[doc] 渗透促进剂对大鼠舌下黏膜及胰岛素舌下给药的影响

[doc] 渗透促进剂对大鼠舌下黏膜及胰岛素舌下给药的影响 渗透促进剂对大鼠舌下黏膜及胰岛素舌下 给药的影响 渗透促进剂对大鼠舌下黏膜及胰岛素舌下给药的影响 崔纯莹,张悦,张强卜,王桂玲,吕万良,张姬,丁晓岚(I北京夫学药学院约剂学系.北京100083;2.北京大学药学院化学 ,丰物学系,北京100083:3清华大学生物系生物膜j膜牛物T?程同家再点实验窜.北京10(X)84) 摘要:目的研究不同渗透促进制对蛋白多肽药物舌下吸收的影响及作用机制方法以胰岛素为模型药,考察各种渗透促 进荆经正常大鼠舌下给药后降血糖的效果,以皮下注射为对照,计算胰岛素舌下给药的药理相对生物利用度(PA%);采用拉 曼光谱,圆二色谱和荧光偏振实验技术考察渗透促进剂对大鼠舌下黏膜的膜脂流动性及膜蛋白构象的影响,结果一般情 况下,胰岛素溶液经舌下给药后的生物利用度较低,渗透促进制苄泽35,蛋黄卵磷脂和壳聚糖均能显着增加胰岛素溶液的降 血糖作用;渗透促进剂能够影响膜脂的微观结构和膜蛋白的构象,不同渗透促进刘的影响差别较大一苄泽35,蛋黄卵磷脂和 壳聚糖能够增加膜脂的流动性,并使蛋白构象趋于松散,从而提高黏膜的通透性,促进胰岛素的舌下吸收,并 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现为降糖作用 的增加结论渗透促进剂可以不同程度地影响膜脂流动性和膜蛋白 构象,提高胰岛素经舌下给药后的降糖效果. 关键词:胰岛素;舌下给药;渗透促进剂;拉曼光谱:圆二色谱;荧光偏振 中图分类号:R943文献标识码:A文章编 号:1001—2494(2004)04—0279—04 Effectsofvariouspenetrationenhancersonthesublingualabsorptionofinsulininrats CUIChun—ying,ZHANGYue.ZHANGQiang 卜,WANGGui—ling.,Lt=_Wan.1imlg,ZHANGXuan,DINGXiao- lanj1. DepartmentPharmaceaticsSchoolofPharmaceuticaliences,Pekng(rdterqt),Beqing100083,China2.Departmentof ChemicalBiolog)”,SchoolofPharmaceuticalSciences.kingUm?+,ersit~.&ing100083.China;3.StateKe)La~rato0,ofBiomernbrane andMembraneBiotechnolog).DepartmentofBioh~gicdSciencesandBioteehnolog),Tsingh{ml?m?+ersit),Beijing100084,China) MISTRACY:OBJECTIVETostudytheeffectsofvariouspenetrationenhancersonthesublingualab~rptionofinsulininrats.METHODS SeveralabsorptionenhaRCersWelXO~lectedtobeco--administeredfhinsnlinsublinguallyinrats.11}1esublingualabsorptionofinsinwas calculatedbyitspharmacologicalbioavailability(PA%)comparedtosubcntaneouslyadministeredit~ulinsolntion.Theeffectsofpenetration enhancersonthestructuralpropertiesofthesublingualmembraneofratswere investigatedbyFourierTransformRamanSpectro~opy,Circular DichroismandnuorPF~eneePolarizationnvitro.RESULTSThepermeabilityofinsinsignificantbincreasedcomparedtocontmlafterco- administrationwithBrij35,chitosanandegglecithin.AfterbeingtreatedwithBrij35,egglecithinandchitosan,notonlythefluidityofsublin— guallipidmembraneincreasedbut,alsotheconformationofthemembraneproteinloo.~xt.Theinvestigatedpenetrationenhancersproduceddif- ferenteffects.CONCLUSIONPenetrationenhaneerF,eaRchangetl1efluidit,ofmembranelipidan(1theconformationofmembraneproteinin certaindegrees,andincreasethesublingualabsorptionofinsulin. KEYWORDS:insulin;sublingual;penetrationenhancers;Falnanswctro~opy;circulardichmism;fluorescencepolarization 胰岛素的非注射给药一直受到人们广泛关注:通过口 腔黏膜给药可以避免胃肠道的酸碱环境和酶的降解,避免肝 脏的首过效应?;口腔黏膜层薄,黏膜下毛细血管丰富.为药 物的吸收提供了良好的生理条件;同时口腔(或舌下)给药也 是非常方便,患者易于接受的方式..研究表明,蛋白与 多肽类药物舌下给药因其渗透系数较小,生物利用度较低; 在处方中加入适当的渗透促进剂可以促进药物透过舌下黏 膜J,提高生物利用度.关于蛋白质和多肽类药物的舌下给 药有一些研究报道],但有关渗透促进剂对舌下黏膜结构 的影响研究较少.本实验通过正常大鼠舌下给药模型,考察 了胰岛素溶液(INS-SOL)舌下给药后体内降血糖的效果,并 比较不同渗透促进剂对其降糖作用的影响;采用拉曼光谱, 圆二色谱和荧光偏振法考察了渗透促进剂处理前后膜脂微 观结构和膜蛋白构象的变化,比较了体外细胞膜结构改变和 药效之间的关系 1材料与方法 1.1材料与仪器 胰岛素原料(27.7u?mg,.徐州生化制药有限公司),苄 泽35(Bfij35)(si舭公司),环糊精(cD,陕西礼泉化工实 业有限公司),壳聚糖(chitosan,脱乙酰度85%,青岛海汇公 司),聚山梨酯80(Tween80,Siona公司),蛋黄卵磷脂(eggleci— thin,上海太伟药业).泊洛沙姆(poloxamer,Sigma公司),油酸 作者简介:崔纯莹,女,博士研究生通讯作者:张强,男.教授,博士生导师Tel:(olo)82802791Fax:(010)82802791E—mail ccy1553@yahoo.oom.cn:ccy1553@163.tom :2004年4月第39巷第4Chin?不,lJ.2004April,Vo1.39No.4?279? (oleicacid,天津市化学试剂一厂),戊巴比妥钠(中国医药公 司北京采购供应站),血糖测定试剂盒(北京中生生物有限公 司),其他试剂均为分析纯.Sprague—Dawley(SD)大鼠,雄性, (2504-20)g,(北京大学医学部实验动物中心). 950型傅里叶变换拉曼光谱仪(美国Nicolet仪器公司), JASCO一750型圆二色仪(美国JASCO公司),HITACHI一850 荧光仪(日本HITACHI公司),口腔定量喷雾器(15mL装量, 每喷体积为14mL),由德国Pfeiffer公司赠送. 1.2实验方法 胰岛素溶液及渗透促进剂溶液制备:分别配制含蛋黄 卵磷脂(5%),泊洛沙姆(5%),苄泽35(5%),油酸(5%),聚 山梨酯80(5%),壳聚糖(5%)和环糊精(5%)的胰岛素溶 液(pH7),除蛋黄卵磷脂需溶于适量的丙二醇中并与胰岛素 溶液超声混合均匀外,其它渗透促进剂均直接溶解于胰岛素 溶液中,以pH7的磷酸缓冲液作为空白对照.将上述实验 样品分别装入口腔喷雾器中. 体内降血糖实验:取正常大鼠随机分组,每组5只,实验 前禁食l8h,自由饮水.实验前取大鼠空白血作为空白对照 的血糖值.大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠40mg?kg麻醉,然 后将动物固定在手术板上,手术结扎动物的食管.向大鼠舌 下喷人药液,剂量为l0u?,,维持动物俯卧姿势,使药物停 留在舌下区域并不溢出口腔外.皮下注射1u?kg的胰岛 素作为对照,通过降糖分数一时间曲线上面积(areaabovethe curve,AAC)计算药理生物利用度(pharmacologicalbioavailabili. ty,PA).不同时间于大鼠眼眶取血0.2mL,按照血糖试剂盒 要求,测定各样品的血糖值. 拉曼光谱测定:大鼠用乙醚麻醉致死,手术打开口腔,取 出其舌下黏膜.用冰冻的Tris—HC1(pH7.4,0.05mol?L)洗 涤3遍,拭干,用0.5%胰酶37?消化2h,除去黏膜下的毛细 血管,黏液及结缔组织,用”Iris缓冲液淋洗干净,室温干燥, 置于干燥器中保存备用.将上述舌下黏膜分别浸泡在各种 渗透促进剂的溶液中处理2h,取出用Tris缓冲液淋洗干净, 室温干燥.其中一组舌下黏膜经脱脂处理作为对照,方法是 用CHCl3.MeOH(2:1)在37?浸泡舌下黏膜1h,然后取出,用 “Iris缓冲液淋洗干净,室温干燥,密闭保存.将处理好的舌下 黏膜直接放入傅里叶变换拉曼光谱仪的检测器上,在室温下 检测,测量范围为3700200cm,,分辨率为1cm,,扫描次 数为31300次,测定并记录每个样品的拉曼光谱. 膜碎片制备:大鼠用乙醚麻醉致死,手术取出其舌下黏 膜,用冰冻l~Hanks液洗涤2—3次至澄清,拭干,用剪刀将 其剪成碎片,用冰冻D.Hanks试液洗涤至澄清,在玻璃研钵 中研磨成糜状,再置于玻璃匀浆器内匀浆.匀浆液用3层灭 菌纱布过滤,滤液低温离心(300r?min)0.5h,收集上清液, 4?下在玻璃匀浆器中轻轻研磨,用超声波细胞破碎机处理1 min,低温超速离L,(3o000r?min)1h,收集沉淀物,称重,得 到舌下黏膜细胞膜团块.操作过程尽量在低温下进行. 圆二色谱测定:取上述舌下黏膜细胞膜团块0.5mg,用 pH7.4的磷酸缓冲液0.5mL重新分散(细胞团块终浓度为 „ 280?Ch/nPharmJ,2004ril.Io1.394 0.5g?L),分别加入不同的渗透促进剂溶液0.5mL(渗透促 进剂终浓度为5%),轻轻振摇并在37?水浴中温育0.5h. 取样200在圆二色谱仪上进行测定.采用1lnnq比色杯, 扫描范围为190,250hill,灵敏度为50毫度,每个样品扫描4 次并迭加.图形拟合程序采用J一700测定各种二级结构含 量 荧光偏振测定:取上述舌下黏膜细胞团块20mg,用DH 7.4的磷酸缓冲液1mL重新分散悬浮,分别加入不同的渗透 促进剂溶液900(渗透促进剂的终浓度为5%),37?温育 0.5h,再加入2×10一mol?L的1,6.二苯基一1,3,5一己三烯 (DPH)四氢呋喃溶液100『止(DPH终浓度为1×10,mol? L),在37?温育0.5h.在荧光分光光度计上测定4个方 向(0,0;0,90;90,90;90,0)的荧光偏振值(I?,I?,I?和1w), 发射波长为432hill,激发波长为362nnl,扫描速度60nnl? min,,狭缝为10hill,按照下式计算荧光偏振度P值和平均 微黏度.P=(Ivv—G1w)/(1w+GIvn)=(2×P)/(0.46一 P)(式中G=IHv/I删). 1.3统计学分析 组间显着性检验采用方差分析及t检验,P<0.05为差 异有显着性,P<0.01为差异极显着性. 2结果 2.1不同渗透促进剂对正常大鼠降血糖作用的影响 与舌下给予l0u?的胰岛素溶液组相比,本实验所选 的7种渗透促进剂均能够不同程度增加胰岛素溶液经舌下 喷雾给药后的降血糖作用.5%的ehitosan,5%的egglecithin 和5%的Brij35对于胰岛素的降糖作用有明显的促进效果, 其中5%的Brij35作用最明显(P<0.O1).与皮下注射相比, 10u?kg的胰岛素组的PA%值仅为1.82%,胰岛素舌下给药 分别加入渗透促进剂Brij35,chitosan或egglecithin后队分别 增加至13.78%,9.83%和8.71%.见表1. 表1渗透促进剂对胰岛素(10u?l(gI1)舌下吸收药理相对生 物利用度的影响.n=5,贾?s Tab1Relativepharmacologicalbioavailabilityofinsulin(10U? kg)aftersublingualadministrationwithdifferentpenetrationen— hancersinnormalrats.n=5.?s 注:AAC:血糖时间对照图曲线上面积;PA:药理相对生物利用度;INS:胰岛 素;)P<O.05,)P<O.叭,与10u?kg一的胰岛素溶液相比;n=5 Note:AAC:AreaabovethecIn?ve;PA:l~m-macologicalbioavailability;IN S:insulin;)P <0.05.2)P<O. 01vs10u?kg 2.2拉曼光谱测定 拉曼光谱中C—C伸缩振动及C—H伸缩振动的信号可 国药学杂志2O04年4月第39卷第4 用来反映膜脂的流动性j.因此,为了研究舌下黏膜脂质动信息时.我们选择靠近2850cm和2920cm附近的对称 结构的变化,重点观察和计算了c—c骨架伸缩振动(1000,和反称c—H伸缩振动峰的波数变化作为参数.舌下黏膜经 1300cm)和c—H骨架伸缩振动(2700,3100cm)的拉5%cD处理后,光谱参数发生红移;经5%chitosan,5%polox. 曼谱线的变化.舌下黏膜经 5%poloxamer,5%Srij35,5%eggalTler,5%Tween80,10%egglecithin和5%Brij35处理后,光谱参 lecithin,5%chitosan,5%Tween80,5%pcD和5%oleicacid处理数都产生显着的蓝移现象,这表明它们均可降低脂质分子侧 后,I,I一比值增大,反映出脂质分子纵向排列的有序性向链问有序性,增加膜脂的流动性.见表2. 降低,膜质的流动性增加.在研究分子链问侧向构象运拉曼光谱中的酰胺T带(1650cm)和酰胺?带(1274 表2应用拉曼光谱研究渗透促进剂对大鼠口腔细胞膜脂流动性的影响 Tab2EffectsofvariousabsorptionenhanceIsonthefluidityofthesublingual mucousmembraneofratsinvestigatedbyRamanspectroscopy 注:1che/lt=~:gauchei~?ans谱线的强度比.位移?H)/一一:脂质亚甲基对称振动峰相对于空白的位移差c位移.H)/an一:脂质亚甲基不对称振动峰相 对于空白的位移差.位移(c=0)/一一:酰胺I带(1650cm一)相对于空白的位移差位移(cN)/一一:酰胺?带(1274cm一)相对于空白的位移差 Note:1/1tmns:intemitymti.(Iv/1);位移(H)/【邛一:shifiofthec—Hswnmetric;位移(. H)/【邛:shifiofthec—Hasyrtrnetric;位移?:0)/一:sh.fthe amideIband(1650cm.);位移?N),一一:shiftoftheamide?band(1274em一) cm)多用来评价蛋白变性的状况.从表2可看到,舌下黏 膜经5%poloxamer,5%chitosan,5%Brij35和5%oleicacid处 理过后酰胺I带和酰胺?带均发生了蓝移,表明膜蛋白可能 发生肽链断裂,或交联时空间结构发生了改变. 2.3圆二色谱测定 蛋白质分子的二级结构(secondarystructure)是指多肽链 骨架的 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 排列,而不涉及侧链的类型和构象,即蛋白主链 原子在局部地区所能采取的规则构象.a一螺旋(a-Helix)是蛋 白质中含量最多,也是最稳定的二级结构单元,是稳定蛋白 质立体结构的主要支柱.片层(~pleatedsheet)在蛋白质中 含量仅次于a一螺旋,从能量上8结构不如螺旋稳定.Turn 转角(reverseturn)是蛋白质分子中不同的周期性二级结构, 如a一螺旋和片层通常有一些转弯180~后连接起来的结构, 是一种主要的非周期性的二级结构单元.无规卷曲(random coil)是蛋白质结构表达中不可缺少的内容,但并没有象二级 结构那样具有易于表征的规律.由测定结果可见,舌下黏膜 经不同渗透促进剂处理后其膜蛋白质分子的二级构象都发 生了改变. 经B35,TweenS0和oleicacid处理后膜蛋白构象中a螺 旋的比例下降,而经chitosan,poloxamer和13-CD处理后膜蛋白 构象中a螺旋的比例上升;[3-CD处理后膜蛋白构象中的无规 卷曲比例增加,经B35,Tween80,oleicacid,chitosan和polox. alTler处理后的构象中无规卷曲比例都减少;经Tween80,oleic acid和chitosan处理后的口片层结构的比例增加;经Brij35和 oleicacid处理后的膜蛋白构象中Turn转角构象比例增加;经 egglecithin处理后膜蛋白的各种构象都转变为了8片层结 构,这可能是由于egglecithin分子渗入膜质中,引起膜质和膜 2004年4月第39卷第4 蛋白结构的重组.结果表明,不同的渗透促进剂可不同程度 地改变膜蛋白的构象,增加膜蛋白质分子的运动.见表3. 表3应用圆二色谱研究渗透促进剂对口腔细胞膜蛋白二级 结构的影响 Tab3Effectsofvariousabsorptionenhancersonthesecondary structureofmembraneproteininvestigatedbycirc~ardichroism 注:a一螺旋:a一螺旋构象;片层:片层构象;Tum转角:Tum转角构象;无规卷 曲:无规卷曲构象 Note:a一螺旋:Helixconformation;B-片层:Betaconformation;Tum转角:TumCollfor— nmfion;无规卷曲:Randomconformation 2.4荧光偏振 由测定结果可知,5%chitosan,5%poloxamer,5%Srij35, 5%egglecithin,5%oleicacid和5%13-CD均可使荧光偏振值 极显着地减小(P<0.01),平均微黏度值也极显着地减小 (P<0.01).这个结果表明除TweenS0外,其它渗透促进剂 均能显着地破坏膜脂分子排列的有序性,降低了黏膜的平均 微黏度,有利于药物的透过吸收.见表4. 3讨论 通过使用拉曼光谱,圆二色谱和荧光偏振法3种实验技 术,考察了渗透促进剂处理前后对膜脂有序性和膜蛋白构象 的影响,见表5.所选渗透促进剂由上至下对模型药物胰岛 ChinPharmJ,2004.Vo1.39No.4.281. 表4应用荧光偏振研究渗透促进素lJ对口睦细孢瑾:毫砷性的 影响 Tab4EffectsofVaI3OUSatx~orptionenhanceronthefluidit)?ofrat sublingualmembraneinvestigatedb. yfluore~encepolarization 淬:与对照组比,P<001 Nt)te:1)P<001vs)nhf 素舌下的吸收促进作用依次降低.对膜脂和膜蛋白的结构影 响也逐渐减弱.可见渗透促进剂对细胞膜整体流动性的改变 与体内药物吸收促进作用之间有一定的相关忡一般认为 一 些渗透促进剂提高蛋白多肽类药物黏膜吸收的机制之… 可能为通过增加膜的流动性”.. 表5渗透促进剂对口腔膜脂有序性和膜蛋白构象的影响 Tab5Effectsofpenetrationpromotersonthefluidityofsu1)lingual membranelipidandtheconformationofmembraneproteininrats 注:+:阳性;一:阴性 Note:+:positiveeffect:一:negativeeffect Brii35,chitosan,poloxamer和oleicacid不仅能够增加膜脂 的流动性并且能够改变膜蛋白的构象,其中Brij35和chito~ 在体内实验中也能够显着增加胰岛素经舌下的吸收.Brii35 这类合成醚类表面活性剂能够改变细胞膜的磷脂排列,增 加膜的流动性,从而使药物易于通透;chito~n是一种生物黏 附物质,近来发现其同时也具有一定的吸收促进作用,可 以增加极性小分子及呔类和蛋白质药物的透黏膜吸收. Takeuchi等将胰岛素脂质体表面包裹上壳聚糖后,正常大 鼠口服降血糖出现明显下降,与其具有一定的生物黏附特性 有关,它能与上皮细胞的黏蛋白润湿,延长药物在给药部位 的吸收时间,达到促进吸收的效果;oleicacid是一种不饱和 脂肪酸类透皮促进剂,它主要是分散与脂质中形成许多易于 渗透的流动性通道或渗透性的脂质界面,但在本实验中的 促渗效果不明显,可能与oleicacid的亲水性不够,不能与胰 岛素很好的混溶所致;从表5结果可见,poloxamer对于膜脂 流动性和膜蛋白构象有比较显着的降低,能增加黏膜的流动 性.但在体内实验中poloxamer作为吸收促进剂对增加胰岛 素舌下给药的降血糖作用较小,可能在皮肤温度下poloxamer 固体析出,形成物理屏障,影响药物的透过” egglecithin是一种甘油磷酸胆碱脂化合物.磷脂本身为 ? 282?ChinJ.2004ril.tb/.39”Vo.4 细胞膜的组成部分之一一.与细胞表面有较强的亲和性.可促 使药物与细胞结合而表促进吸收在经过egglee?ithin处 理的膜蛋h的二级构象中.处理后的构象中a螺旋和无规卷 曲全部转化为片层结构.这可能与卵磷脂与膜相目:作用后 介入膜脂千?膜赁f1中『日J.使膜结构重组昕致Twn80为非 离子表面活性剂.表面活忡剂可提取皮肤表面与角质层细胞 的类脂.降低离子的扩散阻力;表面活性剂进入角质层细胞. 细胞内的蛋白相q作用.引起结构的紊乱.促进药物的通 过牛物膜的渗透近来发现CD能增加黏膜的通透性,促 进鼻黏膜对胰岛素的吸收.我们选用5%的肛cD给药.未 『见显菩的吸收促进作用 渗透促进剂在体外对膜脂结构和膜蛋白构象的影响各 不相同.就考察渗透促进刹对胰岛素的舌下吸收促进作用而 言.舌下黏膜的膜流动性整体的改变与其在体内对胰岛素吸 收的促进作用之问有较好的相关性渗透性促进剂促进药 物是目前研究最多和最常用的促进药物吸收的方法.改变膜 的流动性是渗透促进剂促进蛋白多肽药物黏膜吸收的机制 之.更为深入地了解渗透促进剂的作用机制.尚有待进一 步的研究一 参考文献 11,HIPeptida._~activitiesinabsorptivemucosae1.I.Biorhem Tran,1989.17:937. 12HarrisD.RobinsonJR.Drugdeliveryviathemucousmembranesof theoralcaxdtslJ..,Pharm.1992.81(1):1. 3jRathl~neMJ.PonehelG.GhazalilA.OralmucosalD不蟛delive0 M.NewYork:MarcelDekkerINC.1996:242. ,4jAtmgstBJ.Nanc)J.Comparisonofnasa1.rectal,bucca1.sublingual andintramuscularInsulinefficacyandtheeffectsofabilesaltabsorp? tionpromoter[J:JPharmacolExpTher,1987.244(1):23. 5;Qiu,_H,.1ohn~H.ReilandTL,et.Sublingualabsorptionofle. upmlide:comp,~nbetweenhumanandanimalm(wlelslJ., Pharm.1999.179:27. 6KinnamonSC.CumingsTA.RoperSD.Membranepropertiesofiso. 1atedmudpuppyt&~tecellsJ.JC,enphy~io1.1988.91(3):351. 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