实验性马尾综合征大鼠脊髓前角运动神经元存活情况及一氧化氮合酶的表达

实验性马尾综合征大鼠脊髓前角运动神经元存活情况及一氧化氮合酶的表达 实验性马尾综合征大鼠脊髓前角运动神经 元存活情况及一氧化氮合酶的表达 中国临床康复第9卷第?期2005-09-07出版 ChineseJo”ofClinicalRehabilitation.September72005Vo1.9No.33 实验性马尾综合征大鼠脊髓前角运动神经元存活情况及 一 氧化氮合酶的表达 韦培溥,吴建中,涂良携,李维坚 ? 基础研究? 汕头大学医学院人体解剖学教研室,广东省汕头市515041 韦培演,男,1963年生,广东省汕头市人,汉族,1988年汕头大学毕业, 学士,讲师,主要从事人体解剖学教学及神经修复研究. wpy@stu.edu.ca 通讯作者:吴建中,博士,教授,汕头大学医学院人体解剖学教研室,广东 省汕头市515041wjz—st@sohu.eom 中圈分类号:R744文献标识码:A文章编号1671—5962-(2005)33--0048-03 收稿日期:2005-05-11修回日期:2005-08—12(15/SM/YH) Survivalofspinalanteriorhornmotoneuronsandexpression ofnitricoxidesynthaseinratswithcaudaequinasyndrome WeiPei—yong,WuJian—zhong,TuLiang—xie,LiWei—jian,Department ofHumanAnatomy.MedicalCollegeofShantouUniversity.Shantou 515041.GuangdongProvince.China We;Pei—yong,Lecturer,DepartmentofHumanAnatomy,MedicalCollege ofShantouUniversity,Shantou515041,GuangdongProvince,China wpy@stu.edu.ca Correspondenceto:WuJian—zhong,Doctor,Pmfessor,Departmentof HumanAnatomy,MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou 515041,Guan列ongProvince,Chinawjz—st@sohu.eom Reeeived:2005_()5—11Accepted:2005—08—12 Abstract A?:Toinvestigatethesurvivalofpelvicmotoneuronsandtheexpression ofnitricoxidesynthase(NOS)andN—methyl—D—aspartate(NMDA)inrats followinglumbosacralventralrootavulsion. M暇TH0DS:TheexperimentwasconductedintheDepartmentofHuman Anatomy.MedicalCollegeofShantouUniversityfromJune2OO4to January2005.Twenty—fiveadultmaleSDratswereperformedwithlumber laminectomyontheirbacktoexposethespinalcord.andL6toS2ventral rootsofonesidewaspulledout.Theseratsdividedinto5groups.5ratsin eachgroup:3-day,7-day,14一day.21-day,and28一daypostoperativegroups. Mteroperation,underroutineanesthesia,theduramaterwasopenedand k—S2ventralrootsontherightsidewereavulsedindividuallytomake frozenslices.Thereducedforillofnicotinamide—adeninedinucleotide phosphate(NADPH)一diaphoasehistochemistry,neutralredcounterstaining andNMDAreceptorimmunohistochemistrywereadoptedtomeasurethe survivalrateofspinalanteriorhornmotoneurons,thenumberofpositive neuronsandtheexpressiondensityofNMDAreceptorsubunit. RESULTS:AUthe25ratswereanalyzedintheresult.(1)At3,7,14,21 and28postoperativedays,thesurvivalratesofmotoneuronswere96%. 85%,5O%,35%and20%respectively.(Thelabelingratesofpositive N0Smotoneuronswere6%,40%,62%and41%at7.14.21and28 postoperativedays.(TheexpressiondensityofNMDAreceptorsubunit wasalteredinheanteriorhornmotoneurongsoftheoperatedsides.At7. 14.21and28postoperativedays,theexpressionofNMDAreceptor1was significantlylowerintheoperatedsidesthaninthecontrolsides (0.044~0.004,0.O21?O.oo3,0.036~0.004I)50.063~0.oo9,P<0.O5toO.O1), andtheexpressionofNMDAreceptor2Bintheoperatedsideswas significantlyhigherthanthatinthecontrolsides(0.1l0?O.01O. O.133?O.0O6.0.085~0.009s0.079~0.oo8.P<0.O5toO.O11.butthe expressionofNMDAreceptor2Awasinsignificantlydifferentbetweenthe twosides.’ CONCLUSION:Lumbosacralventralrootavulsionprogressivelydepletes pelvicmotoneurons.ThedifferentexpressionsofNOSandNMDAreceptor subunitsmaybeanimportantreasonsforthedeathoftheinjured motoneurons. WeiPY.WuJZ.TuLX.LiWJSurvivalofspinalanteriorhornmotoneurons andexpressionofnitricoxidesynthaseinratswithcaudaequinasyndrome Zhongg~LinchuangI20059(33):48—50(China) 韦培滢,吴建中,涂良携,李维坚实验性马尾综合征大鼠脊髓前角运动神经元存 活情况及一氧化氮合酶的表达【J】中国临床康复.2005.9(33):48—50 【wwvv.zglckfcomj 摘要 目的:观察大鼠脊神经前根撕脱伤对盆底肌运动神经元的存活,一氧化 氮合酶和N一甲基一D一天冬氨酸型受体表达的影响. 方法:实验于2004-06/2005一O1在汕头大学医学院人体解剖学教研室 神经Naiff室完成.取雄性sD大鼠25只,背部切口显露脊髓,拔除一 侧L,-S脊神经前根.术后动物分为5组,分别为术后3,7,14,21,28d 组,每组5只.术后在规定时间大鼠常规麻醉下取k,S2节段,制备冰冻 切片,进行还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸组织化学染色,中性红复染和 N一甲基-D-天冬氨酸受体免疫组织化学染色观察各组大鼠前角运动神 经元存活率,还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸阳性神经元数目,前角运动神 经元N一甲基一D一天冬氨酸受体亚单位表达密度. 结果:25只大鼠均进入结果分析.?术后3,7,14,21,28d时间点,术侧 前角运动神经元存活率分别为96%,85%,50%,35%和2O%.?术后7, 14,21,28d,一氧化氮合酶阳性神经元标记率为6%,4O%,62%和 41%.?术侧前角运动神经元N一甲基一D一天冬氨酸受体亚单位表达改 变,其中术后7,14,21d组1型受体亚单位表达明显少于对照侧 (O.044~0.004,0.021~0.003,0.036~0.004,0063~0.009,P<0.05~0.01),2型B 受体亚单位表达显着高于对照侧(0.110?O.010,0.133?O.006, 0.085~0.009,0.079~0.008,P<0.05-0.01),2型A受体亚单位表达无明 显变化. 结论:前根撕脱伤导致盆底肌运动神经元在较短的时间内发生死亡,一 氧化氮合酶持续表达和N一甲基一D一天冬氨酸受体亚单位的表达变化, 可能是导致运动神经元死亡的重要原因. 主题词:前根撕脱;运动神经元;N一甲基-D-天冬氨酸受体;大鼠 0引言 马尾神经综合征患者l临床主要表现为鞍区感觉和 排尿,排便功能障碍,腰骶神经根牵拉,压迫,脊髓圆锥 的挫伤等为导致该综合征的常见原因,有相当一部分 患者同时伴有中枢和周围神经的损伤.近年来,随着交 通事故的频发,由高速冲击所造成的腰骶神经根撕脱 伤增多,但有关根性撕脱后腰骶部前角运动神经元 病理变化的报道尚缺乏.本文建立大鼠k,S:前根撕 脱伤动物模型,观察了脊髓前角运动神经元的存活,一 氧化氮合酶表达及N一甲基一D一天冬氨酸型受体亚型 的变化. 1材料和方法 设计:完全随机设计. 单位:汕头大学医学院人体解剖学教研室. 材料:实验于201M-06/2005-01在汕头大学医学院 人体解剖学教研室神经科研室进行.取健康成年雄性 SD大鼠25只,清洁级,13周龄,体质量(250+30)g,由 中山大学实验动物中心【许可证号:SCXK(粤)2003--0001] 提供.饲养环境:动物室温度控制在(21+2)?,湿度控 制在50%-75%,空气流动速度为13cm/s,换气次数48 次/d;光照为自然光昼夜交替;饲料为广东省实验动物 中心生产的鼠类专用合成块料,饮水为冷开水.随机分 5个实验组,分别为术后3,7,l4,21和28d组,每组5 只.行单侧S2脊神经前根撕脱术,对侧作为对照. 实验试剂:还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸磷酸 (Sigma);N一甲基一D一天冬氨酸受体1型和2型亚单位 A,B抗体(Boster);其他常用试剂为国产分析纯. … 韦嬲等量誓笼曼晶鼠脊髓前角运动神经元存活情况及 设计,实施,评估者:实验设计,实施干预均为作 者,经过训练.评估者请本院病理解剖教研室老师协 助,为盲法评估. 方法:动物用质量浓度10g/L戊巴比妥钠30mg/kg 腹腔注射麻醉,背部切口暴露L-,右侧椎板,将椎 板切除显露硬脊膜,在解剖显微镜下切开硬脊膜. 以的粗大背根作为标志,确定腹侧的,s-和sz前 根.用眼科镊沿前根走行方向将其拔除并切去1cm以 防止纤维再生,用0—10线缝合硬脊膜后,逐层缝合切 口,注射长效青霉素300万单位. 评估 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 :术后在规定时间3,7,14,21和28d, 大鼠常规麻醉下经左心室一升主动脉穿心灌注固定, 取,s脊髓节段.人质量浓度100-300g/L的梯度蔗 糖后固定过夜(4.C).连续冰冻切片,片厚40m. 取相邻切片分为4组分别进行:?还原型烟酰腺嘌 呤二核苷酸组织化学染色与中性红复染:切片经 0.1mo|/L磷酸缓冲液漂洗,入37.c孵育液(1g/L 还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸磷酸+0.25g/L四唑氮 蓝),孵育1h.贴片干燥后,用10g/L中性红复染,封 固.?N一甲基一D一天冬氨酸受体免疫组织化学染色:切 片行N一甲基-D-天冬氨酸受体1型和2型亚单位A, B免疫组织化学反应.一抗稀释度均为1:100,4.C孵 育过夜后,依次进入生物素化羊抗小鼠IgG和SABC 程序,室温下分别孵育20min,以上各步骤间均以磷 酸缓冲液冲洗3次,二氨基联苯胺显色.阴性对照用 磷酸缓冲液替代一抗进行孵育. 主要观察指标:?各组大鼠前角运动神经元存活 率.?各组大鼠还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸阳性神经 元数目.?各组大鼠前角运动神经元N一甲基一D一天冬 氨酸受体亚单位表达密度. 统计学分析:数据以?s表示,由第一作者采用 SPSS10.0统计软件t检验进行相差显着性分析. 2结果 2.1实验动物数量分析参加实验25只大鼠,均进 入结果分析,中途无脱落. 2.2各组大鼠还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸染色神经 元数目伤后7d,术侧前角开始出现着色神经元,随 损伤时间的延长阳性细胞数量增加,至伤后28d阳性 细胞数量开始回落.于7,14,21,28d不同时间点,阳 性细胞分别占存活细胞总数的6%,40%,62%和41%. 神经元着色密度随损伤时间不同而变化,早期着色 淡见于胞体,术后21d着色重并可见神经突起明显 着色. 2.3各组大鼠前角运动神经元存活率中性红复染切 片可见损伤早期前角运动神经元胞体肿胀,胞核偏 位,随之出现细胞崩解并伴有活跃的胶质细胞反应. 随着存活时间的延长,术侧前角运动神经元呈现进行 49 性死亡.于术后3,7,14,21,28d不同时间点,术侧前 角运动神经元存活率分别为对侧细胞总数的96%, 85%,50%,35%和20%. 2.4各组大鼠前角运动神经元,N一甲基一D一天冬氨酸 受体亚单位表达未损伤侧前角可见N一甲基一D一天冬 氨酸1型受体和2型受体亚单位A,B免疫反应阳性 神经元,其中1型和2型A受体密度低,而2型B受 体密度较高,着色颗粒均匀分布于胞浆中.前根撕脱导 致术侧前角运动神经元1型和2型B受体亚单位表 达变化,其中1型受体密度显着下降,2型B受体密度 明显增高,而2型A受体密度于损伤前后无明显变化. 见表1. 表1各组大鼠前角运动神经元N一甲基一D一天冬氨酸受体免疫阳性神 经元平均吸光度(,n=5) 与对照侧比较,々=2.04,P<O.05;bt=5.16,P<O.Ol 3讨论 脊神经前根撕脱是一种严重的周围神经损伤形 式,这种根陛撕脱伤使轴索与神经元胞体近距离断开, 导致前角运动神经元较早的出现溃变与死亡.许多实 验报道了前根撕脱伤对支配上,下肢运动神经元的影 响,但就支配盆底肌运动神经元的相关报道尚少.大鼠 盆底肌运动神经元位于,s脊髓前角的背外侧核和 腹内侧核,与人类onuf核为同源核群[31.有报道指出, onuf核运动神经元与支配上,下肢的运动神经元之间 存在较大区别,如其兼有躯体运动和内脏运动双重性 质;在肌萎缩侧索硬化症病变过程中保持相对不易感 性;正常表达P75和生长相关蛋白43等【4,.本实验结 果显示,前根撕脱伤后盆底肌运动神经元的存活率与 上,下肢运动神经元比较无明显区别. 采用还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸组织化学染色证 实,前根撕脱伤诱导一氧化氮合酶在盆底肌运动神经 元的表达.术后7d出现一氧化氮合酶阳性神经元, 21d阳性神经元数量及着色密度达最高值,至术后 28d阳性细胞数量及着色密度值减低.这种一氧化氮 合酶阳性神经元的表达变化与前角运动神经元进行性 死亡的过程基本一致.提示,一氧化氮在受损前角运动 神经元的溃变过程中扮演重要角色.有报道指出,一氧 化氮介导谷氨酸兴奋毒性作用,谷氨酸与N一甲基一D一 天冬氨酸受体结合,触发了阳离子通道的开放,钙离子 通过N一甲基一D一天冬氨酸受体通道进入细胞内,与钙 调蛋白结合刺激一氧化氮合酶的活性,产生一氧化氮. 如果谷氨酸刺激过度,则释放的一氧化氮导致神经元 的死亡[sl. ISSN1671-5926CN21—1470/R啦中国临床康复2005年917目箜!鲞笙塑塑 N一甲基,D一天冬氨酸受体属配体门控的离子通 道,是由1型和2型不同受体亚单位组成的异聚体, 对钙离子有高通透性.1型受体为功能亚单位,2型受 体是调节亚单位,又分为A,B,c和D四种,不同2型 受体亚单位的参与使N一甲基一D一天冬氨酸受体具有 不同的电生理学和药理学特性.采用免疫组织化学 技术证实,盆底肌运动神经元存在1型和2型A,B三 种亚单位的表达,其中2型B亚单位密度最高.k,sz 脊神经前根撕脱伤,导致盆底肌运动神经元N一甲 基一D一天冬氨酸受体亚单位的表达变化,1型受体亚 单位明显减少,2型B受体亚单位显着增高,而2型A 受体亚单位保持不变.这种改变使得1型和2型B受 体亚单位在N一甲基-D-天冬氨酸受体异聚体中所占比 例发生变动,从而使整个受体的活性发生改变,形成一 个新的特性不同的受体,至于新受体的功能意义尚待进 一 步证实. 4参考文献 1ChinCH,ChewKC.Lumbosacralnerverootavulsion.u1997;28(9-10) 674—8 MoschinaG.SongS,ChakeraT.Post—traumaticlumbarnerverootavulsion. Austr01asRadiol2o0l;45(3):28l—4 SchroderHD.0rganizationoftheRlotoneuron8innervatingthepelvic//lus— clesofthemalerat.JCompNeurol1980;192(3):567—87 OkamotoK.HiraiS,lshiguroK,eto1.Ushtandelectronmicroscopicand immunohistochemicalobservationsoftheOnufsnucleusofamyotrophiclat— eralselerosisctaNeuropathol征rO1991;81(6):6l0.-4 HoangTX.NietoJH.TillakarameNJ,etdf.Autonomicandmotorneuron deathisprogressiveandparallelinalu~mlventralrootavulsion modelofcaudaequinai.jury.JCompNeurol2003;467(41:477—86 WuW.Expressionofnitric.oxidesynthaseOs1ininjuredCNSneul-oosas shownbvNADPHdiaphorasehistochemistry.ExpNeurol1993;120(2):153—9 KoliatsosVE.PriceWLPardoCA.etdf.Ventralrootavulsion:anexperi. mentalmodelofdeathofaduhmotorneurons.JCompNeurol1994;342(1): 35—44 Niebroj—Dobosz1.JanikP.Aminoacidsactingastransmittersinamyotroph. iclateralsclerosisfAtS)etaNeurolScand1999;100(1):6一ll DingledineR,BorgesK,BowieD,etdf.Thedutamatereceptorionchan— nels.PharmacolReu1999;5l(11:7—6l 中国临床康复第9卷第打期2005—09—07出版 ChineseJournalofClinicalRehabilitation,September72005Vo1.9No.33 欧洲越桔和笃斯越桔对神经细胞氧化损伤的保护作用? 陶欣艺,卢艳花,周文瑜,魏东芝 ? 基础研究? 华东理工大学生物工程学院生物反应器国家重点实验室,上海市 200237 陶欣艺?,女,1976年生,江苏省盐城市人,汉族,2004年南京中医药 大学毕业,硕士,主要从事药理学研究工作. TaoxyO66@126.com 中图分类号:R745文献标识码:A文章编号:1671-5962-(2005)33-0050q)3 收稿Et期:2005q)5—26修回Et期:2005—07~)8(04/SN/YQ) ProtectiveeffectsofVacciniUlnmyrtillusL.andVacciniunl uliginosumL.onoxidativedamageinneuralcelisTaoXin—yiLu Yan.hua.ZhouWen—Vu.WeiDong—zhi,NationalKeyLaboratoryofBiore— actor,InstituteofBiologicalEngineering,EastChinaUnivemityofScience andTechnology,Shanghai200237,China TaoXin—yi?.Master.NationalKeyLaboratoryofBioreactor,Instituteof BiologicalEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology, Shane_,hai200237.ChinaTaoxy066@l26.com Received:2005—05—26Accepted:2o05—07—08 Abstract AIM:TocomparetheprotectiveeffectofVacciniummyrtillusL.andVac— ciniumuliginosumL.onPC12cellsdamageinducedbyoxidativestress, andobservetheeffectwithdose—dependentorwithoutdose—dependent. METHODS:TheexperimentwasdoneintheNationalKeyLaboratoryof Bioreactor,InstituteofBiologicalEngineering,EastChinaUniversityof ScienceandTechnologyfromOctober2004toJanuary2005.ThePC12 cellswerepre.incubatedintheDMEMmediumofthe12.5.25.5Oms& standardextractofVacciniummyrtillusL.andVacciniumuliginosumL. f0r8hours,andintervenedfor12hourswith500~Lmol/LH202asthein— uredmodelinducedbyoxidativestress.Thedeadinhibitiverateofcells wascalculatedwiththeMTFchromatometrytoevaluatethelivingcondi— tionofcells(thehighertheinhibitiveratewas,themorethelivingcells had).Theinhibitiverateofintracellularreactiveoxygenspecies(ROS)was assessedwithDCFH??DAfluorescentstainingtoassessthelevelofintracel?? lularactiveoxide(thelowertheinhibitiveratewas,thelowerthelevelof intracellularactiveoxidewas).Thenuclearmorphologywasobservedwith Hoechststaining.Theapoptosiswasdetectedwiththeflowcytometer. RESULTS:(Celldeadinhibitiverate:Itwashigherinthe25.5Omg/L standardextractofVacciniumuliginosumL.groupthanthatinthe25.5O mg,LstandardextractofVacciniummyrtillusL.group(27.78%.23.66%: 46.O5%.4I.67%),andthebiggerthedosageofthetwokindsofdrugwas, thehie-,hertheinhibitiveratewas.(2)Cleaninginhibitiverateofactiveox. ideinPC12cells:Itwaslowerinthe25.5Omg/Lstandardextractof VaeciniumuliginosumL.groupthanthatinthe25.5Oraw’Lstandardex. tractofVacciniummyrtillusL.(67.58%.8O.6l%;41.86%,56.69%), andthebiggerthedosagewas.thelowertheinhibitiveratewas.?Apop— tosisrate:ItwasO.69%inthenormalcontrolgroup.andafter12hoursac— tionof500~mol/LH202itwas30.19%.Afterthedisposalofstandardex— tractofVactiniummyrtillusL.andVacciniumuliginosumL..jtwas 9.45%.8.82%,respectively. C0NCLUS10N:TheVacciniummyrtillusL.andVacciniumuliginosum L.haveprotectiveeffectsonthePC12cellsdamageinducedbyoxidative stress.andtheeffect0fVacciniumuliginosumL.isbetterthanthatofthe VacciniummyrtillusL.,andwithdose—dependenteffects.Themechanism mayhaverelationwithitsdecreasethelevelofactiveoxideincellssoas toinhibittheneuralapoptosis. TaoXY,ku”il1.ZhouWY,WeiDZ.ProtectiveeffectsofVacciniummyrtillusLland Vacciniumuliginosumk.onoxidolivedamageinneuralcells.ZhongguoLinchuang Kan~u2005;9(331:50-2(Chinal 陶欣艺,卢艳花,周文瑜,魏东芝.欧洲越桔和笃斯越桔对神经细胞氧化损伤的保 护作用U1.中国临床康复,2005,9(33):50-21www.zglcki.com1. 摘要 目的:比较欧洲越桔和笃斯越桔对氧化应激损伤Pcl2细胞的保护作 用,并观察其作用是否具有剂量依赖性. 方法:实验于2004-10,2005-01在华东理工大学生物工程学院生物反应 器国家重点实验室进行.Pcl2细胞以含l2.5,25,50mg/L的欧洲越桔 标准提取物和笃斯越桔标准提取物的DMEM培养液预孵8h后,以 500mol/L的H202干预12h作为氧化应激损伤的模型,采用MTT比 色法计算细胞死亡抑制率评估细胞存活情况(抑制率越高,存活细胞越 多),DCFH—DA荧光染色法测定细胞内活性氧化物清除抑制率评估细 胞内活性氧化物水平(抑制率越低,细胞内活性氧化物水平越低), Hoechst染色法观察细胞核形态学,流式细胞仪检测细胞凋亡. 结果:?细胞死亡抑制率:笃斯越桔标准提取物25,50mg/L组高于欧 洲越桔标准提取物25,50mg/L组(27.78%,23.66%;46.05%, 41.67%),两种药物均为剂量越大,其抑制率越高.?Pcl2细胞内活性 氧化物清除抑制率:笃斯越桔标准提取物25,50mg/L组低于欧洲越桔 标准提取物25,50mg/L组(67.58%,80.61%;41.86%,56.69%),且 剂量越大,其抑制率越低.?细胞凋亡率:正常对照组为0.69%, 500I.tmol/LH202作用12h后.为30.19%.预先给予欧洲越桔标准提 取物和笃斯越桔标准提取物处理后,分别为9.45%,8.82%. 结论:欧洲越桔和笃斯越桔对氧化应激损伤PC12细胞均具有保护作 用,笃斯越桔作用优于欧洲越桔,且具有剂量依赖性效应.其机制可能 23456789