探究幽门螺旋杆菌

探究幽门螺旋杆菌 , 探究幽門螺旋桿菌 ,Helicobacter pylori, 尿素酶相關基因及其與疾病的相關性 指導老師,王錦堂 教授 薛如娟 老師 二年溫班 李孟諭 陳昭妤 中華民國89年6月 一、研究動機 近年來有越來越多的證據顯示,幽門螺旋桿菌的感染和慢性胃炎 以及消化性潰瘍的形成有密切的關係。此外,亦有許多的資料顯 示幽門螺旋桿菌的持續性感染是導致形成胃癌和胃黏膜淋巴癌的 主要因素之一,為人類重要病原。 胃方面的疾病一直是國人十大死因中高居不下的一位。在現在吃 得越來越精緻的同時,生病的人數並沒有相對的減少的情況下, 我們希望藉此一窺胃潰瘍及胃癌等疾病的始作俑者??幽門螺旋 桿菌,Helicobacter pylori, 二、研究目的 利用先前已製備突變株的基因庫,篩選出不能利用H. pylori所具 有的控制urea代謝能力的H. pylori變種,找出其基因,根據其基 因型來研發抵抗疾病的方法。 三、實驗器材 ,一,材料 幽門螺旋桿菌,Helicobacter pylori,的突變株 ,二,儀器 37?微嗜氧條件的培養箱,N,80%, CO,15%, O,5%, 222 無菌操作台 微量吸管 ,pipetment, 細菌接種環 培養皿 棉花棒 本生燈 旋轉平台 電子秤 酒精燈 三角玻棒 離心小管,1.5 & 0.5 ml, 乾浴槽 水浴槽 震盪機 比色管 分光比色計 一般離心機 冷凍離心機 真空乾燥機 電泳槽 核酸自動定序儀 水平搖盪器,shaker, 可控溫設定程式之PCR儀器,Programmable Thermal Controller, UV攝影機 石蠟紙,parafilm, ,三,藥品 哥倫比亞瓊脂培養基,Agar + Kanamycin 10 ppm + 10%羊血, 尿素斜面瓊脂,urea slant, 回收DNA套組,QIAquick Gel Extraction Kit, 無菌水 cell lysis buffer protein precipitation solution,NHOA, 4C 異丙醇,Isopropanol, 1%洋菜膠,Agarose, 二次去離子水,dd HO, 2 TAE buffer ethedium bromide Hind ? 10X PCR buffer ligase 10X ligation buffer Primer 1’ Primer 2’ dNTP 四、研究過程或方法 幽門螺旋桿菌,Helicobacter pylori,為螺旋狀,在其一端具有4~6 根的端鞭毛的革蘭氏陰性菌,形狀如桿狀,一直到1982年才正式 從胃炎和消化性潰瘍病人的胃黏膜上第一次被分離出來,Marshall and Warren, 1984,。 幽門螺旋桿菌的基因組大小約 1700 kb 左右,可 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 現出的蛋白質 約有六百種。幽門螺旋桿菌通常會在胃黏膜層表面生長,因此幽 門螺旋桿菌必須能存活在酸性的環境中,目前主要是認為幽門螺 旋桿菌在細胞的表面會釋放出尿素酵素,將尿素分解生成氨、二 氧化碳及水,而將幽門螺旋桿菌細胞周圍的酸性環境中和,以利 其生長。 從實驗中我們觀察得知H.pylori 具有可控制代謝urea的基因,當 其遇到尿素時能產生urease,可將urea代謝生成二氧化碳和銨離 urease +子,urea CO+NH,使其得以在胃中如此酸的環境ph=3生存 24 下來。而對人體造成傷害。就目前所知的研究範疇,部份控制urease 的基因已被實驗證明出來,而我們所希望探究的是一些未知的基 因,進而瞭解H.pylori和疾病間的相關性。 測試時我們使用尿素瓊脂斜面,urea slant,,內含酸鹼指示劑,所 以當指示劑因鹼性而變粉紅色時,可由此得知細菌控制urease的 基因未遭破壞,因而可在測試管中代謝urea。挑出未變色或變化較 不明顯的菌號,做進一步的研究。 流程圖, 細菌培養 ? 測試urea性狀 ? DNA抽取 ? DNA序列分析 ,一,細菌培養,培養由實驗室先前置備的1500種H. pylori突變株, 以挑選在urea test中變色較不明顯的菌株編號,做 進一步的實驗。 1 將冷凍於- 70? 培養的H.pylori突變株stock取20λ滴於盛 有哥倫比亞瓊脂培養基的培養皿上,每一培養皿等分為八份, 均勻塗開,以利細菌生長,放置於37?微嗜氧條件的培養箱中 ,N,80%, CO,15%, O,5%,且較濕的環境下培養。 222 2 次培養,subculture, 將八分盤上的H.pylori刮下,塗在新的八分盤上再次觀察。 * 培養基成份,哥倫比亞瓊脂培養基 ,Columbia Agar, Kanamycin 10 ppm 500λ Amphtericin B 2 ppm Vancomycin 3 ppm ,抑制腸內菌的抗生 素共1cc, 10%羊血 25 ml 3 尿素測試,urea test, 將次培養的細菌用棉花棒刮下來放入1000λ的無菌水中,再用 微量吸管在充分吹吸後,吸取700λ用吸光值來判斷其所含菌 之濃度。,定於波長600λ時,吸光值介於0.1~1.0之間為可用 之範圍,我們根據幾次實驗的數據而定下A600λ=0.1為我們 所需的菌濃度。,藉由吸光度計算,調整每一號碼之濃度相 同,吸出相對應的體積滴入urease測試管中,放置20分鐘後, 比較其變色的差異。 ,二,DNA抽取,抽取培養中未變色菌號的DNA以做基因的判定。 1 洗菌 將長滿菌落的培養皿放在旋轉平台上加入2?無菌水,用消 毒過,浸泡酒精並過火乾燥,的三角玻棒輕輕刮下,將含有 菌的水吸入離心小管加以離心。 2 打破細胞,cell lysis, 加入600λcell lysis buffer ,pH8.5,與菌輕輕吹吸混合,放置 於乾浴槽中加熱至80?,5分鐘。 3 蛋白質之變性沉澱,protein precipitation, 加入200λprotein precipitation solution,NHOA,,使蛋白質 4C 變性以便離心。離心兩次,各10分鐘。 4 DNA酒精沉澱 取離心後的上清液,加入600λ的異丙醇,Isopropanol,,輕 輕搖晃後可看見雲霧狀的纏繞DNA。 5 DNA分離 將DNA放入- 70? 冷凍庫隔夜,用4? 冷凍離心機離心取 上清液,加入1?70% 的酒精洗去殘留物,做spin down。接 著加以真空乾燥15分鐘,加溫以揮發酒精,加入80?的ddHO 2 以溶解DNA,放置在室溫中隔夜。 6 DNA電泳 將DNA與dye混合,加入1%洋菜膠的小孔,well,裡 〈loading〉,並加入marker做為DNA濃度與大小的基準。電 泳槽中加入TAE buffer,通入150V電流,電泳15分鐘。完 成後將洋菜膠放入ethedium bromide 以shaker均勻染色,並 以UV光及攝影機呈像。 ,三,DNA 序列分析 1 DNA酵素完全切碎,complete digestion, Genomic DNA 15λ Hind ? 2λ 10X buffer 3λ DdHO 10λ 2 total V 30λ # 37?,隔夜 2 DNA黏合,ligation, complete digestion DNA 5λ ligase 1λ 10X buffer 2λ DdHO 12λ 2 total V 20λ # 16?,18hrs 3反向聚合酶連鎖反應,inverse PCR, DNA 5λ primer1’ 2λ primer2’ 2λ dNTP 2λ 10X buffer 5λ Taq 1λ DdHO 33λ 2 total V 50λ # 96? 5’ 96? 1’ 58? 1’ 30 cycles 72? 1’ 30” 72? 10’ 4? 24hrs 4 DNA序列分析,sequencing, mix { Taq polymerace,dNTP+ ddNTP,2.5X buffer} 4λ templete 5λ primer 1λ total V 10λ 實驗操作過程之注意事項 1 所有與細菌有關的實驗都必須盡可能的在無菌操作台上操作以避 免汙染 2 stock從冷凍庫中取出後不能使其回溫過久,以免失去活性 3 若使用冷凍保存之培養基務必不能使培養基上帶有水份,以免影 響實驗的準確性 4 使用恆溫培養箱時一定要將空氣抽取乾淨,減少恆定條件的變化 5 電泳loading後不可大力搖晃電泳槽,避免DNA浮出 6 將洋菜膠染上ethedium bromide時務必要小心,此為致癌物 7 加藥品時先加入體積較大者,若一次需數樣藥品同時加入時,可 先將所有藥品混合再加入 8 在做urea test 時,注意管子需平放,以防範細菌過於集中於某一 點,使濃度分布不均,造成實驗誤差 五、實驗結果 在經過培養600個突變菌株後,我們挑選到了其中6個變色較不 明顯的菌號,推測其控制urea代謝相關的基因遭到破壞,並將其 DNA加以分析定序。 菌號 對應基因 功能 10-20 HP0746 Unknown 10-23 UreB Urease subunit 10-31 HP0373 Putative outer membrane protein 10-35 HP0771 Unknown 10-59 HP1207~HP1208 Unknown 10-72 UreB Urease subunit ,一, DNA電泳結果 《附圖1.2.3.》 ,二, sequencing結果 《附圖4》 六、討論 ,一,一開始實驗時,我們並沒有考慮到菌量濃度的影響,所以實驗 的結果並不理想,可信度也不高,在經過研究討論之後,我們 採取了較為繁複的定量方式,重新開始實驗,希望能夠降低誤 差。 ,二, 實驗室先前所製備的基因庫,約有1500個突變株,我們僅就其 中的600個來進行實驗,而事實上需要篩選過一整個完整的基 因庫才具有代表性,因此雖然目前我們已經看到部分和代謝urea 相關的基因,但仍要在篩選過所有突變株之後,才有可能有一 個較為完整的結果。 ,三, 根據我們目前所做出的DNA序列分析,可以初步知道這些和代謝urea相關的基因的位置,但仍無法確定代謝urea的功能是否為其他上游基因所間接控制,或由這些我們所判讀出的基因本身直接控制,也無法得知是否有其餘數個基因與其共同控制性 狀的表現。 七、結論 ,一, 因為之前的實驗經驗,使我們這次採用了較為麻煩的方法?利 用吸光度,使待測菌之濃度均相等、測試時間也都一樣,若是 沒有採取濃度的定量,則urea管的變色將會受到菌量多寡而有 程度上的差異,使得即使被篩選出來的突變株,可信度也不高。 所以,濃度定量,大大減少了可能影響實驗一個嚴重的誤差性, 也相對的提高了我們實驗的準確性。 ,二, 在這次篩選過程所挑出來的六個突變株,比對網路上的基因庫 後,有兩個(10-20 &10-72)的基因型和先前已被研究證實的ureB 此基因型幾乎完全相同,這就更加確定了我們實驗方向及方法 的正確性。更幸運的是我們還比對到了三個尚未有明確功能 (Unknown)的菌號,因此,未來可以朝這三個基因和urease的 相關性研究。 幽門螺旋桿菌為對人類體來說為一重要之病原,未知的部份還很多、其發展性亦甚大,我們只就其中的一小部分進行研究,而我們的實驗設計中還有很多缺失與不完滿,我們將繼續努力,綜合上述之方 法並再加以研究改良來尋求能有更多更好的研究結果。 八、參考資料 曹銘陽 以表現基因庫及基因比對選殖幽門螺絲桿菌之多重藥物 排出幫浦相關基因 林肇堂 胃腸疾病與幽門螺旋桿菌,健康世界雜誌社。1995 誌謝 張凱誌先生 林稚容小姐