子宫内膜的腺、腔上皮PR ( ) 受体基因的表达. 生物化学与生物物理学报, 1997; 29 3: 221 细胞中有较强表达, 可能与腺、腔上皮细胞的功能成 ( ) 2001209228 收稿, 2001212213 修回 编辑 沈 进熟有关。 在动情期大鼠的内膜基质细胞中没有PR 表达, 在蜕膜化的基质细胞中才有表达, 提示 P 可