离体培养的大鼠卵巢颗粒细胞和黄体细胞中松弛素样因子mRNA的表达及调节

离体培养的大鼠卵巢颗粒细胞和黄体细胞中松弛素样因子mRNA的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达及调节 离体培养的大鼠卵巢颗粒细胞和黄体细胞 中松弛素样因子mRNA的表达及调节 第二军医学2007Jan;28(1) AcadJSecMilMedUniv ? 短篇论着? 离体培养的大鼠卵巢颗粒细胞和黄体细胞中松弛素样因子mRNA的表 达及调节 Expressionandregulationofrelaxin-likefactormRNAinratovariangranulosacellsandlutei ncellsinvitro 张承玉,赵薇,程丹玲,朱辉,金秀东 (1.牡丹江医学院生理学教研室,牡丹江157011;2.哈尔滨医科大学生理学教研室,哈尔滨150086) [摘要]目的:观察松弛素样因子(relaxin-likefactor,RLF)mRNA在离体培养的大鼠卵巢颗粒细胞和黄体细胞中的表达,初 步探讨影响其表达调控的可能机制. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 :离体培养来自健康Wistar大鼠卵巢的颗粒细胞和黄体细胞,分别加入血小板活化 因子(PAF),促性腺激素(FSH或hCG),腺苷酸环化酶激动剂(Forscolin),蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波酯(PMA),以培养液 作为对照.采用RT—PCR方法观察各组RIFmRNA的表达,每组设5个复孔.结果:离体培养的大鼠卵巢颗粒细胞和黄体 细胞均有RLFmRNA的表达,颗粒细胞中加入PAF,FSH,Forscolin,PMA组RIFmRNA的表达均较对照组增强(P<0.05 或P<0.01);黄体细胞中加入PAF,Forscolin,PMA组RLFmRNA的表达均较对照组增强(P<0.05),但加入hCG组无明显 变化.结论:大鼠卵巢颗粒细胞和黄体细胞RLFmRNA的表达受PAF的正性调节,蛋白激酶A(PKA)和PKC信号通路的 激活可能促进RLFmRNA的表达. [关键词]松弛素样因子;颗粒细胞;黄体细胞;卵巢 [中图分类号]R339.22[文献标识码]B[文章编号]0258—879X(2007)01—01l1一O3 松弛素样因子(relaxin—likefactor,RLF)是1993年在猪 的睾丸克隆 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 中发现的n],是insulin-likefactor一3(INSL3) 基因的产物],属于胰岛素一胰岛素样生长因子一松弛素(in— sulin-IGF-relaxin)家族.人类该基因定位在19号染色体 p13.2-12.雄性哺乳动物RLF主要由睾丸Leydig细胞产 生,雌性主要由卵巢的卵泡膜细胞和黄体细胞产生.目前对 RLF的研究主要集中在反刍动物,对啮齿动物研究较少,国 内还没有RLF的实验性报道.本实验观察了RLFmRNA 在大鼠离体培养卵巢颗粒细胞和黄体细胞中的表达,探讨影 响其表达的可能机制. 1材料和方法 1.1实验动物25d龄健康雌性Wistar大鼠(60,70g), 由哈尔滨医科大学第二临床医学院实验动物中心提供,自然 光照,水食任取. 1.2主要试剂培养基干粉DMEM/F12,小牛血清均为 Hyclone公司产品,胶原酶?,血小板活化因子(plateletacti— vatingfactor,PAF),卵泡刺激素(follicle—stimulatinghor— mone,FSH),腺苷酸环化酶激动剂(Forscolin),蛋白激酶C 激动剂佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)均为 Sigma公司产品,孕马血清(PMSG)为天津实验动物中心产 品,注射用人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotro— pin,hCG)为宁波市激素制品厂产品,TRIzolRNA提取试剂 为GibcoBRL产品,TaKaRa逆转录试剂盒由大连宝生物工 程有限公司提供,引物由上海捷倍思公司提供. 1.3颗粒细胞培养大鼠颈部皮下注射PMSG50IU/只,促 进卵泡发育,48h后断髓处死,取出卵巢,用小号针头刺破卵 泡,释放颗粒细胞,用PBS冲洗,经滤网过滤,1100r/rain(r= 8.5cm)离心5min,弃上清,向细胞沉淀中加入含1O小牛血 清的DMEM/F12培养液,充分混匀,即得颗粒细胞悬液,稀释 至5×10j/ml,分装入6孔培养板.24h后加影响因素,对照 组加培养液,FSH终浓度1t~g/ml,PAF的终浓度1>g/ml, Forscolin的终浓度100ng/ml,PMA的终浓度100ng/ml,继续 培养24h后,每孔加TRIz0lRNA提取试剂1ml,反复吹打底 壁,收集细胞于一70C保存,用于总RNA提取. l_4黄体细胞培养大鼠颈部皮下注射PMsG5OIu/只, 促进卵泡发育,48h后颈部皮下注射hCG25IU/只,促进排 卵,6d后断髓处死,取出卵巢,去尽包膜,用小剪刀剪成糊 状,加胶原酶?消化3O,50rain,加入PBS,经滤网过滤, 1100r/rain(r=8.5cm)离心5min,弃上清,向细胞沉淀中 加入含1O小牛血清的DMEM/F12培养液,充分混匀,即 得黄体细胞悬液,稀释至s×10j/ml,分装入6孔培养板.24 h后加影响因素,将FSH改为hCG终浓度1U/ml,其余同 颗粒细胞. 1.5RT—PCR 1.5.1RNA的提取应用GibcoBRL公司TRIzolRNA 提取试剂,分别提取培养的颗粒细胞和黄体细胞的总RNA. 通过紫外分光光度仪测定提取的RNA样品在波长260nm 和280am处的光密度(D),使二者的比值保持在1.8O, 1.985之间,符合蛋白污染容许容量(1.8,2.0),根据D:..值 计算出总RNA浓度. [基金项目]黑龙江省博士后启动基金(2003).SupportedbyStartup FundforPostdoctoralStudentsofHeilongjiangProvince(2003). [作者简介]张承玉,硕士,讲师.E-mail:zcy6668815@yahoo.corlLcrl C0rresp0ndingauthor.E-mail:dzhuhui@yahoo.com.crl 哮零毒誊 !.1是鼠卵鞋颗粒钿胞中RLF 示.离体培推的颚粒细胞有RlF 表这强度在FS]4,PAFFi)rsc- 增强.均存境it'.意义clAF组相 和F0rsc~lin组<L儿: tuRNA的表连tll罔l mRNA表j.RI.F[1-RNA linI'MA刺激F较计H PMA井II1.|IFl1纠l 22太最卵巢贵性细胞中RI,FmRNA的表造如图2l听 示一嵩津培养的黄体细咆彳『R『.FmRNA丧选,统lr廿忻表 ?j{-RLFmRNA的表过蜢度在PAF,F『lr,ct~lin,PM,利融下 较j叫照组增强.均有统汁学意义(P_:.35J:hCG组丸嘲艋 变化 3讨论 印巢是十盟杂的内舒泌器官.泡的蚩青,成熟,排印. 黄帕形成,退化和雌激素的周鲫性许泌不经受下庀艟 垂体卵巢轴的悯.和即巢内一此局部墉拄婀于的埘节 有关;R【F是新近发现的{三要m腺恤的凋棒l孑.其在 口乳动物生蛾中的怍m越米越受到关: h '^PIll 441hp 图I用RF-PCR方法棱驯RllFnlRA在 大鼠离体培养卵巢颗粒细胞中的表达 ,:JI1Il乜港PSI.:l,,?IHI津:【fIJ蔓tIMx.i.--kl III—:I川:!:1sl{::i】I"1,l:ll?-】51【:I'M, 『II-.1'-?IJ钉m}llL转:一… 图0用R卜P【'R方法{盘铡R1FmRNA在 太鼠离体培养卵巢黄体细胞中的表达 ,kIF毫1{n:c,^f]Il『I也t木【剖;t.m?盘l}, )!:I:计1l_:lI'IiYl【.P,!II1llI P'j.照蛆比聩:.=1,ll{ 上_一?.u 一二二] 上__==] 埘 一 第1期.张承玉,等.离体培养的大鼠卵巢颗粒细胞和黄体细胞中松弛素样因子 mRNA的表达及调节 在雄性,RLF主要是由睾丸Leydig细胞表达,通过RT— PCR技术可以观察到在其他组织也有转录,如前列腺_3].在 雌性,RLF显示更广泛的分布,卵巢是RLF的主要来源_|], 此外,在子宫基质和胎盘,甲状腺,乳腺等部位也观察 到RLF的表达.已有报道[9],敲除RLF基因将导致小鼠卵 泡闭锁及黄体退化加快,动情周期也从正常的6,7d延长 为14~20d,并且发现其卵泡及黄体凋亡率更高.另有文献 报道[1,敲除该基因的雌性小鼠不孕,主要原因是影响了卵 泡的发育和动情周期.有实验显示RLF的表达与优势卵泡 的选择有关[1.上述研究均提示RLF与雌性生殖有密切关 系. 本实验用RT—PCR方法发现RLFmRNA不仅表达于 大鼠卵巢黄体细胞,也在卵泡颗粒细胞中表达.为进一步研 究影响RLFmRNA在大鼠卵泡颗粒细胞和黄体细胞表达的 可能机制,我们选择了促性腺激素(FSH和hCG),PAF和两 条经典的细胞信号转导通路的激活剂,来观察这些因素对大 鼠卵泡颗粒细胞和黄体细胞RLFmRNA表达的影响,探讨 其可能的机制. FSH是下丘脑分泌的促性腺激素,初级卵泡发育晚期, 颗粒细胞上出现FSH受体,到次级卵泡期FSH受体进一步 增加,颗粒细胞培养液中加入FSH1p.g/ml,结果显示FSH 组RLFmRNA的表达增强,提示FSH促进卵泡发育可能部 分是由于FSH促进了RLF增多的结果.向黄体细胞培养 液中加入hCG1U/ml,结果显示hCG组RLFmRNA的表 达无明显变化,提示已分化成熟的黄体细胞RLF,的表达是 非促性腺激素依赖型的.PAF与生殖关系密切,参与排卵, 受精,着床,胚胎发育,分娩等生殖过程.有实验显示 PAF参与排卵和黄体形成,本实验结果证明PAF组RLF mRNA的表达较对照组增强,说明颗粒细胞和黄体细胞 RLFmRNA的表达受该细胞因子的正性调节,PAF参与排 卵和黄体形成可能与促进RLFmRNA的表达有关.For— scolin是蛋白激酶A(PKA)的激动剂,PMA是PKC的激动 剂,本实验结果显示此两组RLFmRNA的表达均比对照组 增强,说明PKA和PKC通路的激活可能促进RLFmRNA 的表达. [参考文献] [1]AdhamIM,BurkhardtE,BanahmedM,eta1.Cloningofa eDNAforanovelinsulin—likepeptideofthetestieularLeydig cells[-J~.JBiolChem,1993,268:26668—26672. E23BurkhardtE.AdhamIM,BrosigB,eta1.Structuralorganization oftheporcineandhumangenescoding{oraLeydigcell_.specificin—_ sulin—likepeptide(LEYI-I)andchromosomallocalizationofthe humangene(INSL3)l_J].Genomics,1994,20:13—19. 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