电针对局灶性脑缺血大鼠缺血区APP与Tau1蛋白表达的影响.doc

电针对局灶性脑缺血大鼠缺血区APP与Tau1蛋白表达的影响.doc 电针对局灶性脑缺血大鼠缺血区APP与Tau 1蛋白表达的影响 作者:徐振华 许能贵 符文彬 刘健华 【摘要】 目的 探讨电针对缺血后脑白质损伤的保护机制。方法 采用热凝闭大鼠大脑中动脉致局灶性脑缺血模型，随机分为假手术组、缺血组和电针组，观察电针对脑缺血后6 h缺血区淀粉样前体蛋白(APP)、Tau 1蛋白的影响。结果 电针组APP、Tau 1蛋白的表达较模型组明显降低(P<0.05)，与假手术组比较无明显差异(P>0.05)。结论 早期电针对脑缺血后APP和Tau 1 蛋白表达的增多有明显的抑制作用，可减少缺血对脑白质的损伤。 【关键词】 电针;脑缺血;脑白质;APP;Tau 1蛋白 缺血性卒中是脑白质急性缺血性损伤的重要因素，卒中后脑白质损伤是神经功能障碍的重要原因〔1〕。脑白质区损伤可破坏神经元之间、皮质和皮质下中枢之间的信号传递，临床上可表现为感觉运动功能、视觉空间技能、联想能力与精神运动功能下降〔2〕。脑白质区损伤也可造成其神经纤维投射区的灰质损伤，脑白质损伤主要表现为少突胶质细胞的损伤和髓鞘破坏。脑白质具有缺血易损性，少突胶质细胞和髓鞘化的神经纤维对缺血性损伤极为敏感，在神经元不可逆性损伤之前已有皮质下白质的改变〔3〕。长期以来，脑缺血的基础和临床研究多集中于神经元或灰质的损伤反应上，而一直忽视对脑白质损伤的研究〔4〕，但是脑缺血后神经功能的最终恢复不仅依赖于对神经元和灰质的保护也有赖于对白质的保护。脑白质损伤有其独特的机制，因此有必要将脑白质损伤作为神经保护治疗的独立指标进行观察。脑缺血后受损的少突胶质细胞大量表达Tau 1蛋白，轴突则表达淀粉样前体蛋白(APP)，因此可用免疫组化的方法对其进行标记〔5,7〕。本研究通过对脑缺血后轴突和少突胶质细胞的改变进行定量分析，探讨缺血后脑白质损伤及针刺的影响。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1 动物分组 广州中医药大学动物实验中心SPF级Wistar大鼠60只〔合格证号No.0014065，许可证号SYXK(粤)，2003 0001〕，全部雄性，体重180,240 g，自来水喂养，饲用普遍颗粒型大鼠饲料(含蛋白23%，脂肪4.7%，钠盐0.24%)，动物房温度控制在18?,26?，光暗周期12 h。抽签法随机分为假手术组、模型组和电针组，每组10只大鼠。 1.2 制模方法 采用电凝闭大脑中动脉致局灶性脑缺血模型〔8〕。假手术组只作手术暴露大鼠大脑中动脉，不予凝闭，模型组造局灶性脑缺血模型，电针组造模后给予电针治疗。 1.3 治疗方法 电针组选取督脉经穴百会(GV20)、大椎(GV14)两穴，其定位参照大鼠的常用针灸穴位〔9〕:“百会”位于顶骨正中;“大椎”在第7颈椎与第1胸椎间，背部正中。以1寸毫针(0.3 mm×25 mm，苏州医疗用品厂生产)向后斜刺百会0.5寸(16.7 mm)，直刺大椎0.5寸，两穴接上电针(G 6805,上海华谊仪器厂生产)，用疏密波，5,10次/s，强度以大鼠安静耐受为度，约2,3 V，时间30 min。其他两组大鼠在同等条件下饲养，未予任何处理。 1.4 观察指标与方法 1.4.1 神经运动功能体征的观察与评分 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 3组大鼠造模后6 h按时间段分别进行神经功能行为评分。评分标准参照Bederson和Belayev等〔10，11〕的方法，0分:行为完全正常，步态平稳;1分:提起鼠尾离开地面，非损伤侧前肢内旋、内收;2分:将大鼠置于地面，推动大鼠躯体检查两侧抗力，非损伤侧抗力下降;3分:将大鼠置于地面，观察其行走，只向一侧转圈;4分:无法站立或虽能站立但不能自行行走。评分越高，损伤越重。 1.4.2 APP、Tau 1蛋白样品采集及处理 6 h后，随机取每组大鼠各6只用10%水合氯醛麻醉，心脏灌注固定，取脑组织放入4%多聚甲醛中，准备石蜡包埋及切片。大鼠脑组织石蜡包埋切片后进行相应的免疫组化染色。 1.4.3 免疫组织化学染色 APP、Tau 1蛋白的免疫组织化学染色均严格按 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 操作。 1.5 图像分析及统计学处理 确定免疫标记的部位，应用Image Plus6.0图像分析系统测定梗死周围区的光密度值(OD)，测定时首先明确阳性反应物的颜色范围，选定统一的色彩区域进行测量以避免非特异性染色所造成的误差，以OD除以照片面积算出平均光密度，进行半定量分析。数据以x?s表示，使用SPSS11.5软件包中单因素ANOVA计算法和最小显著性差异(LSD)检验法来进行均数的显著性检验。 2 结 果 2.1 神经症状行为学体征的变化 假手术组大鼠神经行为学表现均正常，评分均为0分。大鼠的神经学评分6 h后模型组为(2.38?0.52)分，电针组为(2.13?0.64)分，大鼠多表现为一侧前肢内旋或内收，侧向挤压时损伤对侧肌力下降，部分可以转圈行走或偶尔转圈行走。同时间段模型组和电针组与假手术组比较有显著差异 (P<0.001);模型组与电针组之间比较无明显差异(P>0.05)。 2.2 免疫组化检测APP的结果 大鼠造模后6 h缺血区皮质脑区APP表达阳性反应物部位呈棕黄色。模型组APP的表达于6 h明显升高〔(28.83?3.48)OD〕，与假手术组〔(24.05?2.86)OD〕比较差异有显著性意义(P<0.05)，电针组APP表达〔(24.89?2.23)OD〕于6 h较模型组明显降低(P<0.05)，与假手术组比较无明显差异(P>0.05)。见图1。 2.3 免疫组化检测Tau 1蛋白的结果 大鼠造模后6 h缺血区皮质脑区Tau 1蛋白表达阳性反应物部位呈棕黄色，胞核呈蓝色。模型组Tau 1蛋白的表达于6 h明显升高〔(28.77?3.55)OD〕，与假手术组〔(23.43?2.37)OD〕比较差异有显著性意义(P<0.01)，电针组Tau 1 蛋白的表达〔(22.64?2.71)OD〕于6 h较模型组明显降低(P<0.01)，与假手术组比较无明显差异(P>0.05)。见图2。 图1 三组大鼠造模后6 h缺血区皮质APP的表达(免疫组化，×200)图2 三组大鼠造模后6 h缺血区皮质Tau 1的表达(免疫组化，×200)3 讨 论 长期以来，脑缺血的研究焦点一直集中在神经元缺血反应上，而对脑白质缺血性损伤的研究被忽视。然而脑缺血后神经功能的最终恢复不仅依赖于对灰质的保护,而且还依赖于对相关白质的保护。近年来已提出脑缺血全脑保护的概念，即在脑缺血发生后，将大脑作为一个完整的功能体进行保护，不仅要保护神经元，而且也要保护神经胶质细胞和轴突;不仅要保护灰质，而且也要保护白质。脑白质具有选择性缺血易损性，而轴突和少突胶质细胞是其最易受损的成分。脑缺血后受损的少突胶质细胞可大量表达Tau 1蛋白，而轴突则表达APP，因此可用免疫组化方法对其进行标记〔4〕。 在中枢神经系统中少突胶质细胞主要参与髓鞘的形成和维持，是仅次于神经元的易损细胞。不同发育阶段的少突胶质细胞对缺血缺氧的易损性不同，晚期少突胶质祖细胞和未成熟少突胶质细胞最易受损〔12〕。髓鞘化或未髓鞘化的轴突是神经元之间的联络通道，也是脑白质的重要成分之一，同样具有缺血易损性。脑白质缺血性损伤可破坏神经元之间，皮质和皮质下中枢之间的信号传递，临床上常表现为视觉空间技能、联想能力和精神运动功能下降。 研究表明，脑缺血后Tau 1蛋白、APP的表达增加〔5， 13，14〕，本研究提示在脑缺血6 h后缺血脑区周围即出现Tau 1蛋白和APP的表达明显增加。说明Tau 1蛋白和APP是脑缺血的敏感指标之一。 由于受研究经费限制，本研究只观察电针对缺血后6 h缺血区Tau 1蛋白和APP表达的影响，本研究提示早期电针对脑缺血后Tau 1蛋白和APP表达的增多有明显的抑制作用，减少脑缺血对脑白质的损伤，从而起到脑保护的作用。已有研究表明脑白质缺血性损伤的保护作用主要包括以下几个方面〔15，16〕:?改善脑白质区血液灌注，增加供血供氧;?抑制炎性胶质细胞反应;?钠通道阻滞剂;?钙通道阻滞剂;?反向Na+ Ca2+通道阻滞剂等。本课题组以往的研究表明:电针督脉经穴“大椎”、“百会”能明显改善缺血区脑组织的局部血流量，阻止脑缺血后血流量的下降〔17〕;电针可阻止脑缺血后Ca2+内流，调节Ca2+稳态〔18〕。这可能为电针保护脑白质缺血性损伤的机制。 【