荧光定量RT_PCR检测禽白血病病毒方法的建立及应用

中国动物检疫 2008 年第 25 卷第 9 期 禽白血病（AL），是由禽白血病病 毒（ALV）引起的禽类各种良性和恶 性肿瘤的一群疾病 [1] ，是危害养禽业 的主要疾病之一 [2]。 各种年龄鸡均可 感染发病,患病鸡极度消瘦，生长发育 不良，免疫反应低下，产蛋率下降，死 亡率高， 给养禽业造成重大经济损 失。 据调查，我国哈尔滨、北京等地部 分鸡场的带毒率在 20～100%之间，某 些鸡场禽白血病的病死率为 20～30% [3]，说明 ALV 在我国鸡群中的感染情 况已相当严重，并呈上升趋势。 快速 特异的诊断 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 对本病的诊断、监测 及净化具有重要意义。 目前主要通过 病毒分离鉴定和血清学技术诊断 AL，但这些方法都不同程度地存在操 作复杂、费时、费力或特异性不强、敏 感性不高等缺陷。 近年来出现的反转 录聚合酶链式反应（RT-PCR）已成为 快速检测 ALV 的重要手段 [4、5]，在此 基础上发展起来的实时 RT-PCR 由 于具有自动化程度高、 检测速度快、 敏感性好、特异性强等优势，广泛用 于多种病毒病的快速诊断、监测检疫 荧光定量 RT-PCR检测 禽白血病病毒方法的建立及应用 李佳桃 1，崔宝玉 3，岳 华 1，李明义 2，汤 承 1 (1.西南民族大学生命科学与技术学院, 成都 四川 610041；2.中国动物卫生与流行病学中心,山东 青岛 266032；3.山 东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 266101) 摘 要； gag 基因是禽白血病病毒 （ALV） 的群特异性基因， 根据 GenBank 中登录的 gag 基因的保守序列 （E46390）,设计合成了 1对引物，建立了基于 SYBR Green I模式的检测禽白血病病毒的实时荧光定量 RT-PCR 方 法。 该方法只对目的基因有扩增，对其它无关病毒核酸无特异性扩增；扩增效率为 94.6%；在 8.2×102～8.2×107拷贝的 范围内有很好的线性关系（Y=3.46X+31.8，r=0.9995）；最低可检测 82个拷贝的病毒核酸，与普通 PCR 方法相比，灵 敏度高出 1000 倍。 组内 CV为 0.28%～1.45%； 组间 CV为 2.13%～3.84%； 对 151 例临床疑似样本的检出率为 54.9% （83/151）。 随机选择 15份阳性样本 PCR产物克隆测序，结果证明扩增片断为 ALV的特异序列，与 ALV gag基因核 苷酸同源性为 97.8～98.9%； 对重庆 14个县的 14个健康商品蛋鸡群的 134份粪便棉拭子进行检测，ALV的检出率为 38.1%，鸡群的阳性率为 14/14。同时用实时 RT-PCR方法和 ELISA方法对从种鸡场随机采集的 30份 100日龄蛋鸡 的血清进行检测，实时 RT-PCR检测率为 5/30，ELISA方法检测率为 4/30。 本方法的建立为禽白血病的快速诊断、 大规模检疫、监测、流行病学调查以及药物筛选等提供了新的检测方法。 关键词：禽白血病病毒；gag基因；实时荧光定量 RT-PCR 中图分类号：S852.659.3 文献标识码：A 文章编号：1005－944X（2008）09－0025－04 Development and Application of Real-Time RT-PCR for Detection of Avian Leukosis Virus LI Jia-tao1，YUEHua1，LI MING-Yi2，TANG Cheng1 (1.College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China; 2.China Animal and Epidemiology Center, Qingdao 266032) Abstract：Gag gene is a group-specific gene in avian leukosis virus (ALV). A SYBR Green I-based real-time PCR was developed for detection of ALV by using a pair of primers that was designed to target conservative region of gag gene（E46390）. The results demonstrated that the real time RT-PCR established in this study showed several advantages: (1) High specificity. Positive amplification could be observed only from ALV DNA； (2) Good repeatabil- ity. The intra-assay and inter-assay CVwere 0.28%~1.45% and 2.13%~3.84% respectively； (3) Sensitive and rapid. The detection limit of the assay was 82 copies, 103 times higher than traditional PCR. The RRT-PCR also showed a broad linear range (8.2×102~8.2×107 copies, r=0.999) of quantification and high efficiency (94.6%). 151 suspected clinical samples were detected by the real time RT-PCR. And the detection rate is 83/151. Sequencing results of PCR products from 15 positive samples showed 97.8~98.9% nucleotide homology between sequences determined in this study and in GenBank, suggesting that this assay have good specificity for ALV. Total 134 fecal swabs were collected from 14 healthy egg flocks in 14 counties of Chongqing and detected by the real-time RT-PCR. 38.1% of samples were positive for ALV. The positive rate of ALV was 100 % (14/14) in virus-carrying flocks. 30 serum samples from the layers of 100 days were also detected using both real-time PCR and ELISA. The positive ratio were 5/30 and 4/30, suggesting a little higher detection rate of real-time PCR compared to ELISA. The real-time PCR assay developed in this study will be useful for rapid laboratory diagnosis, large-scale inspection，drug screen- ing and epidemiology investigation for the avian leukosis . Key words：Avian Leukosis Virus ; gag gene; Real-time SYBR Green 基金项目 ： 国家 “十一五 ” 科技支撑 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 （2006BAD06A011） 通讯作者：汤承 试验研究－25－ 中国动物检疫 2008 年第 25 卷第 9 期 及流行病学调查 [6-9]。 ALV 病毒体 RNA 拥有典型的慢转化型反录病毒 RNA 序列， 可分为 A、B、C、D、E 和 J 六个亚群，其中的 gag 基因编码病毒 的非糖基化结构蛋白，在各病毒亚群 间具有高度同源性。 ELISA 诊断 AL 都是针对 gag 编码的 P27 蛋白抗原 建立的[10]。 目前未见实时 RT-PCR用 于 ALV检测的报道[11-12]。 本实验针对 ALV 的 gag 基因设计引物，建立了检 测 ALV的实时 RT-PCR， 为 ALV 的 快速诊断、监测及分子流行病学调查 提供了有力工具。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 毒株及鸡胚 ALV 参考毒株 AV228、新城疫病毒 （NDV）F48E9 购 自中国兽药监察所 ； 禽流感病毒 （AIV）H5亚型、禽网状内皮综合症病 毒（REV)、减蛋综合症病毒（EDSV）抗 原由中国动物卫生与流行病学中心 提供；传染性支气管炎（IB）H52 弱毒 疫苗、鸡传染性法氏囊（IBD）弱毒疫 苗、马立克氏病（MD）疫苗由乾元浩 生物股份有限公司生产；传染性喉气 管炎 （ILT） 弱毒疫苗由 Bio Laryngo 公司生产；鸭瘟病毒（DPV）由西南民 族大学动物医学教研室分离保存 。 SPF 鸡胚为从南京兽医药械厂购买 的 SPF种蛋自行孵化。 1.1.2 主要仪器 7300 型荧光定量 PCR 仪 ， 美 国 ABI 公 司 ；VerSa Doc2000 凝胶成像系统 ， 美国 Bio- Rad 公司 ；PX2 梯度 PCR 仪 ， 美国 Thermo Hybaid 公司 ；DU 800 紫外 分光光度计 ， 美国 Backman 公司 ； 5804R 台式高速冷冻离心机， 德国 Eppendorf公司。 1.1.3 主要试剂 ：RNAiso Reagent、 dNTP、SYBR Premix Ex TaqTM、pMD 18-T Vector、 反转录试剂盒由日本 Takara 公 司 生 产 ，E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I 质 粒 提 取 试 剂 盒 由 OMEGA 公司生产 ，ALV-AG ELISA Kit由美国 IDEXX公司生产。 1.2 方法 1.2.1 引物设计 参考 GenBank 中 30 个 ALV 毒 株的 gag mRNA 核苷酸序列， 利用 DNAstar 生物软件进行同源性分析比 较，选出高度保守且特异的核苷酸区 域，利用 Primer 5.0和 Oligo6.0 软件， 设计一对引物， 采用 BLAST 工具进 行检索，初步验证其特异性。 引物由 成都金杰生物技术有限公司合成 。 ALV gag基因引物序列：P1：5'-CTTA TGGATCAAGGCATAGC -3' P2:5' - TAGTCCATCCCTCTCTCT-3', 扩增片 段大小为 91bp，其扩增位点为 1419- 1510。 1.2.2 RAV-1的增殖 将冻干 AV228稀释至 500μL ，取 200μL 接种鸡胚成纤维细胞（CEF）， 37℃ CO2 培养箱培养, 每隔 3天传代 一次，连续传至第 3代备用。 1.2.3 阳性 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品的制备 用 RNAiso Reagent 提 取 AV228 细胞培养物总 RNA， 按照反 转录试剂盒说明书合成 cDNA。 以 cDNA 为模板， 用下述条件扩增 gag 基因片段：在 25μL 反应体系中依次 加 入 P1、P2 各 1μL (10umol/L)； dNTP 2μL (2.5mM)；250 mM MgCl2 1.5μL；10 ×PCR 缓 冲 液 2.5μL； TaqDNA 聚 合 酶 (5U/μL) 0.125?L, DNA 模板 2μL , 用超纯水补足至 25μL；扩增参数为：95℃ 3min ；94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 30s，35 个循环 ； 72℃延伸 10min；4℃结束反应 ，PCR 产物用 2.5%琼脂糖凝胶电泳，GOLD VIEW 染色，目的片段连接 PMD18-T Vector，转化 DH5α 感受态细胞，挑选 阳性菌落， 进行菌液 PCR鉴定后，用 质粒提取试剂盒提取阳性质粒 DNA， 送成都金杰生物技术有限公司测序。 经测序验证的阳性质粒用紫外分光 光度计测定 DNA 标准品在 260nm 处光吸收值（A260），采用文献 [13]介绍 的方法，按如下 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 计算其拷贝数： 1μg 1000bp DNA=9.1×1011 作为本研究的标准阳性样本。 1.2.4 实时 RT-PCR方法的建立 1.2.4.1 反应体系优化 以得到最小的 CT 值并且在熔解 曲线分析中不产生非特异性峰为指 标，分别优化退火温度和引物浓度。 1.2.4.2 实时 RT-PCR标准曲线建立 将标准阳性样本连续 10 倍系列 稀释，用优化的实时 RT-PCR 条件进 行扩增， 以病毒拷贝数为横坐标，以 Ct值为纵坐标建立标准曲线。 1.2.4.3 实时 RT-PCR方法的特异性 用优化的 实时 RT-PCR 条件分 别检测 AIV、NDV、EDSV、IBV、REV、 IBDV、ILTV、MDV、DPV 以 及 正 常 SPF 鸡胚成纤维细胞的核酸样本，以 评价其特异性。 1.2.4.4 复性和再现性 用优化的 实时 RT-PCR 条件对 从 10-2 到 10-5 的 4 个稀释度标准阳 性样本进行检测，每个样本设 4 个复 管，计算其组内变异系数；上述样本 检测后－80℃保存，每周复检 1 次，共 复检 2次，计算其组间变异系数。 1.2.4.5 实时 RT-PCR 和常规 RT- PCR灵敏度的比较 分别用 实时 RT-PCR 和 RT- PCR 检测 10倍系列稀释（101-109）标 准阳性样本，以比较其灵敏度。 1.2.5 实时 RT-PCR 检测临床样本 采集临床表现为生长发育不良， 胸腺、法氏囊萎缩为主要特征的病鸡 肝脏、法氏囊及骨髓，按 1.2.3 提取总 RNA ,反转录合成 cDNA，以本研究 建立的实时 RT-PCR 进行检测，阳性 样本 PCR产物克隆测序。 1.2.6 病毒分离 随机挑选 4个 实时 RT-PCR 阳 性样本，研磨和无菌处理后接种 SPF 鸡胚成纤维细胞，37 ℃ 5%CO2培养 箱培养,每隔 3天传代一次，连续传至 第 3代,将细胞培养物用 1.2.3 中的方 法提取 RNA,反转录后用本实验室建 立的实时 RT-PCR 进行鉴定。 1.2.7 健康商品蛋鸡携带 ALV 的分 子流行病学调查 用本研究建立的实时 RT-PCR 对 重庆市 14个县的 14个健康商品蛋鸡 群的 134份粪便棉拭子进行检测。 2 结果 2.1 引物的特异性 本研究设计的引物能从阳性标 准样本中扩增出 100bp 左右的产物， 与预计片段大小相符，（图 1）。 PCR 产物测序结果分析显示为 ALV gag 基因特异性序列， 与 Gen- Bank中 30 个 ALV gag 基因核苷酸 序列同源性为 97.8～98.9%。 2.2 实时 RT-PCR反应优化条件 采用 20μL 反应体系 : SYBR Premix Ex TaqTM 10μL，ROX 0.4μL， P1、P2各 0.4μL，cDNA 2μL， 用ddH2O R R R 试验研究 －26－ 中国动物检疫 2008 年第 25 卷第 9 期 补到 20μL。 反应条件为 95℃ 2 min； 94℃ 15s，58℃ 30s共 40个循环。 2.3 标准曲线 实时 RT-PCR 的标准曲线图见 图 2。 标准曲线在 8.2×102~8.2×107 拷贝范 围内呈现良好的线性关系，相关系数 为 （r=0.9995，扩增效率为 94.6%，检 测下限为 82拷贝）。 2.4 熔解曲线分析 熔解曲线分析可见 ， 在 Tm= 81.7±0.8℃出现一单特异峰， 无引物 二聚体及非特异性产物（图 3）。 2.5 可重复性及再现性 实时 RT-PCR 检测 ALV 的组间 变异系数为 0.28～1.45%（表 1），组内 变异系数为 2.13～3.84%（表 2）。 2.6 特异性 特异性检测结果显示实时 RT- PCR 只能从 ALV 阳性样本中检出扩 增信号，不与 AIV、NDV、EDSV、IBV、 REV、IBDV、ILTV、MDV、DPV 以及正 常 SPF 鸡胚成纤维细胞等发生交叉 反应。 2.7 灵敏度 实时 RT-PCR 的最低检测限是 82拷贝/反应， 而常规 RT-PCR 最低 检测限是 8.2×104拷贝/反应。 2.8 临床样本实时 RT-PCR 检测结 果 实时 RT -PCR 对临床样本中 ALV 的检出率为 83/151，测序结果分 析显示，扩增片段为 ALV gag 基因的 特异片段，与 ALV gag 基因核苷酸的 同源性为 97.8～98.9%。 2.9 病毒分离鉴定 将病毒分离培养物在优化的条 件下进行常规 PCR 扩增， 经 2.5%琼 脂糖凝胶电泳分析。 在 100bp位置左 右出现一条特异性条带，表明分离到 的病毒为 ALV（图 4）。 3 讨论 3.1 本研究建立的实时 RT-PCR 方 法特异性强、灵敏度高、重复性好、操 作简便。 禽白血病给我国养禽业造成 的经济损失巨大，但本病目前并无有 效的治疗方法，也无有效的药物及疫 苗，建立快速、特异和高通量的检测 方法，及时检出和淘汰病鸡是控制本 病的主要手段。 本研究首次建立了检 测禽白血病的 RRT-PCR 方法， 该方 法特异性好，只从禽白血病阳性样本 中能检测出特异性扩增信号，不与本 研究检测的其他常见家禽病原发生 非特异性反应，扩增片段经测序证明 为禽白血病病毒的特异序； 对 ALV 检测的敏感性达到 82 个拷贝/反应； 通量高, 一次可以实时检测 96 个样 本，而且反应都在一个密闭管系统中 进行，避免了 PCR 产物污染问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ；检 测速度快, 从病料处理到报告结果检 测可在 5 h 内完成。 本方法的建立， 不仅克服了定期检测时病毒细胞分 离费时、费力的缺点，而且可以用于 活禽和禽产品中的快速检测，为鸡场 尽快采取针对措施节省时间，减少损 失。 也为以后禽白血病的临床辅助诊 断、检疫、疫苗中 ALV 污染检测、流 行病学调查以及药物筛选等提供了 新的检测方法。 3.2 AL对养禽业危害严重。 ALV感 染前期虽不产生明显可见肿瘤，但可 诱发鸡群的免疫抑制状态，引起感染 鸡只消瘦，产蛋下降等问题，还会导 致不同程度的继发感染、二重感染和 多重感染，如新城疫、大肠杆菌病等 [14]。 韦平 [15-16]等用 PCR 方法对广西 6 个地区的 139 个鸡群中临床表现为 免疫抑制、 多重感染的 505 只病、死 鸡的肿瘤及可疑肿瘤组织样品共 1570 份进行检测 ，ALV 阳性率为 6.73%，鸡群阳性率为 14.39%。 本研 究对临床表现为生长发育不良 ，胸 腺、法氏囊萎缩、骨髓褪色为主要特 征的病鸡组织中 ALV 的检出率为 54.97%， 对健康商品蛋鸡群粪便中 ALV的检出率为 38.1%，说明 ALV 在 鸡群和环境中普遍存在。 我们对这些 被检临床病例的流行病学调查分析 发现， 免疫器官损伤病例多见 30～70 日龄，ALV 可能是通过种蛋感染，也 可能是出壳后经环境或污染疫苗感 染，我们对不同厂家生产的几种弱毒 疫苗的检测结果显示， 疫苗中 ALV 污染严重（未发表）。 这可能是造成我 国目前鸡的一些重要传染病免疫失 败的重要因素之一[17]。 3.3 由于本研究是针对 ALV 的群 特异性基因设计引物建立的实时 RT-PCR, 无法鉴别样本中检出 ALV 的 gag 基因序列是来自内源性还是 外源性感染，因此，对临床样本的检 测不可避免假阳性结果的出现，这是 本方法的缺陷。实时 RT-PCR的检测 结果需结合临床症状综合判定。 参考文献 [1] Silva R F,Fadly A F.Evolution of ALV-J Strains [A]//International symposium on ALV -J and other avian retroviruses [C]. 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