[doc] 人牙龈成纤维细胞与牙周膜细胞的生物活性

[doc] 人牙龈成纤维细胞与牙周膜细胞的生物活性 人牙龈成纤维细胞与牙周膜细胞的生物活 性 第7卷第1期 2009年03月 生物信息学 ChinaJournalofBioinformatics V01.7No.1 March,2009 人牙龈成纤维细胞与牙周膜细胞的生物活性 程远,曾照芳,朱俊 (1.重庆医科大学生物医学工程系,重庆400016;2.西南交通大学土木工程学院,成都610031) 摘要:采用组织块法分离培养牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞,测定二者的增殖特性和ALP活性,利用免疫组化和FCM 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 比 较I,III型胶原,BMP的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达情况,以观察对比两种细胞的生物学特性的异同.找出牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞在胶原基质 合成方面存在差异,发现I,III型胶原可作为鉴别两种细胞的标志物,ALP与BMP可作为鉴别两种细胞的标志,牙周膜细胞比 牙龈成纤维细胞具有较强的成骨能力.从而为今后改良两种细胞成为牙周组织工程的种子细胞奠定基础. 关键词:牙龈成纤维细胞;牙周膜细胞;增殖;BMP;ALP 中图分类号:R782.13文献标识码:A文章编号:1672—5565(2009)一 O1—32—05 Biologicalactivityofgingivalfibroblastsandperiodontalligamentcells CHENGYuan,ZENGZhao—fang,ZHUJun2 (1.DepartmentofBiomedicalEngineering,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.SchoolofCivilEng.,SouthwestJiaotongUniversity,Chengdu610031,China) Abstract:SeparationofusingtissuecultureceHsandperiodontalligamentgingivalfibroblasts.theproliferationofthetwopropertiesandALP aefivi~,theuseofimmunohistochemistryandFCMMethodsI,IIIcollagen,BMPexpression,toobselNethesimilaritiesanddifferencesofthe twocomparisonThebiologicalcharacteristicsofceHs.IdentifygingivalfibroblastsandperiodontalligamentcellsinthecoHagenmatrixofexist— ingdifferencesandfindthatI.IIIcoHagencanbeusedasidentificationofthetwomarkel’s.A【JPandBMPcanbeusedasidentificationofthe twosigns,teethZhouceHshasOsteogenicstrongcapacitythangingivalfibroblasts.SoastothefutureimprovementofthetwoceBsbecomepe— fiodontaltissueengineeringlaythefoundationfortheseedcells. KeyWords:gingivalfibroblast;periodontalligamentcells;proliferation;bonemorphogeneticproteins(BMP);alkalinephosphatase(ALP) 成纤维细胞是人牙龈结缔组织和牙周膜中的主 要细胞类型,在牙齿的发育,牙周组织生理,病理改 变及牙周组织再生等方面具有重要作用.目前研究 认为牙龈成纤维细胞(gingivalfibmblasts,GFs)和牙 周膜细胞(periodontalligamentcells,PDLCs)虽在光镜 下与扫描电镜下观察形态上没有区别,但在功能上 具有明显的差异,牙龈成纤维细胞主要与牙龈组织 的自身稳定有关,而牙周膜细胞除维持自身的稳定 外,还可分化成成骨细胞和成牙骨质细胞参与邻近 牙槽骨和牙骨质的重建及修复再生…. 牙周膜细胞是具有一定程度成骨特征的成纤维 细胞,该细胞在诱导培养条件下具有矿化能力,可形 成矿化的细胞外基质,然而它来源有限;牙龈成纤维 细胞来源丰富,具有很强的生长和自我繁殖能力,但 目前的多数研究认为它不能形成牙周组织再生所需 的各种硬组织. 1材料与方法 1.1原代培养及传代 1.1.1体外人牙周膜细胞原代培养:取临床上12 岁左右因正畸需要拔除的健康前磨牙,刮取牙根中 1/3的牙周膜组织,利用组织块法培养牙周膜细胞, 当细胞生长至铺满瓶底80%时进行传代.取第2 代细胞爬片,鉴定细胞来源. 1.1.2体外人牙龈成纤维细胞原代培养:取同一个 体同一部位的龈乳头组织,按上述相同方法进行牙 龈成纤维细胞培养. 1.2增殖活性的比较 取第4代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞,以2 ×l04个/ml的细胞浓度接种于3个96孔培养板, 10%DMEM(dulbecc0’smodifiedeaglemedium)培养基 共培养7d,分别于第3,5,7d,各取出一个96孔板, 收稿日期:2008—04—28;修回日期:2008—07一O8. 作者简介:程远:女(1981一),硕士研究生,研究方向:生物医学信息学. *通讯作者:曾照芳,教授,重庆医科大学97#信箱,电话:023—68485009,E—mail:zengO00@126.COrn 第1期程远,等:人牙龈成纤维细胞与牙周膜细胞的生物活性33 MTI’法于酶标仪上492nm波长读取A值. 1.3ALP活性比较 取第5代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞,以1 ×105个/ml的细胞浓度接种于24孔培养板,10% DMEM培养基共培养7d,弃孔内液体,加入Tritonx 一 100,4~C过夜,进行如下实验:取上述各孔液体及 空白对照的蒸馏水一并转入另一96孔板.按ALP 试剂盒说明依次按比例加入缓冲液,基质液,水浴, 加入显色剂后在酶标仪上于410nnl波长下测得OD 值,间接反映细胞ALP活性. 1.4免疫组化染色 取第5,6代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞,以 2×105个/ml的细胞浓度接种于放有1X1crn2大小 盖玻片的12孔培养板中,加入10%DMEM培养基 培养1周,95%乙醇固定后进行免疫组化染色,光学 显微镜下观察. 结果判定:细胞胞浆中有棕色颗粒为阳性.以 染色强度为判定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,分为4级::无棕色颗粒记为 (一);仅有少量,细小,散在的棕色颗粒,着色较浅, 记为(+);棕色颗粒聚集成大颗粒记为(++);颗粒 密集成团片状,着色深棕,记为(+++). 1.5流式细胞学检测 取第6代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞,经胰 蛋白酶消化吹散,计数细胞量达IXla6个以上,离 心收集细胞,D—Hank’s液洗2次,70%乙醇固定同 时吹散成单细胞悬液,上机进行FCM检测. 1.6统计学分析 采用SPSS13.0统计软件.检测结果以均数? 标准差(?S)表示,应用两样本t检验分析方法对 MTF,ALP及BMP检测结果进行统计学分析.以P <0.05为差异有统计学意义. 2结果与分析 2.1原代培养 人牙周膜细胞原代培养成功率为10%,牙龈成 纤维细胞的原代培养成功率为100%.原代及传代 培养的牙龈与牙周膜细胞在光镜下形态及排列无明 显差别,但原代培养的细胞中,牙龈成纤维细胞稍早 于牙周膜细胞移出组织块.经免疫组化鉴定波形蛋 白阳性,细胞角蛋白阴性,符合成纤维样细胞的特 征,为中胚层来源. 2.2牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞增殖活性的比较 加入MTF4h后,各孔内均有紫黑色结晶形成,经 酶标仪于492nil1处读数,牙周膜细胞组的A值为0.301 ?0.032,牙龈成纤维细胞组的A值为0.495?0.051,经 比较,二者差异有统计学意义(P=0.035).倒置显微镜 下可见,随着时间的推移,每次取出的培养板中各孔细 胞的数量总体均比前一次取出的培养板中各孔的细胞 数有所增加.这与Ogata等乜J研究结果一致.产生这 种差异的可能性原因有:?这两种细胞可能本身各自 具有独特的细胞亚群,很可能体外培养的这两种细胞 是一种异质性的细胞,因此它们具有不同的生物学行 为,提示各自具有不同的功能.?牙龈成纤维细胞和 牙周膜细胞可能各自处于不同的分化阶段.?这两种 细胞体外培养时可能从每种细胞类型中选择了独特的 完全不同的细胞群,在体外传代培养过程中强化了这 种差异的选择.?可能与细胞分化的年龄有关,如这 两种体外培养时细胞生长及倍增时间不同l3].牙龈成 纤维细胞的增殖活性较牙周膜细胞强,因而在牙周愈 合时,牙龈成纤维细胞引起的愈合方式占主导地位. 2.3牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞的ALP活性对比 加入显色剂后各孔内液体呈现深浅不一的红 色,经酶标仪410Bin处读数,牙周膜细胞组的OD值 为0.789?0.058,牙龈成纤维细胞组的OD值为 0.320?0.036,二者比较差异有统计学意义(P< 0.001),后者的ALP活性显着高于前者.本研究中 比较体外培养的人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞 AIJP水平的表达,发现牙周膜细胞的ALP水平明显 高于牙龈成纤维细胞,表明牙周膜细胞向成骨方向 转化的能力高于牙龈成纤维细胞.ALP可作为区别 这两种细胞的方法之一. 2.4免疫组化染色 以阴性对照为参照,免疫组化显示:GFs和 PDLCs阴性对照染色均为蓝色(图1,2),牙龈成纤 维细胞中工型胶原染色为弱阳性(图3),牙周膜细 胞为中到强阳性(图4).?型胶原的染色结果与I 型胶原相似.BMP在牙龈成纤维细胞中染色为弱 图1GFs免疫组化 Fig.1ImmunohistochemistryofGFs 34生物信息学第7卷 阳性(图5),牙周膜细胞为强阳性(图6). 图2PDLCs免疫组化 Fig.2ImmunohistochemistryofPDLCs 图3GFsI型胶原免疫组化 Fig.3ImmunohistochemistryofGFsI 图4PDLCsI型胶原免疫组化 ng.4In~’nunohistochemistryofPDLCsI 图5GFsBMP免疫组化 Fig.5ImmunohistochemistryofGFsBMP 图6PDLCsBMP免疫组化 Fig.6ImmunohistochemistryofPDLCsBMP 胶原是牙周结缔组织中的主要基质成分,胶原成分 的正常组成和结构完整是牙周组织健康的重要保 障.牙周膜中含有大量的I,?型胶原.在牙龈结 缔组织中亦含有大量的工型胶原,分布于整个固有 层,纤维粗大成束;而?型胶原含量较少,且在固有 层中弥散分布. 研究结果显示,在牙周膜细胞中,两种胶原免疫 组化染色均为阳性.在牙龈成纤维细胞中工,?型 胶原为弱阳性.I型胶原为牙龈结缔组织的主要基 质成分,但本实验发现,I型胶原在牙龈成纤维细胞 中染色较弱,与其在牙龈结缔组织中的分布不一致. 2.5流式细胞学检测 牙周膜细胞的BMP荧光强度值为4.910-4- 0.128,高于牙龈成纤维细胞4.001?0.089,二者相 比差异具有统计学意义(P=0.041),提示牙周膜细 胞表达较高的BMP水平,具有较强的成骨潜力.本 研究结果显示牙周膜细胞BMP为强阳性,而牙龈成 纤维细胞表达弱阳性.尽管牙龈来源的细胞主要表 现为成纤维细胞特性,但牙龈来源的细胞也可有成 骨细胞特点,可能是牙龈中存在有未分化的间充质 细胞,在一定条件下可以向成骨细胞的方向分化j. 3结论与讨论 3.1生物学特性的比较 3.1.1增殖活性比较研究 牙龈成纤维细胞的增殖活性较牙周膜细胞强, 即在相同生长环境下,牙龈成纤维细胞较牙周膜细 胞有更强的竞争力,因而,在牙周愈合时,牙龈成纤 维细胞引起的愈合方式占主导地位.这与体内实验 所得结果一致,也是组织引导再生术的重要理论基 础:用屏障膜阻挡不利于牙周再生的牙龈成纤维细 胞长入,而使具有多向分化能力的牙周膜细胞优先 第1期程远,等:人牙龈成纤维细胞与牙周膜细胞的生物活性35 占据根面,增殖分化为成骨细胞,成牙骨质细胞及成 纤维细胞,以建立新附着,促进牙周再生. 3.1.2工,?型胶原表达 Kuru等也得到类似研究结果,但用莫能菌素 处理细胞后,细胞内工型胶原水平明显增加.莫能 菌素有抑制细胞分泌的作用,表明牙龈成纤维细胞 在正常情况下合成并分泌大量工型胶原,由于将大 量胶原释放到细胞外作为基质成分,因此细胞内的 胶原水平显着下降. 关于胶原的作用,多数学者认为软组织中主要 为工,?型胶原.牙周膜的一个重要特点是在整个 生命过程中维持正常的宽度_6J,尽管众多研究表明, 牙周膜细胞有形成矿化组织的能力,但体内的牙周 间隙并未因此被矿化,牙周膜细胞表达某些调节因 子,抑制骨及牙骨质的形成,而维持牙周膜的正常宽 度,并与其周围的矿化组织保持动态平衡.结合本 研究结果认为,?型胶原在维持正常牙周间隙而不 被矿化中可能起重要作用.本研究结果显示:两种 胶原在牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞中免疫细胞化 学染色的不同,可作为鉴别两种细胞的标志物. 3.1.3两种细胞成骨特性的研究 牙周膜细胞是位处于牙槽骨和牙骨质两种骨化 组织之间的结缔组织细胞,是牙周组织内的主要细 胞既有成纤维细胞的特性又有成骨细胞的特性.牙 龈成纤维细胞作为牙周组织的组成成分,在许多生 理和病理过程中起着重要作用.最近的文献报道, 牙龈成纤维细胞有与牙周膜细胞相似的特点,已从 中分离出成骨细胞表型.通过对ALP和BMP的检 测,我们对比了牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞的成 骨特性. 碱性磷酸酶(ALP)是一种较为肯定的参与促进 钙化活动的酶类,它在细胞中表达的多少,已作为反 映细胞分化程度及功能状态的指标.许多研究表明 牙周膜细胞具有一定程度的成骨细胞样特征,体外 培养的该细胞具有矿化能力,表达高水平的ALP活 性.JinGao等发现ALPmRNA在牙周膜细胞和成 骨细胞中有表达,而牙龈成纤维细胞的ALP的表达 较低,成牙骨质细胞中则不表达. BMP是一种具有高度骨诱导活性的低分子多 肽,属于TGF2[3超家族,在骨形成和发育过程中, BMP对于细胞趋化,有丝分裂及分化起至关重要的 作用.成纤维细胞的胞膜上具有BMP的受体,内源 性BMP可能通过细胞膜上的受体促进成纤维细胞 成骨细胞表型的表达.本研究结合免疫组化和流式 细胞学方法的优点,检测,分析了牙周膜细胞和牙龈 成纤维细胞对于BMP的表达情况,结果显示,牙周 膜细胞和牙龈成纤维细胞的胞浆均呈现棕黄色阳性 颗粒,根据染色强度判定,牙周膜细胞为强阳性,而 牙龈成纤维细胞表达弱阳性.尽管牙龈来源的细胞 主要表现为成纤维细胞特性,但本研究结果表明培 养牙龈来源的细胞也可有成骨细胞特点,这可能是 因为,牙龈中存在有未分化的间充质细胞,在一定的 体外培养条件下可以向成骨细胞的方向分化. 3.2两种细胞作为牙周组织工程的种子细胞 近年来,组织工程学的迅速发展为牙周组织再 生提供了新思路,其基本原理是将体外培养的大量 扩增的高浓度功能相关的活细胞,种植于天然的或 合成的细胞外基质上,经过三维立体培养后进行体 内移植,以达到构建新的有功能组织的目的.种子 细胞,载体及细胞/载体复合体的构建是组织工程技 术的三大要素_8],种子细胞的来源是其首要研究重 点之一. 3.2.1牙周膜细胞应用于牙周组织工程的前景 在牙周组织再生过程中,起主要作用的细胞是 牙周膜细胞.牙周膜细胞是一组具有多向分化潜能 的异质性多能干细胞.由于牙周膜细胞直接来源于 牙周组织,有很强的分化能力,而自体牙周膜细胞植 入可避免免疫排斥反应,目前被视为牙周组织工程 的首选种子细胞,但因其来源有限.有学者已通 过用含SV40大T基因的重组逆转录病毒质粒转染 人牙周膜细胞使之永生化,建立了稳定的人牙周膜 细胞系,从而促进了牙周组织工程种子细胞的进一 步研究.我们研究发现牙周膜细胞的体外培养成功 率仅为10%.目前已有大量研究证实,多种生长因 子能调节牙周膜细胞的生物学活性,刺激牙周膜细 胞的增殖,促进牙周组织再生u. 3.2.2牙龈成纤维细胞应用于牙周组织工程的前景 牙龈成纤维细胞比牙周膜细胞增殖活性明显增 高,表达较低水平的ALP活性,文献曾报道其对影 响骨代谢因子的反应性差,成骨细胞表型的表达很 低,不参与牙周膜,牙槽骨和牙骨质的再生[1.牙 龈成纤维细胞作为牙周组织的组成成分,具有与牙 周膜细胞相似特点,己从中分离出成骨细胞表 型u.研究还表明,牙龈成纤维细胞在适当的刺激 下,可表达较高ALP活性,合成骨钙素并形成体外 矿化结节,还能表达骨相关大分子物质以及与BMP 信号相关的基因产物_1.因此可以认为,牙龈成纤 维细胞具有一定的潜在成骨能力. 36生物信息学第7卷 本研究采用人牙龈成纤维细胞,取材部位较表 浅,创伤较小,易为患者所接受,方便医生操作.国 外研究显示BMP诱导,或者BMP基因转染的人牙 龈成纤维细胞能够向成骨细胞方向转化.由于 牙龈成纤维细胞具备被诱导成骨的能力,可以设想 通过基因转染,将目的基因导人相对于牙周膜细胞 更容易获得的牙龈成纤维细胞后,一方面细胞可以 通过自分泌生长因子,促进细胞自身生物学特性的 改变;另一方面在体内就可以通过旁分泌途径分泌 生长因子至细胞外周组织,诱导牙周膜细胞分化,促 进牙周组织再生.从一定意义上讲,牙龈成纤维细 胞有成为牙周组织工程种子细胞的潜力很大. 参考文献(References): [1]itaT,1wataT,ShibaH,etat,Identificationofmarkergenesdis— tinguishinghumanperiodontalligamentcellsfromhumanmesenehymal stemcellsandhumangingivalfibroblasts[J].JPeriodontalRes., 2007,42(3):283—286. 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